Summary
这项研究描述了使用微波设备样品制备透射电子显微镜和负染色方法相结合的方法，允许快速和清晰的大约半天的植物病毒病的诊断。
Abstract
由病毒引起的超微结构变化往往是必要的，清楚地识别植物病毒病的调查。与传统的样品制备透射电子显微镜（TEM），这样的调查需要数天时间，1,2，因此不适合用于植物病毒病快速诊断。微波炉固定可以使用相似的超微结构常规样品制备3-5后所观察到的结果用于TEM调查样品制备时间大幅度减少。许多不同的定制的微波器件是目前可用的，这可用于生物样品用于TEM调查5-8成功地固定和嵌入。在这项研究中，我们表现出对烟草花叶病毒（TMV）感染烟草植物，它有可能在大约半天时间，通过使用微波辅助样品制备的T诊断叶片超微结构的改变EM。我们选择了与市售的微波装置进行本研究，因为它执行几乎完全自动样品制备5相反，其他可用的设备，其中许多步骤仍然要手动执行6-8，因此更费时费力。作为执行剩余的TMV病叶及以下检查超微结构和大小的汁液中的病毒颗粒完全自动染色阴性样品制备过程中可进行固定和嵌入。
Protocol
微波样品制备
- 开始前的样品制备1需要编程的自动微波组织处理电子显微镜（Leica EM AMW的徕卡显微系统，维也纳，奥地利）（表1）微波样品制备TEM以下协议：
表1。样品制备微波辐射的协议。不同的列显示（从左至右）：- 样品瓶号（ 样品瓶的nr个。）代表小瓶被加载到该圆盘传送器的处理器中的顺序。
- 步的实际过程。
- 在小瓶试剂。
- 时间的实际步骤。
- 达到的最高温度，在小瓶中的微波照射之前被关闭。
- 微波辐射设置：连续快速的温度增量酶，保持设定的温度;斜率温和的温度升高，最后结束时达到的温度;脉冲温度迅速上升，电源关闭，直到温度下降5°C，电源恢复达到温度。
- 最大功率的微波辐射。
- 刚准备在样品制备协议（琼脂100环氧树脂见1.7）描述的不同步骤的解决方案，填补他们根据设定的协议（表1）到指定的小瓶，装入小瓶传送带上，然后将圆盘传送带到的微波组织处理器，和最后加载的第一小瓶到单模式室。
- 烟草感染烟草花叶病毒（TMV）用刀片在造型蜡板，60MM索伦森下降了3％的戊二醛（琼脂科学有限公司，斯坦斯特德，英国）切出小部分叶片（1毫米2）磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中，在室温下erature。
- 转移部分用细镊子，立即到指定的篮子的网格宽度约200μm。在彼此顶部堆放的篮子，并将其插入到单声道模式室。必须小心的样品都在不断固定液覆盖在装载和堆叠筐的盖子，使他们不干燥。
- 启动以前编程的微波样品制备协议进行固定，脱水和渗透。
- 虽然样品制备由微波组织处理器自动执行继续与其它的植物材料，如在第3条（负染色）描述的负染色。
- 新鲜制备琼脂100环氧树脂混合作为所述的下列组分：填充24克琼脂100，16克十二碳烯基琥珀酸酐，和10克甲基降冰片烯二酸酐（所有组件看到，斯坦斯特德琼脂科学有限公司，英国）在塑料杯中，热它40°C，拌匀。添加1.2克苄基二甲胺，调匀。到指定的聚合填充琼脂100环氧树脂形成之前的样品制备协议来的端部（例如，在表1中的步骤22）。
- 协议完成后（在表1中的步骤22）后释放的层叠的篮子从单声道模式室到该圆盘传送器的最后小瓶含有渗透的样品。取下转盘微波器件，以便将篮子，并加载它们用细镊子到指定的聚合形式。样品总是覆盖着琼脂100环氧树脂在拆垛和加载，使他们不干燥，必须小心。
- 堆栈彼此的顶部上的聚合形式。必须小心，样品总是覆盖着琼脂100环氧树脂在堆叠和加载，使他们不干燥。
- 删除先前使用的小瓶从传送带的微波TISSUE处理器，加载它堆积的篮子，并插入到的微波组织的处理器的旋转木马。
- 启动预先编程的聚合协议（表1）。
- 虽然聚合时自动进行由微波组织处理器中，用透射电子显微镜检查负染网格[如Philips CM10透射电子显微镜，FEI（前身为飞利浦），埃因霍温，荷兰]，进行图像分析，如在第3和4（描述负染色和图像分析）。
- 协议之后，完成后，除去聚合形式从单声道模式室，拆散聚合形式并删除含有样品的聚合块。它们现在可以用切片机切片。
2。修整和切片
- 插入到单独的采样保持器的一个或多个块与粘附在上面的样本超薄切片约1cm的持有人。
- 修剪块与用于TEM的标本修剪机（例如徕卡赖克特Ultratrim; Leica公司制），使一个块面最大。 1mm的长度和200μm的宽度，其中包含尽可能多叶材料尽可能实现（阻止面部尺寸，可能需要进行调整，以大小的钻石刀）。
- 组块的超薄切片机（如赖克特徕卡ULTRACUT S;徕卡显微系统）通过使用钻石刀，刀角45°（例如，GröplDiatome超45图尔恩，奥地利）。断面的厚度应调整到约70到90nm和切割速度应该是1mm左右/ s的。拿起一个福尔瓦（琼脂科学有限公司）涂层的铜或镍200平方米网格的多个部分。
- 染色后的网格上的各个部分与柠檬酸铅（琼脂科学的有限公司;1.1克柠檬酸铅溶于双蒸水和8毫升42毫升1N氢氧化钠）部分地填充在培养皿中，用NaOH，以创建一个CO 2 -自由5分钟环境和15英里nutes溶解在蒸馏水中，在室温下，用1％乙酸双氧铀（琼脂科学有限公司）。网格用蒸馏水洗净1分钟之间每个后染色步骤。风干在方格框的网格。
- 检查部分用透射电子显微镜（如Philips CM10透射电子显微镜，FEI，艾恩德霍芬，荷兰）。
3。负染色
- 约100mg的烟草花叶病毒感染的叶片材料，制备粗汁液60MMSøfrensen磷酸盐缓冲液（pH值7.2）中100μl的显微镜载片上用刀片2分钟均质材料的收获。
- 20μl的所得到的匀浆转移到第一阱的具有4个或更多的井（或者它也可以转移匀浆一块石蜡）涂特氟隆的显微镜载玻片。
- 顶部与福尔瓦（琼脂科学有限公司）涂层的一面朝向下拉和INCU匀浆放置一个福尔瓦涂覆的网格上大怒5分钟。
- 网格洗净2次，每次2分钟，通过两个滴加入200μl60MM索伦森磷酸盐缓冲液（pH值7.2）的顶部放置网格。
- 孵育网格与新鲜制备的2％磷钨酸（琼脂科学有限公司）60MM索伦森磷酸盐缓冲液（pH为6.5）的溶液中1分钟。
- 删除网格，并让它自然风干即可在方格框。
- 检查网格用透射电子显微镜（如Philips CM10透射电子显微镜; FEI，埃因霍温，荷兰）。以至少10个随机选择的负染病毒粒子的图像（应该是可见的每一个图像上的至少10个或更多的病毒粒子）用透射电子显微镜在初级倍率21000X或更高。必须注意，所有的图像都有相同的放大倍率。
4。图像分析
- 从采取的显微照片测量的长度和宽度中的至少100个随机选择的单个病毒粒子[EG细胞D（奥林巴斯，生命和材料科学欧洲有限公司，汉堡，德国）的粒子分析工具或OPTIMAS 6.5.1负染色样品使用任何图像分析计算机软件（Media Cybernetics的公司，马里兰州贝塞斯达， USA）]。
- 计算平均值和标准偏差，以实现通过负染方法和TEM观察的病毒颗粒的平均长度和宽度。
- 比较长度和超微结构特点（2.5）中获得的文献中已知的，以便清楚地识别病毒疾病引起的病毒病的病毒和超微结构改变大小。
5。代表性的成果：
经过微波样品制备典型的烟草花叶病毒引起的超微结构变化，如大面积的病毒颗粒排列在平行的形式，用透射电子显微镜可以观察到，在细胞质中受感染的抽烟者一个tabacum的细胞（图1A）。此外，在粗汁液TMV-感染叶烟草花叶病毒颗粒可以观察到的曲折，棒状结构负染后（图1B）。图像分析显示100个病毒颗粒的平均尺寸为280nm的长度和17nm的宽度（图2）为TMV。超微结构的烟草花叶病毒感染的细胞和在这项研究中观察到的病毒粒子的大小被认为是根据TMV-诱导的烟草和烟草花叶病毒颗粒的大小范围的超微结构物业先前报道的文献9-15。
图1。透射电子显微镜的烟草花叶病毒感染的叶片细胞和病毒粒子。 A）图片显示TMV感染的叶肉微波设备样品制备后的烟草叶片细胞的超微结构。注意平行对准的病毒粒子在细胞质中积累的大面积的。C = M =线粒体叶绿体与淀粉（ST），N =核，V =液泡，酒吧= 2微米。 B）图像显示在受感染的叶子的汁液通过负染病毒颗粒进行检测。
图2。病毒粒子的相对大小。相对分布的病叶汁液，他们出现在电子显微镜负染后的TMV粒子的长度和宽度。平均值（平均长度/宽度±标准偏差），计算从100病毒颗粒。
Discussion
微波设备已被证实为TEM样品制备提供快速和可靠的超微结构数据在几个小时内3,4,16。本研究中所用的方法取得的细胞器和膜的细微结构保存类似于常规和cryofixed样品5,15与一个巨大的优点是减少在样品固定和嵌入3天或更长的时间从约2小时。这代表目前现有文献中的TEM样品制备最快的协议。本研究中所描述的方法结合微波植物具有负的染色方法允许一个明确的和快速鉴定TMV-诱导的超微结构改建和抗病毒剂本身用于TEM的样品制备。 TMV诱导的超微结构的变化可以进行调查后修剪，切片和染色后，在约4小时内开始后固定在透射电子TRON显微镜。使用完全自动试样制备模式释放研究者在过渡期间进行负染色，以确定病毒剂的大小和宽度。因此，我们可以得出这样的结论：这种方法允许一个明确的和快速诊断的植物病毒病的一半左右，这一天是非常重要的未来在农业和科学实验的植物植物病理学。由于此方法也可用于动物和人类疾病的快速诊断，它有一个大的潜在的未来的应用在医疗和兽医病理学。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由奥地利科学基金会（FWF，P20619，P22988，以BZ）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
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