Summary
हम कवक endoglucanase में गतिविधि के लिए स्क्रीन के लिए एक कम लागत, उच्च throughput के विधि का वर्णन
Protocol
1. स्क्रीनिंग थाली तैयारी
- 25g लेग विकास मध्यम, 15g अगर, और 1.5g Carboxymethyl सेलूलोज़ (सीएमसी) 1L आसुत जल सब्सट्रेट, और बाँझ आटोक्लेव जोड़ें.
- Autoclaving के बाद, शांत करने के लिए और उचित एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने के लिए मध्यम अनुमति है, और 100μM की अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG.
- 200ml मध्यम 5 विशाल वर्गाकार पेट्री डिश / bioassay ट्रे (240 x 240 x 20mm या बड़ा) में प्रत्येक डालो. प्लेटें पूरी तरह शुष्क करने की अनुमति दें.
2. Endoglucanase पुस्तकालय पीढ़ी और स्क्रीन
- Endoglucanase उत्प्रेरक डोमेन (ओं) के एक पुस्तकालय उत्पन्न करता है. यह कई मायनों में पूरा किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, साइट का निर्देशन या यादृच्छिक mutagenesis, पुनर्संयोजन, आदि) और शोधकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाता है.
- एक ऐसी है कि वे लाख ऑपरेटर के साथ T7 प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन हैं सदिश में पुस्तकालय क्लोन, और periplasm को लक्षित करने के लिए एक pelB संकेत अनुक्रम होते हैं. एक उपयुक्त वेक्टर के एक उदाहरण से pET22b Novagen (+) है.
- ई. में endoglucanase पुस्तकालय रूपांतरण कोलाई BL21 (DE3) और एकल कालोनियों के लिए थाली तनाव.
- परिवर्तन 37 रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- बाँझ toothpicks का प्रयोग, 96 गहरे अच्छी तरह से अच्छी तरह से 400μL लेग उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक मध्यम युक्त प्लेटों में क्लोन टीका लगाना. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस 250 rpm पर झटकों के साथ रातोंरात.
- 96 अच्छी तरह से रातोंरात संस्कृतियों के लिए लंबी अवधि के भंडारण के लिए 10% के अंतिम -80 में ° एकाग्रता सी. बाँझ ग्लिसरॉल जोड़ें यह मास्टर प्लेट जाएगा.
- एक 96 - पिन स्टांप का प्रयोग, स्क्रीनिंग IPTG और सीएमसी युक्त प्लेटों पर थाली रातोंरात संस्कृतियों को दोहराने. रातोंरात संस्कृतियों के 5 सेट अप करने के लिए प्रत्येक स्क्रीनिंग की थाली पर मुहर लगी जा सकता है.
- स्क्रीनिंग प्लेटें ताकि पहचान और प्रत्येक 96 में अच्छी तरह से थाली के अभिविन्यास में जाना जाता है लेबल.
- कमरे के तापमान (17-25 डिग्री सेल्सियस) रातोंरात या जब तक दिखाई कालोनियों का गठन किया है पर मुहर लगी पुस्तकालयों सेते हैं.
- आसुत जल के साथ थाली कुल्ला जब तक कालोनियों के सभी निशान को हटा रहे हैं.
- धोया थाली पर डालो कांगो लाल (पानी में 0.5% सीआर). बस सीआर पर्याप्त जोड़ने के लिए थाली को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं. सीआर ऊष्मायन के लिए 15 मिनट से अधिक मत करो. अब ऊष्मायन बार कम अलग halos में परिणाम होगा.
- सीआर बंद डालो और 1M NaCl के एक उदार राशि (अधिक से अधिक के लिए थाली कवर पर्याप्त) जोड़ने.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट सेते हैं.
- बंद NaCl डालो सीएमसी गिरावट halos प्रकट. Halos के बेहतर संकल्प के लिए, NaCl या एकाधिक NaCl washes के साथ लंबी ऊष्मायन बार आवश्यक हो सकता है.
- एक बाँझ दंर्तखोदनी का प्रयोग, मास्टर थाली से आगे लक्षण वर्णन के लिए सक्रिय एंजाइमों क्लोन लेने.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
इस उच्च throughput स्क्रीन के लिए readout का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया गया है. क्लोन निष्क्रिय, दुर्बलता से सक्रिय है, और अत्यधिक सक्रिय गिरावट क्षेत्रों के आकार के आधार पर के रूप में पहचाना जा सकता है है. यह विशेष रूप से उपयोगी है यदि ज्ञात गतिविधि के एक एंजाइम एक संदर्भ के रूप में पुस्तकालय में शामिल है. जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, सक्रिय एंजाइमों की पहचान मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. हालांकि, कृपया ध्यान रखें कि स्क्रीनिंग प्लेटों के पर्याप्त लेबलिंग अत्यंत महत्वपूर्ण है. शोधकर्ता कालोनियों को दूर धोने के बाद सक्रिय वेरिएंट की पहचान करने के लिए, क्रम में उन्हें गुरु ° आगे लक्षण वर्णन के लिए सी -80 पर संग्रहीत की थाली से लेने में सक्षम होना चाहिए. अंत में, यह मुश्किल है एक प्राथमिकताओं कृत्रिम बनाम प्राकृतिक substrates पर गतिविधियों के बीच संबंध का आकलन है. इसलिए, अनुसंधानकर्ता प्रोटीन फिटनेस निर्धारित करने के लिए औद्योगिक रूप से प्रासंगिक सामग्री पर सभी सकारात्मक क्लोन का परीक्षण करना चाहिए.
चित्रा 1 स्क्रीनिंग प्रक्रिया के योजनाबद्ध रूपरेखा. कक्ष एक endoglucanase पुस्तकालय के साथ बदल रहे हैं और एकल कालोनियों के लिए चुनिंदा मढ़वाया. क्लोन उठाया और बड़े हो रातोंरात -80 (1) पर भंडारण डिग्री सेल्सियस और (2) सीएमसी और IPTG युक्त endoglucanase अभिव्यक्ति प्रेरित प्लेटों पर प्रतिकृति चढ़ाना के लिए 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह से गहरी प्लेट में. सक्रिय क्लोन मास्टर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत की थाली से उठाया जाता है
चित्रा 2 क्लोनिंग और ई. में कवक उत्प्रेरक डोमेन की अभिव्यक्ति. कोलाई. (ए) Endoglucanase अभिव्यक्ति वेक्टर. जीन T7 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत (+) pET22b (Novagen) में क्लोन किया गया. (बी) राइट पैनल: endoglucanase व्यक्त BL21 कालोनियों (DE3). वाम पैनल: धोने और कांगो लाल के साथ विकास के बाद सीएमसी गिरावट halos.
चित्रा 3. / सीएमसी कांगो लाल स्क्रीन से नमूना परिणाम है. धोने और कांगो लाल विकास के बाद स्क्रीनिंग प्लेटों के लिया चित्र है. एस पर सभी कालोनियोंcreening प्लेटें समान आकार के थे.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित न्यूनतम हेरफेर के साथ तेजी से और उच्च सक्रिय एंजाइमों के throughput पहचान सक्षम बनाता है. गतिविधि का पता लगाने काफी संवेदनशील है, और गुणात्मक कक्ष के भीतर गतिविधि की राशि को दर्शाता है. प्रयोग के अपने आसानी इस विधि एंजाइम पुस्तकालयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त, केवल ई. में कार्यात्मक अभिव्यक्ति के द्वारा सीमित है बनाता है कोलाई. इसके अलावा, इस प्रकार की गतिविधि स्क्रीनिंग कवक cellulases के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन किसी भी endoglucanase गतिविधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, या किसी भी cellulase गतिविधि जिसके लिए वहाँ एक घुलनशील सब्सट्रेट (सीएमसी) की तरह है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन, द्वारा और / UNCF मर्क विज्ञान पहल द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Congo Red | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
References
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
