Summary
Descriviamo un basso costo, metodo elevato throughput per lo screening per l'attività endoglucanase fungine in
Abstract
Cellulasi enzimi (endoglucanases, cellobiohydrolases e β-glucosidasi) idrolizzare cellulosa in zuccheri componente, che a sua volta può essere convertito in alcol carburante 1. Il potenziale per idrolisi enzimatica di biomasse cellulosiche per fornire energia rinnovabile ha intensificato gli sforzi per ingegnere cellulasi per 2 economiche di produzione di combustibile. Di particolare interesse sono cellulasi fungine 3-8, che sono già in uso industriale per i cibi e la lavorazione tessile.
Identificare varianti attivo tra una libreria di cellulasi mutante è fondamentale per il processo di progettazione; mutanti attivo può essere ulteriormente testato per migliorare le proprietà e / o sottoposti a mutagenesi aggiuntivi. Ingegneria efficiente delle cellulasi fungine è stata ostacolata dalla mancanza di strumenti genetici per gli organismi nativi e dalla difficoltà di esprimere gli enzimi in ospiti eterologhi. Recentemente, Morikawa e collaboratori sviluppato un metodo per esprimere in E. coli i domini catalitici di endoglucanases da H. jecorina 3,9, un fungo importante industriale con la capacità di secernere cellulasi in grandi quantità. Funzionale E. espressione coli è stato anche segnalato per la cellulasi da altri funghi, compresi Macrophomina phaseolina 10 e Phanerochaete chrysosporium 11-12.
Vi presentiamo un metodo per lo screening ad alto rendimento di attività endoglucanase fungine in E. coli. (Fig. 1) Questo metodo utilizza il comune microbica colorante Rosso Congo (CR) per visualizzare la degradazione enzimatica della carbossimetilcellulosa (CMC) di cellule in crescita su terreno solido. Il dosaggio attività richiede reagenti poco costosi, la manipolazione minima, e dà risultati inequivocabili come zone di degrado ("aloni") sul sito colonia. Anche se una misura quantitativa di attività enzimatica non può essere determinato con questo metodo, abbiamo trovato che le dimensioni alone si correla con l'attività enzimatica totale nella cella. Un'ulteriore caratterizzazione dei singoli cloni positivi determinerà, fitness relativa proteina.
Tradizionale batterica a cellule intere, CMC / CR saggi attività 13 coinvolgere versando CMC colonie su agar contenente, che è soggetto a contaminazione incrociata, o culture incubazione in pozzetti agar CMC, che è meno suscettibile di sperimentazione su larga scala. Qui riportiamo un protocollo che modifica migliorato i metodi esistenti lavare 14 per attività cellulasi: le cellule coltivate su piastre di agar CMC sono stati rimossi prima della colorazione CR. Il nostro protocollo riduce notevolmente la contaminazione crociata ed è altamente scalabile, permettendo un rapido screening di migliaia di cloni. Oltre ad H. enzimi jecorina, abbiamo espresso e proiettato varianti endoglucanase dal aurantiacus Thermoascus e Penicillium decumbens (Figura 2), suggerendo che questo protocollo è applicabile agli enzimi da una serie di organismi.
Protocol
1. Screening piastra preparazione
- Aggiungere 25g terreno di coltura LB, agar 15g, e 1,5 g carbossimetil cellulosa (CMC) substrato di 1L di acqua distillata, e autoclave per la sterilizzazione.
- Dopo la sterilizzazione in autoclave, permette raffreddare e aggiungere antibiotici appropriati, e IPTG ad una concentrazione finale di 100μM.
- Versare 200 mL in media ogni 5 piatti grandi Petri piazza / vassoi biologico (240 x 240 x 20mm o più grandi). Lasciare le piastre ad asciugare completamente.
2. Endoglucanase generazione biblioteca e schermo
- Generare una libreria di endoglucanase dominio catalitico (s). Questo può essere ottenuto in molti modi (ad esempio, sito-diretta o mutagenesi casuale, ricombinazione, ecc) ed è determinato dal ricercatore.
- Clonare la biblioteca in un vettore tale che essi sono sotto il controllo del promotore T7 con l'operatore lac, e contengono una sequenza pelB segnale per il targeting al periplasma. Un esempio di un vettore adatto è pET22b (+) da Novagen.
- Trasformare la biblioteca in endoglucanase E. coli ceppo BL21 (DE3) e la piastra per singole colonie.
- Incubare trasformazione durante la notte a 37 ° C.
- Utilizzando stuzzicadenti sterile, inoculare cloni in 96 pozzetti profondi pozzetti contenenti medio 400μL LB integrato con antibiotici appropriati. Incubare a 37 ° C per una notte in agitazione a 250 rpm.
- Aggiungere glicerolo sterile a 96 culture e durante la notte per una concentrazione finale del 10% per la conservazione a lungo termine a -80 ° C. Questo sarà il piatto principale.
- Utilizzando un 96-pin bollo, replicare culture piatto durante la notte sulle piastre di screening contenenti IPTG e CMC. Fino a 5 gruppi di culture durante la notte può essere stampato su ogni piatto di screening.
- Etichetta le piastre di screening in modo che l'identità e l'orientamento di ogni piastra 96 pozzetti è noto.
- Incubare le librerie timbrato a temperatura ambiente (17-25 ° C) durante la notte o fino a quando si sono formate colonie visibili.
- Risciacquare con acqua distillata piatto fino a quando tutte le tracce delle colonie sono stati rimossi.
- Versare Congo Red (CR; 0,5% in acqua) sulla piastra lavato. Assicurarsi di aggiungere quel tanto che basta CR per coprire la piastra.
- Incubare 15 minuti a temperatura ambiente. Non superare i 15 minuti per l'incubazione CR. Tempi di incubazione più lungo si tradurrà in aloni meno distinte.
- Eliminare CR e aggiungere una generosa quantità (più che sufficienti a coprire il piatto) di NaCl 1M.
- Incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
- Eliminare NaCl per rivelare aloni degrado CMC. Per una migliore risoluzione delle aureole, tempi di incubazione più lungo con lavaggi NaCl NaCl o multipli possono essere richiesti.
- Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, pick attivo cloni enzimi dalla lastra per la ulteriore caratterizzazione.
3. Rappresentante dei risultati:
Un esempio di lettura di questo schermo ad alto rendimento è mostrata in Figura 3. I cloni possono essere identificati come inattivo, debolmente attiva e molto attivi in base alle dimensioni delle zone di degrado. Questo è particolarmente utile se un enzima ad attività nota è incluso nella biblioteca come riferimento. Come mostrato qui, l'identificazione degli enzimi attivi è robusta e riproducibile. Tuttavia, tieni presente che un'adeguata etichettatura delle lastre di screening è estremamente importante. Il ricercatore deve essere in grado di identificare le varianti attivo dopo aver lavato le colonie di distanza, al fine di raccoglierli dal piatto principale conservato a -80 ° C per un'ulteriore caratterizzazione. Infine, è difficile valutare a priori il rapporto tra le attività su substrati artificiali vs naturale. Pertanto, il ricercatore deve verificare tutti i cloni positivi su materiali di interesse industriale per determinare l'idoneità fisica proteine.
Figura 1. Delineare schematica della procedura di screening. Le cellule sono trasformate con una libreria endoglucanase e placcato selettivamente per singole colonie. Cloni raccolto e cresciuto durante la notte in 96 pozzetti pozzo profondo per (1) conservazione a -80 ° C e (2) placcatura replica su piastre contenenti CMC e IPTG per indurre l'espressione endoglucanase. Cloni attive vengono prelevati dalla piastra principale conservato a -80 ° C.
Figura 2. Clonazione ed espressione di funghi domini catalitici in E. coli. (A) vettore di espressione Endoglucanase. I geni sono stati clonati in pET22b (+) (Novagen) sotto il controllo del promotore T7. (B) pannello di destra: endoglucanase che esprimono BL21 (DE3) colonie. Pannello di sinistra: aloni degrado CMC dopo il lavaggio e lo sviluppo con Rosso Congo.
Figura 3. I risultati dei campioni da CMC / Congo schermo Rosso. Foto scattate delle lastre di screening dopo il lavaggio e lo sviluppo del Congo Rosso. Tutte le colonie su spiatti creening erano di dimensioni simili.
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Discussion
Il protocollo qui descritto consente una rapida identificazione e ad alta velocità di enzimi attivi, con la manipolazione minima. Rilevamento di attività è abbastanza sensibile, e riflette qualitativamente la quantità di attività all'interno della cellula. La sua facilità d'uso rende questo metodo adatto per una vasta gamma di librerie enzima, limitato solo dalla espressione funzionale in E. coli. Inoltre, lo screening attività di questo genere non è limitato a cellulasi fungine, ma può essere adattato per qualsiasi attività endoglucanase, o qualsiasi attività cellulasi per i quali esiste un substrato solubile (come CMC).
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Gordon and Betty Moore Foundation, e dal UNCF / Merck Iniziativa Scienza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Congo Red | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
References
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