Summary
Este estudo descreve um método que permite o diagnóstico rápido e preciso de doenças de plantas de vírus em cerca de meio dia, utilizando uma combinação de micro-ondas preparação assistida planta amostra para microscopia electrónica de transmissão e métodos de coloração negativa.
Abstract
Investigações de alterações ultra-estruturais induzidas por vírus são muitas vezes necessários para identificar claramente doenças virais nas plantas. Com a preparação da amostra convencional para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) tais investigações podem demorar vários dias 1,2 e portanto não são adequados para o diagnóstico rápido de doenças de vírus de plantas. Fixação de microondas pode ser utilizada para reduzir drasticamente o tempo de preparação de amostras para TEM investigações com resultados semelhantes, como observado após ultraestruturais convencionalmente preparação de amostras 3-5. Diversos dispositivos de micro-ondas personalizados feitos estão actualmente disponíveis, que pode ser usada para a fixação de sucesso e de incorporação de amostras biológicas para investigações TEM 5-8. Neste estudo mostramos em Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV) infectadas plantas de Nicotiana tabacum, que é possível diagnosticar alterações ultra-estruturais em folhas de cerca de meio dia, utilizando micro-ondas a preparação da amostra assistida por TEM. Optou-se por realizar este estudo, com um dispositivo de micro-ondas comercialmente disponível, uma vez que a preparação da amostra efectua quase totalmente automática 5 em contraste com os outros dispositivos disponíveis em vários passos têm ainda de ser realizadas manualmente, 6-8 e são, portanto, mais tempo de trabalho e consumo. Como a preparação da amostra é realizada de forma totalmente automática coloração negativa de partículas virais na seiva das restantes folhas infectadas com TMV e do exame seguinte da ultra-estrutura e tamanho pode ser realizada durante a fixação e a incorporação.
Protocol
Microondas preparação da amostra assistida
- Antes do início da preparação da amostra é necessário para programar o processador de tecido automático microondas por microscopia electrónica (EM Leica AMW; Leica Microsystems, Viena, Áustria), com os seguintes protocolos (Tabela 1) para a preparação de amostras de microondas assistida por TEM:
Tabela 1. Protocolo para a preparação da amostra, utilizando a irradiação de microondas. As diferentes colunas mostrar (da esquerda para a direita):- Número frasco (frasco n °.) Representa a ordem na qual o frasco é colocado no carrossel do processador.
- Etapa do processo real.
- Reagentes nos frascos.
- Duração da etapa actual.
- Temperatura máxima que é alcançada no frasco antes da irradiação de microondas é desligado.
- Configuração de irradiação de microondas: Contínuo = incrementos rápida de temperaturaase, mantendo a temperatura desejada; Inclinação = aumento de temperatura suave, temperatura final alcançado no final; Pulsada = rápido aumento da temperatura de alimentação, desligado até a temperatura caiu 5 ° C, o poder voltou a atingir a temperatura.
- Potência máxima da irradiação por microondas.
- Recém preparar as soluções para as diferentes etapas descritas no protocolo de preparação da amostra (por Agar resina epoxi 100 ver 1.7), enchê-los nos frascos designados de acordo com o protocolo programado (Tabela 1), carregar os frascos no carrossel, em seguida, inserir o carrossel para o processador de tecido micro-ondas, e, finalmente, carregar o primeiro frasco para dentro da câmara mono-modo.
- Cortar secções de folhas pequenas (1mm 2) a partir de Nicotiana tabacum infectadas com vírus do mosaico do tabaco (TMV) com uma lâmina de barbear sobre uma placa de cera de modelagem de uma gota de glutaraldeído a 3% (Agar Scientific Ltd., Stansted, Inglaterra) em 60mM Sørensen tampão fosfato (pH 7,2) à temperatura ambienteratura.
- Transferir as seções com pinças finas imediatamente para as cestas designados com uma largura de malha de cerca de 200 um. Empilhar as cestas em cima uns dos outros e inseri-los na câmara de mono-modo. Deve ser tomado cuidado de que as amostras estão constantemente coberta com a solução fixadora durante o carregamento e empilhamento dos cestos de modo que eles não secam.
- Comece o programado anteriormente microondas protocolo de preparação assistida amostra para desidratação, fixação e infiltração.
- Enquanto a preparação da amostra é realizada automaticamente pelo processador de tecidos microondas continuar com coloração negativa com o material vegetal remanescente, conforme descrito na seção 3 (coloração negativa).
- Agar de fresco preparar resina epóxi 100 através da mistura dos seguintes componentes, conforme descrito: Agar 24g enchimento 100, 16g de anidrido dodecenil succínico e 10 g de anidrido metil nádico (para todos os componentes ver Agar Scientific Ltd., Stansted, Inglaterra) num copo de plástico de calor, -a40 ° C e misture bem. Adicionar 1,2 g de benzil dimetilamina e misture bem. Encha Agar resina epoxi 100 para a polimerização designado forma imediatamente antes do protocolo de preparação da amostra chega ao fim (por exemplo, durante o passo 22 na tabela 1).
- Após o protocolo está terminada (após o passo 22 na tabela 1) libertar os cestos empilhados que contêm as amostras a partir da câmara de infiltrados mono-modo para dentro do frasco passado do carrossel. Retire o carrossel do dispositivo de microondas, desempilhar as cestas e carregá-los usando uma pinça fina para as formas de polimerização designados. Deve ser tomado cuidado de que as amostras são sempre cobertas com Agar de resina epoxi 100 durante desempilhar e carregamento de modo a que eles não secam.
- Empilhar as formas de polimerização em cima uns dos outros. Deve ser tomado cuidado de que as amostras são sempre cobertas com Agar de resina epoxi 100 durante o carregamento e empilhamento de modo a que eles não secam.
- Remover os frascos previamente utilizadas a partir do carrossel de microondas tissue processador, carregá-lo com as cestas empilhadas e inserir o carrossel para o processador de tecidos de microondas.
- Iniciar o protocolo de polimerização previamente programado (tabela 1).
- Enquanto polimerização é realizada automaticamente pelo processador de tecidos microondas, examinar grades negativamente manchadas com um microscópio eletrônico de transmissão [por exemplo Philips CM10 TEM, FEI (antiga Philips), Eindhoven, Holanda] e realizar análise de imagem, como descrito na seção 3 e 4 ( coloração negativa e a análise de imagem).
- Depois de terminar o protocolo é remover as formas de polimerização a partir da câmara de mono-modo, desempilhar as formas de polimerização e remover os blocos de polimerizados que contêm as amostras. Eles já estão prontos para ser seccionadas em micrótomo.
2. Desbastar e cortar
- Insira um ou mais blocos em porta-amostras separadas para ultrafino seccionamento com a amostra no topo degola cerca de 1cm para fora do suporte.
- Apare o bloco com um aparador de amostra para TEM (por exemplo, Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems), de modo que um rosto bloco de max. 1 mm de comprimento e 200 um de largura, que contém o material da folha, tanto quanto possível, é alcançado (o tamanho do bloco cara pode ter de ser ajustada para o tamanho da faca de diamante).
- Secção do bloco com um ultramicrótomo (por exemplo, Reichert Ultracut Leica S; Leica Microsystems), usando uma faca de diamante num ângulo de faca de 45 ° (por exemplo, Ultra Diatome 45, Gröpl, Tulln, Áustria). Espessura de corte deve ser ajustada para cerca de 70 a 90 nm e a velocidade de corte deve ser cerca de 1 mm / s. Pegue várias seções com um revestimento formvar cobre ou níquel (Agar Scientific Ltd.) 200 grade de malha quadrada.
- Post-mancha as secções sobre a grade com citrato de chumbo (Agar Scientific Ltd., 1,1 g de citrato de chumbo dissolvido em 42 mL de água duplamente destilada e 8 mL de NaOH 1N) durante 5 minutos numa placa de Petri parcialmente cheios com NaOH para criar um CO 2-livre meio ambiente e para 15 miNUTES com acetato de uranilo a 1% (Agar Scientific Ltd.) dissolvida em água destilada à temperatura ambiente. Lave as grades com água destilada durante 1 minuto, entre cada passo de pós-coloração. Secar as grades de uma caixa de grade.
- Examine as seções com um microscópio eletrônico de transmissão (por exemplo Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Holanda).
3. Coloração negativa
- Colheita cerca de 100mg de TMV-infectado material foliar e preparar seiva em bruto por homogeneização do material durante 2 minutos com uma lâmina de barbear sobre uma lâmina de microscópio em 100 ul de 60 mM Søfrensen tampão fosfato (pH 7,2).
- Transferir 20 uL de homogenato resultante para o primeiro poço de uma lâmina de microscópio revestidas de teflon com 4 ou mais poços (em alternativa, também é possível transferir o homogeneizado em um pedaço de Parafilm).
- Colocar uma grade formvar revestida na parte superior do homogenato com o lado formvar (Agar Scientific Ltd.) revestida voltada para a gota e INCUbate por 5 minutos.
- Lava-se a grelha de 2 vezes, durante 2 minutos cada, colocando a grade na parte superior de duas gotas de 200 ul de tampão fosfato 60 mM Sørensen (pH 7,2).
- Incubar a grelha durante 1 minuto, com um preparado de fresco de 2% de ácido fosfotúngstico (Agar Scientific Ltd.) em solução 60 mM de fosfato de Sorensen (pH 6,5).
- Retire a grelha e deixe-a secar ao ar numa caixa de grelha.
- Examine a grade com um microscópio eletrônico de transmissão (por exemplo Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Holanda). Tomar, pelo menos, 10 imagens escolhidas aleatoriamente virions coradas negativamente (com pelo menos 10 ou mais viriões deve ser visível em cada imagem), com o microscópio electrónico de transmissão com uma ampliação de 21000X primária ou superior. Cuidados devem ser tomados para que todas as imagens têm a mesma ampliação.
4. A análise de imagem
- Medir o comprimento e largura de pelo menos 100 escolhidos aleatoriamente partículas de vírus individuais sobre as micrografias tiradasas amostras coradas negativamente usando qualquer software de computador de análise [Cell por exemplo, D (Olympus, Vida e Ciência dos Materiais Europe GmbH, Hamburgo, Alemanha) com a ferramenta de análise de partículas ou Optimas 6.5.1 (Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, EUA)].
- Calcular médias e desvios padrão, a fim de atingir um comprimento médio e a largura das partículas de vírus visualizados por métodos de coloração negativa e TEM.
- Comparar o comprimento e as características ultra-estruturais (obtido em 2.5) com tamanhos de vírus e de alterações ultra-estruturais induzidas por doenças de vírus conhecidos na literatura, a fim de identificar claramente as doenças virais.
5. Os resultados representativos:
Depois de microondas assistidas de preparação de amostra típica TMV induzidas alterações ultra-estruturais, tais como grandes áreas contendo viriões alinhadas em forma paralela pode ser observado com o microscópio electrónico de transmissão no citosol de fumante infectadoum células tabacum (Fig. 1A). Além disso, na seiva em bruto de TMV-infected deixa partículas TMV pode ser observada como flexuosas, em forma de bastonete estruturas após coloração negativa (Fig. 1B). A análise de imagem de 100 partículas de vírus revelou um tamanho médio de 280 nm para o TMV em comprimento e em largura 17nm (Fig. 2). A ultra-estrutura, em células infectadas com TMV e do tamanho dos viriões observados neste estudo revelaram-se de acordo com TMV induzidas propriedades ultra-estruturais do tabaco e o intervalo de tamanho de partículas de TMV previamente relatados na literatura 9-15.
Figura 1. Micrografias electrónicas de transmissão de células infectadas com TMV folha e viriões. A) A imagem mostra a ultra-estrutura das células infectadas TMV mesofilo de folhas de Nicotiana tabacum após microondas preparação assistida planta amostra. Note-se a grande área de viriões alinhadas paralelas que se acumularam no citosol.C = cloroplasto com amido (St), M = mitocôndria, N = núcleo, V = vacúolo, Bar = 2 um. B) A imagem mostra vírions que foram detectados pela coloração negativa na seiva de folhas infectadas.
Figura 2. Tamanho relativo dos virions. Distribuição relativa de comprimento e largura de TMV-partículas após coloração negativa a seiva das folhas infectadas como apareceram no microscópio eletrônico. A média dos valores (média de comprimento / largura de ± desvio padrão) foram calculados a partir de 100 virions.
Discussion
Microondas preparação de amostras assistida planta para TEM tenha sido comprovada a fornecer rápida e confiável de dados ultra-estruturais dentro de algumas horas 3,4,16. A preservação estrutural fina e membranas de organelos alcançadas com o método utilizado no presente estudo foi semelhante para amostras convencionais e cryofixed 5,15, com a vantagem de uma redução drástica na fixação da amostra e incorporação de tempo de 3 dias ou mais, para cerca de 2 horas. Isto representa o protocolo mais rápido para a preparação da amostra TEM actualmente disponíveis na literatura. O método descrito neste estudo combinado de microondas a preparação de amostras para TEM assistida planta com métodos de coloração negativa o que permitiu uma identificação clara e rápida de TMV induzidas alterações ultra-estruturais e do agente viral em si. Alterações ultra-estruturais TMV induzidas poderiam ser investigados após o corte, de corte e de pós-coloração dentro de cerca de 4 horas após o início da fixação na transmissão electron microscópio. Usando o modo de preparação de forma totalmente automática espécime libertou o pesquisador para conduzir coloração negativa no intercalar de modo a determinar o tamanho e largura do que o agente viral. Assim, podemos concluir que este método permite um diagnóstico claro e rápido de doenças de plantas de vírus em cerca de metade de um dia que é de grande importância para uso futuro na agricultura e científica experimentos em planta fitopatologia. Como este método também pode ser utilizado para o diagnóstico rápido de doenças de animais e humanos, tem um grande potencial para aplicação futura em patologia médica e veterinária.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência austríaco (FWF, P20619 e P22988 a BZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
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