Summary
وصفنا منخفضة التكلفة ، وأسلوب إنتاجية عالية للكشف عن النشاط endoglucanase الفطرية في
Abstract
الانزيمات سلولاز (endoglucanases ، cellobiohydrolases وglucosidases β) يتحلل السيليلوز إلى سكريات عنصر ، والتي بدورها يمكن تحويلها إلى وقود الكحول 1. كثفت احتمالات الإنزيمية من الكتلة الحيوية السليلوزية لتوفير الطاقة المتجددة الجهود الرامية إلى مهندس السليلوزات اقتصادية لإنتاج وقود 2. ذات أهمية خاصة هي السليلوزات 3-8 الفطرية ، والتي هي بالفعل قيد الاستخدام الصناعي للأغذية وتجهيز المنسوجات.
تحديد المتغيرات النشطة بين مكتبة السليلوزات متحولة أمر بالغ الأهمية في عملية الهندسة ، ويمكن اختبار المزيد من المسوخ نشطة لتحسين خصائص و / أو تعرضوا لالطفرات إضافية. وقد أعاق الهندسة كفاءة السليلوزات الفطرية بسبب نقص الأدوات الوراثية للكائنات الحية المحلية والصعوبات في التعبير عن الانزيمات في يستضيف مغاير. في الآونة الأخيرة ، وضعت موريكاوا وزملاء العمل وسيلة للتعبير في E. القولونية المجالات الحفاز endoglucanases من jecorina H. 3،9 ، وهو فطر الصناعية المهمة التي لديها القدرة على إفراز السليلوزات بكميات كبيرة. وظيفية E. كما تم الإبلاغ عن التعبير القولونية السليلوزات من الفطريات الأخرى ، بما في ذلك Macrophomina phaseolina 10 و Phanerochaete ذهبية الأبواغ 11-12.
نقدم طريقة لفحص إنتاجية عالية من النشاط endoglucanase الفطرية في E. القولونية. (الشكل رقم 1) يستخدم هذا الأسلوب المشترك الميكروبية صبغ أحمر الكونغو (CR) لتصور تدهور الأنزيمية من السليلوز carboxymethyl (CMC) التي تنمو على الخلايا المتوسطة الصلبة. ويتطلب فحص النشاط الكواشف غير مكلفة ، والتلاعب الحد الأدنى ، ويعطي نتائج لا لبس فيها كمناطق التدهور ("هالات") في موقع مستعمرة. على الرغم من عدم تدبير كمية من النشاط الأنزيمي يحددها هذا الأسلوب ، وجدنا أن حجم الهالة يرتبط النشاط الأنزيمي الكلي في الخلية. وتوصيف مزيد من الحيوانات المستنسخة إيجابية تحديد الفرد ، نسبة البروتين للياقة البدنية.
البكتيرية كله نشاط الخلية المقايسات التقليدية CMC / 13 CR تنطوي صب CMC آغار تحتوي على المستعمرات ، والتي هي عرضة للتلوث العرضي ، أو الثقافات تفرخ في الآبار آغار اللجنة العسكرية المركزية ، التي هي أقل قابلية لتجارب على نطاق واسع. نحن هنا التقرير تحسن وضع بروتوكول بتعديل أساليب غسل القائمة 14 لنشاط سلولاز : تتم إزالة الخلايا المزروعة في أطباق أجار CMC قبل CR تلطيخ. بروتوكول لدينا يقلل بشكل ملحوظ عبر تلوث وتدرجية عالية ، والسماح للفحص السريع للآلاف من الحيوانات المستنسخة. بالإضافة إلى H. الانزيمات jecorina ، أعربنا عن وفرزهم من المتغيرات endoglucanase aurantiacus Thermoascus والبنسليوم decumbens (كما هو موضح في الشكل 2) ، مما يوحي بأن هذا البروتوكول تنطبق على انزيمات من مجموعة من الكائنات الحية.
Protocol
1. فحص لوحة إعداد
- إضافة 25G متوسط النمو LB ، أغار 15G ، و1.5G carboxymethyl السليلوز (CMC) الركيزة إلى الماء المقطر 1L ، وتعقيم لتعقيم.
- بعد التعقيم ، والسماح لتبرد والمتوسطة إضافة المضادات الحيوية المناسبة ، وإلى تركيز IPTG النهائي 100μM.
- صب 200mL المتوسطة في كل كبيرة 5 أطباق بتري مربعا / صواني الأحيائي (240 × 240 × 20mm أو أكبر). السماح لوحات لتجف تماما.
2. مكتبة الجيل Endoglucanase والشاشة
- إنشاء مكتبة الملك endoglucanase الحفاز (ق). ويمكن تحقيق ذلك بطرق عديدة (على سبيل المثال ، موقع الموجه أو الطفرات العشوائية ، إعادة التركيب ، وغيرها) ويتم تحديد من قبل الباحث.
- استنساخ المكتبة الى ناقلات بحيث يكونون تحت سيطرة المروج T7 مع مشغل لبن ، وتحتوي على تسلسل pelB إشارة لاستهداف لالجبلة المحيطية. مثال على ناقل غير مناسبة pET22b (+) من Novagen.
- تحويل الى المكتبة endoglucanase E. القولونية BL21 سلالة (DE3) وطبق على المستعمرات واحد.
- بين عشية وضحاها تحول احتضان عند 37 درجة مئوية.
- استخدام المسواك عقيمة ، تلقيح الحيوانات المستنسخة في 96 بئر عميقة لوحات تحتوي على رفاه 400μL المتوسطة LB تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
- إضافة إلى 96 الجلسرين العقيمة الثقافات بين عشية وضحاها أيضا إلى التركيز النهائي من 10 ٪ على المدى الطويل في تخزين -80 درجة مئوية. وسوف يكون هذا الطبق الرئيسي.
- استخدام الطوابع 96 - دبوس ، وتكرار لوحة الثقافات بين عشية وضحاها على لوحات تحتوي على الفرز IPTG واللجنة العسكرية المركزية. يمكن أن تكون مختومة تصل إلى 5 مجموعات من الثقافات بين عشية وضحاها على كل لوحة الفرز.
- لوحات التسمية الفرز بحيث يعرف هوية واتجاه كل لوحة 96 أيضا.
- احتضان المكتبات ختمها في درجة حرارة الغرفة (17-25 درجة مئوية) بين عشية وضحاها أو حتى المستعمرات مرئية لا أساس لها.
- لوحة شطف مع الماء المقطر حتى يتم إزالة جميع آثار المستعمرات.
- صب الكونغو الأحمر (CR ؛ 0.5 ٪ في الماء) على لوحة غسلها. تأكد من إضافة ما يكفي لتغطية CR اللوحة.
- احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تتجاوز 15 دقائق للحضانة CR. وسوف أوقات أطول في الحضانة نتيجة هالات أقل وضوحا.
- تخلصي CR وإضافة كمية سخية (أكثر من كافية لتغطية لوحة) من كلوريد الصوديوم 1M.
- احتضان 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تخلصي كلوريد الصوديوم للكشف عن تدهور هالات CMC. لأفضل حل للهالات ، قد تكون هناك حاجة أوقات أطول مع حضانة يغسل كلوريد الصوديوم كلوريد الصوديوم أو متعددة.
- استخدام المسواك العقيمة ، واختيار الانزيمات النشطة من الحيوانات المستنسخة لوحة رئيسية لمزيد من توصيف.
3. ممثل النتائج :
ويرد مثال على هذه الشاشة لقراءة إنتاجية عالية في الشكل 3. يمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة ونشط نشاطا ضعيفا ، ونشطة للغاية تستند على حجم المناطق التدهور. هذا مفيد خصوصا إذا تم تضمين انزيم يعرف من النشاط في المكتبة كمرجع. كما هو موضح هنا ، وتحديد من الانزيمات النشطة قوية وقابلة للتكرار. ومع ذلك ، نرجو أن تدرك أن وضع العلامات الكافية لوحات الفحص مهم للغاية. يجب على الباحث أن يكون قادرا على تحديد المتغيرات النشطة ، بعد غسل المستعمرات بعيدا ، من أجل اعتقالهما من لوحة رئيسية في تخزين -80 درجة مئوية لتوصيف آخر. وأخيرا ، فإنه من الصعب تقييم مسبق للعلاقة بين الأنشطة على ركائز الاصطناعي مقابل الطبيعية. لذا ، يجب على الباحث اختبار جميع الحيوانات المستنسخة إيجابي على المواد ذات الصلة صناعيا لتحديد اللياقة البدنية البروتين.
الشكل 1. مخطط تخطيطي لإجراء الفحص. يتم تحويل الخلايا التي تحتوي على مكتبة endoglucanase ومطلي بشكل انتقائي للمستعمرات واحد. استنساخ التقطت ونمت بين عشية وضحاها في لوحات 96 بئر عميقة جيدا ل(1) التخزين في -80 درجة مئوية و (2) طبق الطلاء على لوحات تحتوي على اللجنة العسكرية المركزية وIPTG للحث على التعبير endoglucanase. يتم انتقاؤها من الحيوانات المستنسخة نشطة لوحة رئيسية في تخزين -80 درجة مئوية.
الشكل 2. الاستنساخ والتعبير من المجالات الحفاز الفطرية في E. القولونية. (A) Endoglucanase ناقلات التعبير. وكانت الجينات المستنسخة في pET22b (+) (Novagen) تحت سيطرة المروج T7. (ب) لوحة من اليمين : endoglucanase ، معربا عن BL21 (DE3) المستعمرات. اللوحة اليسرى : هالات تدهور CMC بعد الغسيل والتنمية مع الأحمر الكونغو.
الشكل 3. نتائج عينة من شاشة الأحمر CMC / الكونغو. الصور التي التقطت لوحات الفحص بعد الغسيل والكونغو التنمية الأحمر. جميع المستعمرات في لياليوكانت لوحات creening مشابهة من حيث الحجم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تحديد سرعة سريعة وعالية من الأنزيمات نشطة ، مع الحد الأدنى من التلاعب. الكشف عن نشاط حساس جدا ، ويعكس نوعيا كمية النشاط داخل الخلية. سهولة استخدامه يجعل هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من المكتبات الانزيم ، وقلة فقط من التعبير الوظيفي في E. القولونية. علاوة على ذلك ، لا يقتصر الفحص نشاط من هذا النوع لالسليلوزات الفطرية ، ولكن يمكن تكييفها لendoglucanase أي نشاط أو أي نشاط سلولاز التي توجد ركيزة للذوبان (مثل CMC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل غوردون وبيتي مور مؤسسة ، ومبادرة العلوم UNCF / ميرك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Congo Red | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
References
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
