Summary
מחקר זה מתאר שיטה המאפשרת אבחון המהיר וברור של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום באמצעות שילוב של הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים ושיטות צביעה שליליות.
Abstract
חקירות של שינויי ultrastructural נגרמים על ידי וירוסים לעתים קרובות יש צורך לזהות בבירור מחלות ויראליות בצמחים. עם הכנת מדגם קונבנציונלית למיקרוסקופיה אלקטרוני הילוכים (TEM) חקירות כאלה יכולות לקחת כמה ימים 1,2 ולכן אינו מתאימות לאבחון מהיר של מחלות נגיפיות צמח. קיבעון מיקרוגל יכול לשמש בצורה דרסטית כדי לקצר את זמן הכנת מדגם לחקירות TEM עם תוצאות דומות לאלו של ultrastructural נצפה לאחר קונבנציונלית הכנת מדגם 3-5. מכשירים רבים ושונים בהתאמה אישית מיקרוגל זמינים כרגע שיכול לשמש לקיבוע וההטמעה של דגימות ביולוגיות לחקירות TEM 5-8 המוצלחים. במחקר זה אנו מראים על וירוס פסיפס טבק (TMV) נגוע צמחי tabacum Nicotiana כי ניתן לאבחן שינויים בultrastructural עלים כבחצי יום באמצעות הכנת מדגם מיקרוגל סיוע עבור TEM. יש לנו נבחרנו לבצע את המחקר הזה עם מכשיר מיקרוגל זמין מסחרי כפי שהוא מבצע הכנת מדגם כמעט במלואו באופן אוטומטי 5 בניגוד למכשירים האחרים הזמינים בו צעדים רבים עדיין צריכות להתבצע באופן ידני 6-8 והם יותר ולכן זמן רב עבודה. כהכנת מדגם מתבצעת באופן אוטומטי לחלוטין מכתים שלילי של חלקיקים נגיפיים בלשד העלים TMV הנגועים הנותרים והבחינה הבאה של ultrastructure וגודל ניתן לבצע במהלך קיבעון והטבעה.
Protocol
הכנת מדגם מיקרוגל סיוע
- לפני תחילת הכנת מדגם אחד צריכה לתכנת מעבד האוטומטי מיקרוגל רקמות למיקרוסקופ אלקטרונים (EM היקה AMW; Microsystems היקה, וינה, אוסטריה) עם הפרוטוקולים הבאים (טבלה 1) להכנת מדגם סיוע מיקרוגל למשך TEM:
טבלת 1. פרוטוקול להכנת מדגם באמצעות קרינת מיקרוגל. העמודות השונות להראות (משמאל לימין):- מספר הבקבוקון (ע"נ בקבוקון.) מייצג את הסדר שבו הבקבוקון נטען לקרוסלה של המעבד.
- שלב של התהליך בפועל.
- ריאגנטים בבקבוקונים.
- משך הצעד הממשי.
- טמפרטורה המקסימלית שהגיעה בבקבוקון לפני הקרנת המיקרוגל כבויה.
- הגדרת קרינת מיקרוגל: הרציף = incre הטמפרטורה המהירהase, מחזיק טמפרטורה שנקבעה; סלופ = עלייה עדינה טמפרטורה, טמפרטורה סופית הגיעה בסוף; פעם = טמפרטורת גידול, כוח ראפיד כבוי עד שהטמפרטורה ירדה 5 ° C, הכח חדש יגיע לטמפ '.
- הספק מקסימאלי של קרינת המיקרוגל.
- טרי להכין את הפתרונים לשלבים השונים שתוארו בפרוטוקול הכנת המדגם (עבור שרף אפוקסי אגר 100 ראה 1.7), למלא אותם לתוך הצלוחיות המיועדות על פי הפרוטוקול המתוכן (טבלה 1), טען את הבקבוקונים בקרוסלה, ואז להכניס קרוסלה לתוך מעבד רקמת המיקרוגל, ולבסוף לטעון את הבקבוקון הראשון לבית הבליעה מונה המצב.
- גזור את החלקים קטנים של עלים (1 מ"מ 2) מtabacum Nicotiana נגוע בנגיף פסיפס טבק (TMV) בסכין גילוח על צלחת שעוות דוגמנות בירידה של 3% glutaraldehyde (אגר מדעי בע"מ, סטנסטד, אנגליה) ב60mm סורנסן פוספט חיץ (pH 7.2) בטמפ 'החדרerature.
- להעביר את החלקים עם פינצטה העדינה מייד לתוך הסלים הייעודיים עם רוחב רשת של כ 200μm. לערום את הסלים על גבי זה ולהכניס אותם לתוך התא מונה המצב. יש להקפיד כי הדגימות מכוסות כל זמן עם פתרון מקבע במהלך טעינה וערימה של הסלים כדי שלא יתייבשו.
- התחל פרוטוקול העבר המתוכן מיקרוגל סיוע מדגם הכנה לקיבעון, התייבשות וחדירה.
- בעוד הכנת מדגם מתבצעת באופן אוטומטי על ידי מעבד רקמת המיקרוגל להמשיך בצביעה שלילית עם החומר צמחי שנותר כאמור בסעיף 3 (מכתים שלילי).
- טרי להכין שרף אפוקסי אגר 100 על ידי ערבוב את הרכיבים הבאים כמתואר: 24G אגר מילוי 100, אנהידריד succinic 16G dodecenyl, ואנהידריד 10 גרם מהתיל nadic (עבור כל הרכיבים לראות אגרו מדעי בע"מ, סטנסטד, אנגליה) בכוס פלסטיק, החום זה40 ° C ולערבב אותו היטב. הוסף 1.2g של נזיל dimethylamine ומערבב היטב. מלא שרף אפוקסי אגר 100 לתוך פילמור המיועד מהווה רק לפני מדגם פרוטוקול ההכנה מגיע לסיומה (למשל בשלב 22 בטבלה 1).
- לאחר הפרוטוקול סיים (אחרי השלב 22 בטבלה 1) לשחרר את הסלים מוערמים המכילים את דגימות הסתננות מחדר המצב מונה לבקבוקון האחרון של הקרוסלה. הסר את הקרוסלה ממכשיר המיקרוגל, unstack הסלים ומעלים אותם באמצעות פינצטה העדינה לתוך טפסי פולימריזציה הייעודיות. יש להקפיד כי הדגימות תמיד מכוסות בשרף אפוקסי אגר במהלך 100 unstacking וטעינה כדי שלא יתייבשו.
- סטאק את צורות פולימריזציה על גבי השני. יש להקפיד כי הדגימות תמיד מכוסות בשרף אפוקסי אגר במהלך 100 לערום וטעינה כדי שלא יתייבשו.
- הסר בקבוקונים שמשו בעבר מהקרוסלה של המיקרוגל tissue המעבד, טען אותו עם סלים המוערמים ולהכניס את הקרוסלה לתוך מעבד רקמת המיקרוגל.
- התחל פרוטוקול פילמור העבר המתוכן (טבלה 1).
- בעוד פילמור מתבצע באופן אוטומטי על ידי מעבד רקמת המיקרוגל, לבחון רשתות שליליות מוכתמות במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים [למשל פיליפס CM10 TEM, פיי (לשעבר פיליפס), איינדהובן, הולנד] ולבצע ניתוח תמונה כאמורה בסעיף 3 ו 4 ( מכתים שלילי וניתוח תמונה).
- לאחר הפרוטוקול הוא סיים להסיר את צורות פולימריזציה מהתא מונה המצב, unstack צורות פולימריזציה ולהסיר את אובניים polymerized המכיל את הדגימות. עכשיו הם מוכנים להיות נותחו עם microtome.
2. זמירה וחתך
- הכנס בלוקים אחת או יותר למחזיקי מדגם נפרדים לultrathin חתך עם המדגם בדבק עליון על 1cm מתוך המחזיק.
- חתוך את הבלוק עם גוזם דגימה לTEM (למשל היקה רייכרט Ultratrim; Microsystems יקה), כך שפן בלוק של מקסימום. 1mm באורך ורוחב ב200μm שמכיל חומר עלה ככל האפשר מושג (לחסום גודל פנים אולי צריך להיות מותאם לגודל של סכין היהלום).
- סעיף לחסום עם ultramicrotome (למשל רייכרט יקה Ultracut S; Microsystems יקה) באמצעות סכין יהלום בזווית של 45 מעלות סכין (למשל Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, אוסטריה). עובי הסעיף צריך להיות מותאם לכ 70 עד 90 ננומטר ומהירות החיתוך צריכה להיות בסביבות 1 מ"מ / s. לאסוף את מספר מקטעים עם formvar (אגר מדעי בע"מ) רשת מצופית נחושת או ניקל 200 כיכר רשת.
- לאחר להכתים את החלקים על הרשת עם ציטרט עופרת (אגר מדעי בע"מ; ציטראט העופרת 1.1g מומס במים מזוקקים ו42ml כפולים 8ml 1N NaOH) במשך 5 דקות בצלחת פטרי מלא בחלקן NaOH ליצור CO 2-חופשיים סביבה ועבור 15 מיילnutes עם 1% יצטט uranyl (אגר מדעי בע"מ) מומס במים מזוקקים בטמפרטורת חדר. שוטף את הרשתות במים מזוקקים למשך 1 דקה בין כל שלב שלאחר צביעה. אוויר יבש הרשתות בתיבת רשת.
- בחן את הסעיפים במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (למשל פיליפס CM10 TEM, פיי, איינדהובן, הולנד).
3. מכתים שלילי
- אסיף על 100 מ"ג מחומר עלה TMV הנגוע ולהכין מוהל גס על ידי שמאחד את החומר ל2 דקות בסכין גילוח בשקופית מיקרוסקופ ב100μl של 60mm Søfrensen פוספט חיץ (pH 7.2).
- העברת 20μl של homogenate כתוצאה על הבאר הראשונה של שקופית מיקרוסקופ מצופי טפלון עם 4 או יותר בארות (לחלופין אפשר גם להעביר homogenate על פיסת parafilm).
- הנח רשת מצופית formvar על גבי homogenate עם צד formvar (אגר מדעי בע"מ) המצופה פונה כלפי הטיפה וincuלהוריד לו במשך 5 דקות.
- שטוף את הרשת פי 2 עבור 2 דקות כל אחד על ידי הצבת הרשת על גבי שתי טיפי 200μl 60mm סורנסן פוספט החיץ (pH 7.2).
- דגירת הרשת למשך 1 דקה בתמיסה ב60mm סורנסן פוספט חיץ (pH 6.5) חומצת phosphotungstic 2% מוכן טרי (אגר מדעי בע"מ).
- הסר את הרשת ולאפשר לו לייבוש באוויר בתיבת רשת.
- בדוק את הרשת עם מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (למשל פיליפס CM10 TEM; פיי, איינדהובן, הולנד). קח לפחות 10 תמונות של virions שלילי המוכתם שנבחר באקראי (לפחות 10 או יותר virions צריך להיות גלוי על כל תמונה) עם מיקרוסקופ אלקטרוני ההילוכים בהגדלה ראשונית של 21000X או גבוה יותר. יש להקפיד שכל התמונות יש את אותה גדלה.
4. ניתוח תמונה
- מדוד את האורך והרוחב של לפחות 100 חלקיקי נגיף יחיד שנבחרו באקראי על micrographs נלקחאת הדגימות שליליות המוכתמות על ידי שימוש בכל תוכנת מחשב ניתוח תמונה [למשל התא D (אולימפוס, חיים והחומר המדע Europe GmbH, המבורג, גרמניה) עם כלי ניתוח החלקיק או Optimas 6.5.1-(מדיה קיברנטיקה Inc, בתסדה, מרילנד, ארה"ב)].
- חישוב ממוצעים וסטיות תקן על מנת להשיג אורך ורוחב ממוצע של חלקיקי הווירוסים מדמיינים ידי מכתים שיטות שליליות וTEM.
- השווה בין האורך ולתכונות ultrastructural (שהושג ב2.5) עם גדלים של וירוסים ושינויים הנגרמים על ידי מחל ultrastructural וירוס מוכרים בספרות במטרה לזהות בבירור את המחלות הנגיפיות.
5. תוצאות נציג:
לאחר שינויי מיקרוגל סייעו מדגם הכנה טיפוסיים TMV מושרים ultrastructural כגון שטחים גדולים המכילים נגיפים מיושרים בצורה מקבילה יכולים להיות שנצפו במיקרוסקופ אלקטרוני ההילוכים בcytosol של Nicotian הנגועבתאי tabacum (האיור 1 א). בנוסף, במוהל הגולמי של נגוע TMV משאיר חלקיקי TMV יכולים להיבחן כמבני flexuous, בצורת מוט לאחר צביעה שלילית (האיור 1B). ניתוח תמונה של 100 חלקיקי נגיף מתגלה גודל ממוצע לTMV של 280nm באורך ורוחב ב17nm (איור 2). Ultrastructure בתאי TMV נגועים ובגודל של נגיפים שנצפו במחקר זה נמצא כי בהתאם למאפייני ultrastructural TMV מושרים בטבק וטווח הגודל של חלקיקי TMV שדווח בעבר בספרות 9-15.
האיור 1. Micrographs אלקטרון ההולכה של תאים וvirions עלים TMV נגועים. א) תמונה מראה את ultrastructure של תאי עלי mesophyll TMV הנגועים של tabacum Nicotiana לאחר הכנת מדגם צמח מוגנת מיקרוגל. שים לב השטח הגדול של נגיפים מיושרים מקבילים אשר נצברו בcytosol.C = הכלורופלסט עם עמילן (סנט), M = mitochondrion, N = גרעין, V = vacuole, בר = 2μm. B) תמונה מראה virions שאותרו על ידי מכתים שלילי במוהל עלים נגועים.
איור 2. גודל יחסי של נגיפים. התפלגות יחסית של אורך ורוחב של TMV חלקיקים לאחר מכתים שלילי מיץ עלים נגועים כפי שהופיעו במיקרוסקופ האלקטרונים. משמעות ערכים (כלומר אורך / רוחב ± סטיית תקן) חושבה מתוך 100 virions.
Discussion
הכנת מיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור TEM הוכחה לספק נתוני ultrastructural מהירים ואמינים תוך כמה שעות 3,4,16. שימור מבני הקנס של אברונים וקרומים שהושגו עם השיטה המשמשת במחקר זה היה דומה לדגימות קונבנציונליות וcryofixed 5,15 עם היתרון של הפחתה מסיבית בקיבעון מדגם והטבעת הזמן של 3 ימים או יותר לכ 2 שעות. זה מייצג את פרוטוקול הכנת המדגם המהיר ביותר לTEM הזמין כרגע בספרות. השיטה המתוארת במחקר זה בשילוב הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור TEM עם שיטות צביעה שליליות שאפשרו זיהוי ברור ומהיר של שינויי ultrastructural TMV מושרים והסוכן הנגיפי עצמו. שינויי ultrastructural TMV מושרים יכולים להיחקר לאחר זמירה, תבתר ולאחר צביעה בתוך כ 4 שעות לאחר תחילתו של קיבעון בשידור elecטרון מיקרוסקופ. שימוש באופן אוטומטי לחלוטין מצב הכנת הדגימה שחרר חוקר לנהל מכתים שלילי בתקופת ביניים על מנת לקבוע את הגודל ורוחבו של הסוכן הנגיפי. לפיכך, אנו יכולים להסיק כי שיטה זו מאפשרת אבחנה ברורה ומהירה של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום שיש חשיבות רבה לשימוש בעתיד בניסויי חקלאות ומדעית במפעל phytopathology. כשיטה זו יכולה לשמש גם לאבחון המהיר של מחלות בבעלי חיים ובני אדם שיש לו פוטנציאל גדול ליישום עתידי בפתולוגיה רפואית ווטרינרים.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרית (FWF, P20619 וP22988 לBZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
