Summary
私達は中の真菌エンドグルカナーゼ活性をスクリーニングするために、低コスト、高スループットの方法を説明します
Abstract
セルラーゼ酵素（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ-グルコシダーゼ）順番に燃料アルコール1に変換することができるコンポーネントの糖類、に加水分解セルロース。再生可能エネルギーを提供するために、セルロース系バイオマスの酵素加水分解の可能性は、経済的な燃料生産の2のセルラーゼを設計するための努力を強化している。特に興味深いのは、すでに食品や繊維製品の処理のために工業的に使用されている真菌セルラーゼ3-8、です。
変異セルラーゼのライブラリの間でアクティブなバリアントを識別することは、エンジニアリングプロセスにとって重要です。アクティブな変異体は、さらに改良された特性について試験及び/または付加変異導入を行うことができる。真菌セルラーゼの効率的なエンジニアリングは、ネイティブの生物の遺伝的なツールの欠如によっておよび異種宿主中で酵素を発現における困難によって妨げられている。最近、森川らは、E.で表現するための手法を開発大腸菌 H. jecorina 3,9、大量のセルラーゼを分泌する能力を有する重要な産業の真菌からのエンドグルカナーゼの触媒ドメイン。機能性E.大腸菌の発現はまた、Macrophomina phaseolina 10とPhanerochaeteクリソ 11月12日を含む他の真菌、からセルラーゼのために報告されています。
我々は、E.の真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニングのための方法を提示大腸菌 。 （ 図1）このメソッドは、固形培地上に生育している細胞によるカルボキシメチルセルロース（CMC）の酵素分解を視覚化する一般的な微生物色素コンゴレッド（CR）を使用しています。活性測定は、安価な試薬、最小限の操作を必要とし、コロニーのサイトでの劣化のゾーン（"ハロー"）として、明確な結果が得られます。酵素活性の定量的測定がこの方法によって決定することはできませんが、我々は、ハローのサイズはセル内の総酵素活性と相関することを発見した。個々の陽性クローンのさらなる特徴は、相対的な蛋白質の適応度を決定します。
伝統的な細菌の全細胞CMC / CR活性アッセイ13はクロスコンタミネーション、または大規模な実験にはあまり適しているCMC寒天井戸、でインキュベート文化の対象となるコロニー、上に寒天を含むCMCを注ぐ伴います。ここでは、セルラーゼ活性のための14の既存の洗浄方法を変更する改良されたプロトコルを報告する：CMC寒天プレート上で増殖した細胞は、前のCRの染色に削除されます。我々のプロトコルが大幅にクロスコンタミネーションを低減し、クローンの数千の迅速なスクリーニングを可能にする、非常にスケーラブルです。 H.に加えてjecorina酵素は 、我々が表明していると、このプロトコルは、生物の範囲から酵素に適用可能であることを示唆し、Thermoascus aurantiacusとペニシリウムdecumbens（ 図2に示されている）からエンドグルカナーゼの変異体をスクリーニングした。
Protocol
1。スクリーニングプレートの準備
- 25グラムのLB増殖培地、15グラム寒天、および1Lの蒸留水に1.5グラムカルボキシメチルセルロース（CMC）基板、および滅菌にオートクレーブを追加。
- オートクレーブ後、培地が適切な抗生物質を冷却し、追加することができますし、100μMの最終濃度になるようにIPTG。
- 5大正方形ペトリ皿/バイオアッセイ用トレイ（240 × 240 × 20mm以上大きい）にそれぞれ200mLの培地を注ぐ。プレートが完全に乾いてから。
2。エンドグルカナーゼのライブラリの生成と画面
- エンドグルカナーゼ触媒ドメイン（複数可）のライブラリを生成します。これは、多くの方法で達成することができます（例えば、部位特異的またはランダム突然変異誘発、組換え、など）と研究者によって決定されます。
- 彼らはlacオペレーターとT7プロモーターの制御下にあるようにベクターにライブラリのクローンを作成し、ペリプラズムへのターゲティングのためのpelBシグナル配列を含有する。適切なベクターの例は、NovagenからpET22b（+）です。
- E.にエンドグルカナーゼのライブラリを変換する大腸菌菌株BL21（DE3）および単一のコロニーのためのプレート。
- 37℃で一晩変換をインキュベート℃に
- 滅菌つまようじを使用して、適切な抗生物質を補充した400μLのLB培地を含む96ウェルディープウェルプレートにクローンを接種する。 250 rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートする。
- -80℃で長期保存のための10％の最終濃度℃に96ウェル一晩培養して無菌のグリセロールを追加これがマスタープレートになります。
- 96ピンスタンプを用いて、IPTGとCMCを含むスクリーニングプレート上にプレート一晩培養を複製する。最高一晩培養の5セットまでは、各スクリーニングプレート上にスタンプすることができます。
- 各96ウェルプレートの識別と向きがわかるようにスクリーニングプレートにラベルを付けます。
- 室温（17〜25 ° C）一晩または目に見えるコロニーが形成されるまでにスタンプライブラリをインキュベートする。
- コロニーのすべてのトレースが削除されるまで蒸留水で皿をすすぐ。
- 洗浄したプレートの上に、コンゴーレッド（水中に0.5％のCRを）注ぐ。プレートをカバーするだけの十分なCRを追加してください。
- 室温で15分間インキュベートする。 CRのインキュベーションのための15分を超えないようにしてください。より長いインキュベーション時間が少なく明瞭ハローになります。
- CRを捨て、1MのNaClの寛大な量を（より十分なプレートをカバーする）を追加。
- 室温で15分間インキュベートする。
- CMC分解ハローを明らかにするためにNaClを捨て。ハローのよりよい解決のために、NaClまたは複数のNaClを洗浄、より長いインキュベーション時間が必要になることがあります。
- 滅菌つまようじを使用して、さらなる特性評価のためのマスタープレートから活性酵素のクローンを選ぶ。
3。代表的な結果：
このハイスループットスクリーニングのための読み出しの例を図3に示されています。クローンは劣化ゾーンのサイズに基づいて非アクティブな、弱い活性、および非常にアクティブとして識別することができます。既知の活性の酵素が基準としてライブラリに含まれている場合に特に便利です。ここに示すように、活性酵素の同定は、堅牢で再現性です。しかし、スクリーニングプレートの適切なラベル付けが非常に重要であることに注意してください。研究者は、° Cさらなる特徴付けのために-80℃で保存されたマスタープレートからそれらを選択するために、離れてコロニーを洗浄した後、アクティブな亜種を識別できる必要があります。最後に、人工的な対天然の基質上での活動の間に事前の関係を評価することは難しいことです。したがって、研究者は、蛋白質の適応度を決定するために工業的に関連する材料のすべての陽性クローンをテストする必要があります。
図1。スクリーニング手順の概略図概略。細胞は、エンドグルカナーゼライブラリで形質転換し、シングルコロニーを選択的にメッキが施されています。クローンは、-80℃（1）ストレージ℃、エンドグルカナーゼの発現を誘導するためにCMCとIPTGを含むプレート上で（2）レプリカのメッキ用96ウェルディープウェルプレートで一晩ピックアップと成長。アクティブなクローンは、-80℃で保存されたマスタープレートから取得さ
図2 E.における真菌触媒ドメインのクローニングと発現大腸菌 。 （A）エンドグルカナーゼの発現ベクター。遺伝子はT7プロモーターの制御下で、pET22b（+）（Novagen）にクローニングした。 （B）右パネル：エンドグルカナーゼを発現するBL21（DE3）コロニー。左のパネル：コンゴーレッドによる洗浄および開発後のCMC分解ハロー。
図3。CMC /コンゴーレッドの画面からサ ンプルの結果。洗浄とコンゴレッドの開発後にスクリーニングプレートから撮影した画像。の上のすべてのコロニーcreeningプレートは、同じようなサイズのものであった。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、最小限の操作で、アクティブな酵素の迅速かつ高スループットの識別が可能になります。アクティビティ検知とはかなり敏感であり、質的に、細胞内のアクティビティの量を反映している。その使いやすさはE.の機能的発現によって制限、酵素ライブラリの広い範囲のためのこの方法が適しています大腸菌 。さらに、この種の活動のスクリーニングは、真菌セルラーゼに限定されるものではありませんが、任意のエンドグルカナーゼ活性を適応させることができる、または任意のセルラーゼ活性は、対象となる水溶性基材（CMCのような）がある。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ゴードンとベティムーア財団、およびUNCF /メルク科学イニシアチブによって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I1284 | |
| Congo Red | Sigma-Aldrich | C6277 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S1679 | |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 | |
| Bioassay plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 240845 |
References
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