Summary
Nós descrevemos um baixo custo, o método de alto rendimento para a tela para a atividade endoglucanase fúngicas em
Abstract
Celulase enzimas (endoglucanases, cellobiohydrolases e β-glicosidases) hidrolisar a celulose em açúcares componente, que por sua vez podem ser convertidos em álcoois combustíveis 1. O potencial para hidrólise enzimática da biomassa celulósica para fornecer energia renováveis tem se intensificado os esforços para engenheiro de celulases para 2 econômica de produção de combustíveis. De particular interesse são celulases fúngicas 08/03, que já estão sendo utilizados industrialmente para alimentos e processamento de têxteis.
Identificar variantes ativa entre uma biblioteca de celulases mutante é fundamental para o processo de engenharia; mutantes ativa ainda pode ser testado para propriedades melhoradas e / ou sujeitos a mutagênese adicionais. Engenharia eficiente de celulases fúngicas tem sido dificultada pela falta de ferramentas genéticas para os organismos nativos e pelas dificuldades em expressar as enzimas em hospedeiros heterólogos. Recentemente, Morikawa e colaboradores desenvolveram um método para expressar em E. coli os domínios catalíticos de endoglucanases de H. jecorina 3,9, um fungo industrial importante, com a capacidade de secretar celulases em grandes quantidades. Funcional E. expressão coli também foi relatada por celulases de fungos, incluindo Macrophomina phaseolina 10 e Phanerochaete chrysosporium 11-12.
Nós apresentamos um método para triagem de alto rendimento da atividade endoglucanase fúngicas em E. coli. (Fig. 1) Este método usa o comum microbiana corante Congo Red (CR) para visualizar a degradação enzimática da carboximetilcelulose (CMC) de células que crescem em meio sólido. O ensaio de atividade requer reagentes de baixo custo, a manipulação mínima, e dá resultados inequívocos como zonas de degradação ("halos") no local da colônia. Embora uma medida quantitativa da atividade enzimática não pode ser determinado por este método, nós descobrimos que o tamanho do halo se correlaciona com atividade enzimática total do celular. Uma melhor caracterização de cada um dos clones positivos irá determinar, fitness proteína relativa.
Tradicionais bacteriana toda célula ensaios CMC / CR 13 envolvem a atividade derramando CMC agar contendo em colônias, que está sujeita a contaminação cruzada, ou culturas incubadas em poços de agar CMC, que é menos passível de experimentação em larga escala. Aqui nós relatamos um protocolo melhorado que modifica métodos de lavagem existentes 14 para atividade da celulase: células cultivadas em placas de ágar CMC são removidos antes da coloração CR. Nosso protocolo reduz significativamente a contaminação cruzada e é altamente escalável, permitindo a avaliação rápida de milhares de clones. Além de H. enzimas jecorina, temos expressa e selecionados variantes endoglucanase do Thermoascus aurantiacus e decumbens Penicillium (mostrado na Figura 2), sugerindo que este protocolo é aplicável às enzimas a partir de uma variedade de organismos.
Protocol
1. Preparação placa de triagem
- Adicionar meio de crescimento 25g LB, ágar 15g e 1,5 g de carboximetil celulose substrato (CMC) em água destilada 1L, e autoclave para esterilizar.
- Após autoclavagem, permitir que o meio para esfriar e adicione os antibióticos apropriados, e IPTG para uma concentração final de 100μM.
- Despeje 200 ml cada médio em 5 grandes placas de Petri quadrado / bandejas bioensaio (240 x 240 x 20mm ou maior). Permitir que as placas para secar completamente.
2. Endoglucanase geração de biblioteca e tela
- Gerar uma biblioteca de domínio catalítico endoglucanase (s). Isso pode ser feito de várias maneiras (por exemplo, site direcionado ou mutagênese aleatória, recombinação, etc) e é determinada pelo pesquisador.
- Clone a biblioteca em um vetor tal que eles estão sob o controle do promotor T7 com o operador lac, e contém uma seqüência de sinais pelB para alcançar o alvo para o periplasma. Um exemplo de um vetor adequado é pET22b (+) de Novagen.
- Transformar a biblioteca em endoglucanase E. coli estirpe BL21 (DE3) e placa de colônias único.
- Incubar a transformação durante a noite a 37 ° C.
- Usando palitos de dente estéril, inocular clones em 96 placas de poço profundo bem-contendo meio LB suplementado com 400μL antibióticos apropriados. Incubar a 37 ° C durante a noite com agitação a 250 rpm.
- Adicionar glicerol esterilizado a 96 culturas bem durante a noite para uma concentração final de 10% para armazenamento de longo prazo a -80 ° C. Este será o prato principal.
- Usando um selo de 96 pinos, replicar culturas placa durante a noite sobre os pratos de triagem contendo IPTG e CMC. Até 5 conjuntos de culturas durante a noite pode ser estampada em cada placa de triagem.
- Rótulo as placas de triagem, para que a identidade ea orientação de cada placa de 96 poços é conhecido.
- Incubar as bibliotecas carimbada em temperatura ambiente (17-25 ° C) durante a noite ou até colônias visíveis ter se formado.
- Enxágüe a placa com água destilada até que todos os vestígios das colônias são removidos.
- Despeje Congo Red (CR, 0,5% em água) na placa de lavada. Certifique-se de adicionar apenas o suficiente para cobrir o CR prato.
- Incubar 15 minutos à temperatura ambiente. Não exceder 15 minutos para a incubação CR. Vezes mais tempo de incubação vai resultar em halos menos distintas.
- Deitar fora CR e adicionar uma quantidade generosa (mais do que suficiente para cobrir a placa) de 1M NaCl.
- Incubar 15 minutos à temperatura ambiente.
- Deitar fora NaCl para revelar halos de degradação do CMC. Para uma melhor resolução do halos, tempos de incubação mais longo com NaCl ou múltiplas lavagens NaCl pode ser necessária.
- Usando um palito de dente estéril, pick clones ativa enzimas da placa mestre para uma melhor caracterização.
3. Resultados representativos:
Um exemplo de leitura para esta tela de alto rendimento é mostrado na Figura 3. Clones podem ser identificados como inativos, pouco activos e altamente ativa com base no tamanho das zonas de degradação. Isto é especialmente útil se uma enzima de actividade conhecida é incluído na biblioteca como uma referência. Como mostrado aqui, a identificação de enzimas ativas é robusto e reprodutível. No entanto, esteja ciente de que a rotulagem adequada das placas de triagem é extremamente importante. O pesquisador deve ser capaz de identificar variantes ativa depois de lavar as colônias de distância, a fim de buscá-las a partir da placa mestre armazenadas a -80 ° C para uma melhor caracterização. Finalmente, é difícil avaliar a priori a relação entre as atividades em substratos artificiais vs natural. Portanto, o pesquisador deve testar todos os clones positivos em material industrialmente relevantes para determinar a aptidão de proteína.
Figura 1. Esboço esquemático do procedimento de triagem. Células são transformados com uma biblioteca de endoglucanase e banhado a seletiva para as colônias individuais. Clones pegou e cresceu durante a noite em 96 poço profundo bem para placas (1) de armazenamento a -80 ° C e (2) chapeamento réplica em placas contendo CMC e IPTG de induzir a expressão endoglucanase. Clones ativos são escolhidos a partir da placa mestre armazenadas a -80 ° C.
Figura 2. Clonagem e expressão de fungos domínios catalíticos em E. coli. (A) endoglucanase vetor de expressão. Genes foram clonados em pET22b (+) (Novagen) sob controle do promotor T7. (B) Painel direito: endoglucanase expressar-BL21 (DE3) colônias. Painel esquerdo: halos de degradação CMC após a lavagem e desenvolvimento com vermelho Congo.
Figura 3. Resultados da amostra de CMC / Congo tela Vermelho. Fotos tiradas de placas de triagem após a lavagem e desenvolvimento Congo Vermelho. Todas as colônias em screening placas eram de tamanho similar.
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Discussion
O protocolo aqui descrito permite a identificação rápida e alta taxa de transferência de enzimas ativas, com manipulação mínima. Detecção de atividade é bastante sensível, e qualitativamente reflete a quantidade de atividade dentro da célula. Sua facilidade de uso torna este método adequado para uma ampla gama de bibliotecas de enzima, limitado apenas pela expressão funcional em E. coli. Além disso, o rastreio deste tipo de atividade não se restringe a celulases fúngicas, mas pode ser adaptado para qualquer atividade endoglucanase, ou qualquer outra atividade celulase para o qual existe um substrato solúvel (como CMC).
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Gordon e Betty Moore Foundation e pela Iniciativa Ciência UNCF / Merck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Congo Red | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
References
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