Summary
我们描述了一种低成本，高通量方法真菌内切葡聚糖酶的活性在屏幕
Abstract
纤维素酶（endoglucanases，cellobiohydrolases，和β-葡萄糖苷酶）水解成组成糖的纤维素，这反过来又可以转换成燃料醇 1 。酶解纤维素生物质来提供可再生能源的潜力，加紧努力，以工程师为经济的燃料生产 2纤维素酶。特别感兴趣的是真菌纤维素酶 3-8，目前已经被用于食品和纺织品加工工业。
确定之间的突变纤维素库积极变种，工程过程是至关重要的;积极的突变体，可进一步测试，性能改进和/或遭受额外的突变。真菌纤维素酶的高效的工程已经阻碍了原生生物体的遗传工具的缺乏和难以表达的酶在异源主机。近日，森川和他的同事开发出一种在大肠杆菌中的表达方法H. jecorina 3,9，一个重要的工业真菌的能力，分泌大量的纤维素endoglucanases大肠杆菌的催化结构域。功能性大肠杆菌中的表达，也为其他真菌的纤维素酶， 包括Macrophomina phaseolina 10 和黄孢原 毛平革 11-12报告。
我们目前在大肠杆菌中的真菌内切葡聚糖酶的活性高通量筛选的方法大肠杆菌 。 （ 图1）此方法使用的常见的微生物染料刚果红（CR），以可视化的羧甲基纤维素（CMC）的固体培养基上生长的细胞的酶降解。酶活性测定需要廉价的试剂，最小操纵，退化区，在殖民地网站（“光环”），并给出明确的结果。虽然酶活性的定量测量，不能用这种方法确定的，我们发现，光环的大小总在细胞内的酶的活性相关。个别阳性克隆进一步鉴定，确定，相对蛋白健身。
CMC / CR传统的细菌全细胞活性测定13涉及泼在琼脂含有CMC的殖民地，这是受交叉污染，或在CMC琼脂井，这是不适合进行大规模的试验培育文化。在这里，我们报告的改进协议，修改现有14纤维素酶洗方法：CMC琼脂平板上生长的CR染色前去除。我们的协议大大降低了交叉污染和高度的可扩展性，使成千上万的克隆快速筛选。除了到 H jecorina酶 ，我们都表示并筛选的嗜热子囊菌斜卧青霉 （ 如图2所示）内切葡聚糖酶变种，这表明本议定书适用范围从一个生物体的酶。
Protocol
1。筛选板的制备
- 新增25G的LB生长介质，15G琼脂培养基，并1.5克羧甲基纤维素（CMC）基板1L蒸馏水，高压灭菌消毒。
- 高压灭菌后，允许中等降温，并添加适当的抗生素，IPTG至终浓度为100μm。
- 倒入200ML中型每到5个大型广场培养皿/生物测定托盘（240 × 240 × 20mm或更大）。允许完全干燥板。
2。内切葡聚糖酶库的生成和屏幕
- 生成的内切葡聚糖酶催化结构域（S）库。这可以在许多方面完成（例如，现场指导或随机突变，重组等），并确定由研究员。
- 克隆到一个矢量库等，他们lac操纵子的T7启动子的控制下，并包含一个规划环境地政局针对周质的信号序列。一个例子是一个合适的载体pET22b（+），自Novagen。
- 转化到大肠杆菌的内切葡聚糖酶库大肠杆菌菌株BL21（DE3）和板单菌落。
- 一夜之间改造在37 ° C。
- 用无菌牙签，接种到96孔深以及含有400μLLB培养基辅以适当的抗生素板块的克隆。在37 ° C晃动在250转过夜。
- 添加无菌甘油96过夜培养终浓度为10％，长期储存在-80 ° C。这将是主盘。
- 使用一个96针戳，复制到筛选含有IPTG和CMC板的板过夜培养。可以加盖到每个筛选板5套过夜培养。
- 标签的筛选，使每96孔板的身份和方向是已知的板。
- 孵育加盖库，在室温（17-25℃）过夜，或直至可见菌落形成。
- 用蒸馏水冲洗板被删除，直到所有的殖民地的痕迹。
- 倒入刚果红（CR;在水中的0.5％），到洗净板。确保只添加足够的CR到覆盖板。
- 在室温下孵育15分钟。不要超过15分钟为CR孵化。潜伏期较长时间，会导致更少的独特的光晕。
- 倒入CR和1M氯化钠添加大方量（足够多的覆盖板）。
- 在室温下孵育15分钟。
- 倒掉氯化钠揭示CMC退化光环。对于更好地解决的光晕，与NaCl或多个氯化钠洗涤潜伏期较长时间，可能是必需的。
- 使用无菌牙签从主控板，挑克隆活性酶，为进一步鉴定。
3。代表性的成果：
这种高通量筛选的读数的一个例子是如图3所示。克隆可以被认定为无效，弱活跃，和退化区的大小高度活跃。这是特别有用的，如果是作为一个参考图书馆包括已知的活性酶。如上所示，活性酶的鉴定，是强大的和可重复性。然而，请注意甄别板足够的标签是非常重要的。研究人员必须能够识别洗涤后殖民地，积极的变种，为了来接他们从保存于-80 ° C的进一步鉴定的主控板。最后，它是难以估量的先验人工VS自然基板的活动之间的关系。因此，研究人员必须在工业有关的材料，以确定蛋白质的健身所有测试阳性克隆。
图1。甄别程序的示意图纲要。细胞转化与一个内切葡聚糖酶库和选择性接种单菌落。克隆回升和增长在96孔板以及深过夜（1）储存于-80 ° C（2）副本含有CMC和IPTG诱导内切葡聚糖酶的表达板电镀。主动克隆采摘储存在-80 ° C主控板
图2真菌催化结构域在大肠杆菌中克隆和表达。 大肠杆菌 。 （一）内切葡聚糖酶表达载体。基因分别克隆到pET22b（+）（Novagen公司）T7启动子的控制之下。 （二）右图：内切葡聚糖酶表达大肠杆菌BL21（DE3）菌落。左面板：洗涤后的发展与刚果红CMC退化光环。
图3。CMC /刚果红屏的样品结果。筛选板，洗涤后与刚果红发展的合影留念。 S上所有殖民地creening板类似规模。
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Discussion
这里所描述的协议，允许快速和高活性酶的吞吐量鉴定，用最少的操作。活动检测是相当敏感，定性地反映细胞内的活动量。它的易用性使得这种方法适合广泛的酶库，只能通过在大肠杆菌中表达功能的限制大肠杆菌 。此外，这种筛查活动并不限于真菌纤维素酶，但可适应任何内切葡聚糖酶的活性，或任何纤维素酶是一种可溶性底物（如CMC）。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由戈登和贝蒂摩尔基金会，由UNCF /默克科学倡议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Congo Red | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
References
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
