Summary
我们提出了一种慢病毒基因操纵和单一的嗅觉感官神经元轴突的可视化技术及其终端树枝状
Abstract
一个精确的嗅觉电路的发展依赖于嗅觉的感觉神经元（OSN）轴突在嗅球（OB），突触目标准确的预测。 OSN的轴突的生长和定位的分子机制不能很好地理解。操纵基因的表达和随后的单一的OSN的轴突和他们的终端乔木形态的可视化迄今已具有挑战性。要在规定的时限内的单细胞水平上研究基因的功能，我们开发了基于慢病毒的技术，操纵在体内OSNs的基因表达。慢病毒颗粒，通过显微注射到嗅上皮（OE）的OSNs。表达盒，然后永久地整合到转OSNs基因组。绿色荧光蛋白表达确定感染OSNs，并概述了他们的整个形态，包括轴突终端乔木。由于显微注射和记者检测之间的周转时间短，基因功能研究，可以集中在一个很窄的发展时期。使用这种方法，我们三天内检测GFP的表达，只要3个月以下注射。我们已经取得的过度表达和shRNA慢病毒显微注射介导击倒。这种方法提供了详细的形态在体内的单个细胞水平OSN胞体和轴突，从而使候选基因在嗅觉发展功能特性。
Protocol
1。制备
此过程是生物安全2级，因此，显微注射过程中的生物危害罩以下所有的准备工作 。
- 准备和预热了37 ° C水床：装满水的塑料储物袋 - 清空加热块孵化器的密封和设置。这将使小鼠恢复注射后。
- 填写一个生物危险废物容器的10％漂白水浸泡的所有从这个过程中浪费的一个合适的音量。
- 准备一个小型开放的菜70％的乙醇和在生物安全柜的灭菌ddH2O和地方第二盘。
- 喷涂用70％乙醇的身体和针与柱塞拉出所有的方式，用33号针头消毒一个5μL能力汉密尔顿注射器。反复抽吸乙醇和从盘弹出所有的方式至少5倍。
- 吸入和弹出至少5倍无菌水冲洗注射器墨盒。安全放置注射器抛开文化罩，让其干燥。
- 删除病毒从-80 ° C冰箱储存和冰的地方，让解冻的股票。显微注射需要在10 9传染性单位/ ml滴度的病毒每鼠标股票2μL 。慢病毒可以从商业渠道获得，或在实验室中根据既定的协议（洛伊丝等，2002 ）。
- 准备注射阶段提供罩表面以上提出了一个区域 - 可以使用一个10cm的培养皿中的Kimwipe表盖。
- 安排注射站附近的酒精擦拭。
2。嗅上皮微量注射慢病毒颗粒
所有动物在此方法中执行的程序是根据IACUC批准的指引。 家鼠应变只C57BL/6J这里演示的是在所有的实验中使用的动物模型 。
- 低温笼鼠标小狗（P0 - P3），并把截开5分钟的手套上冰小狗麻醉鼠标幼仔。
- 虽然等待小狗将完全麻醉，消毒汉密尔顿注射器吸病毒的股票2μL。
- 将鼠标小狗注射阶段顶部。从头顶轻轻拉动皮肤，向颈部顶部耳。这应提供在鼻腔讲授皮肤表面，将缓解注射。
- 通过约3mm的皮肤表面以下的鼻腔顶部插入针到达嗅上皮。 Microinject0.5μL病毒解决方案，每拍，选择每边两个站点，左，右（每鼠注射=所需的病毒2μL）。注射部位应错开彼此相隔。针对适当的注射部位，搜索背头骨表面的嗅球的轮廓。此行是在出生时几乎没有可见通过半透明的皮肤和颅骨。为了使每边两个注射，目的只是延髓一个灯泡在中轴大纲一次注射。使第二个灯泡大纲横向插入，但确保内侧角注射，这样您就可以到达嗅上皮，位于腹部下方的灯泡。避免穿透嗅球！
- 吸干任何残留的病毒解决方案或的血液可能会逃脱从注射部位或使用Kimwipe鼻孔开口。立即处置Kimwipes在稀释的漂白液的生物危险容器。
- 广场上的水床孵化器注入鼠标。
- 重复步骤1-4，所有被注入小鼠记住你将需要大约每鼠的病毒库存2μL。
- 让他们返回到原来的筑巢笼前，小鼠恢复30分钟的水床孵化器。
- 在漂白液的生物危险处理处置显微注射阶段，消毒纸巾和任何额外的清洁纸产品。
- 清洁汉密尔顿注射器反复抽吸和乙醇弹射，然后水做的准备步骤。允许注射器干。
- 为了获得最大的转导效率，再次重复这个过程在4个小时。感染OSNs可能在数为3天可视化整个细胞的长度。
3。浮动嗅球部分的免疫组织化学
- 牺牲所需的时间点注入鼠标和灌注4％多聚甲醛的修复组织。解剖出的OB。孵育过夜，然后在多聚甲醛30％蔗糖PBS中过夜。嵌入在OCT包埋剂干冰。
- 日冕的OB的部分获得在使用低温恒温器的60微米的厚度。灯泡部分扫成10cm的培养皿用5ml 1X PBS（pH值7.4）。部分应保持在PBS浮动允许华侨城到Dissolve。转移到一个50ml的锥形瓶中的浮动部分和PBS。
- 允许部分定居瓶底部。关闭PBS真空不吸吮任何部分。用20ml PBS冲洗组织切片。重复定居和吸尘步骤。用10ml PBS悬浮组织和浮动部分转移到免疫锥形瓶15ML。一旦组织切片相继落户，互不干扰组织关闭PBS上清真空。与悬浮部分0.3％的Triton X - 100的1X PBS，pH值7.4（PBS - TX）允许洗涤剂穿孔的细胞膜。孵育10分钟，在室温。关闭真空上清，用PBS - TX重复孵化两次。
- 两个小时在室温下孵育封闭液10毫升（5％马血清的PBS - TX）的组织切片。
- 阻断溶液冲洗，用PBS - TX 15分钟，在室温下，每年至少两次。
- 准备一个初级抗体溶液在PBS - TX 2ML。在本实验中使用的抗体试剂和仪器节。
- 更换第二PBS - Tx的封锁与初级抗体溶液清洗。孵育上一个缓慢摇动的平台（〜30rpm）在4 ° C为24-48小时，以确保彻底渗透到60微米的浮动部分。
- 的主要抗体溶液孵育后，可仔细用吸管检索和存储在4 °重用在两周内两次没有任何重大损失的染色强度
- 清洗部分为20分钟，在室温下轻轻旋转（〜30rpm）在PBS - TX的3倍。
- 准备在PBS的TX二级抗体稀释液2ml。真空最后的清洗，并添加二次抗体溶液组织切片。包装铝箔染色瓶挡光，这可能会导致荧光团的漂白之外。将包裹上一个缓慢摇动的平台，并在4 ° C过夜孵育的小瓶。
- 丢弃吸尘距离的二次抗体溶液。一次20分钟，在室温下用PBS - TX洗净节。冲洗20分钟，在室温下用PBS液（pH 7.4）两个额外的时间。安装玻璃上使用Fluoromount G.的幻灯片染色的组织切片
- 通过荧光显微镜正感染的OSN轴突和轴突总站染色切片的画面。
- 要构造一个一个标记的OSN的轴突和终端乔木三维视图，通过一系列光学部分目标OB组织切片，使用激光共聚焦显微镜（沿Z轴）60微米的深度。
- 随后可以预计这Z的部分图像叠在一起，重建一个360度旋转的角度单个标记的OSN的轴突，包括乔木终端的全部细节。任何一个单一的旋转角度可以被捕获并作为2D格式的演示图像文件（如JPG，TIFF）导出。
4。代表性的成果
这里介绍的方法，我们可以在体内的慢病毒转导的嗅觉感官神经元。我们已与GFP和mCherry荧光记者迄今为止可视感染OSNs，以及与一个myc基因通过免疫组织化学标记的融合蛋白。这种技术提供了大量感染OSNs。尽管如此，转导偶尔出现，足以提供单独标记OSNs，从而使单细胞形态分析。轴突和轴突终末内的OB组织切片成像，共聚焦显微镜（图1）原生环境之中。整个OSN轴突终端乔木，通常可以在40 -50μm的光学部分迷住了。被感染的OSN轴突终端的高倍率允许在肾小球层轴索乔木形态的详细分析。
图1。单一的嗅觉感官神经元轴突和其终端乔木轨迹。A）的一个P7的嗅神经层（ONL）鼠标的嗅球冠状切面免疫染色为OMP（红色）和肾小球层（GL）与两个OMP的免疫染色Vglut2（灰色）。一个单一的嗅觉感官神经元轴突表达GFP（绿色）内ONL移动，并渗透到肾小球结构。 B）轴突终端凉棚内的肾小球形态明确地强调通过GFP的表达。 Vglut2灰色合作染色照明的总glomular面积内GFP阳性轴突阐述终端ABOR。 C）慢病毒感染OSNs OE中的表达GFP（绿色）。嗅上皮cytostructure用DAPI染色（蓝色）。 GFP的表达，允许OSN的胞体和OE中的细胞过程的可视化。 d）一个OSN的轴突和Rap1GAP2表达其终端形态击倒通过的shRNA。 Rap1GAP2的shRNA慢病毒携带鼠标下的U6启动子和GFP下一个双表达盒CMV启动子的OE。感染的嗅觉轴突终端展示一个更加简化的终端乔木相比只能控制的GFP。酒吧=20μm的。
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Discussion
微量注射慢病毒基因结构的永久转会到OSN的基因组DNA的结果。这种方法可以让我们的候选基因进行短期或长期的操作，通过过表达或shRNA介导击倒。此外，我们可以在现有的转基因小鼠，观察气味受体种群的合作本地化荧光标签单OSNs。显微注射是必需的慢病毒转导OSNs。我们曾试图进入鼻腔冲洗慢病毒悬浮导OSNs没有任何成功。因此，我们执行microinjections通过背鼻子表面，以提供病毒的OE OSN的细胞尸体的内层。
有许多优势超过既定的腺病毒操作使用慢病毒。 Lentivral传导整合到基因组的允许长期研究，腺病毒，而只提供有限的基因操纵timecourse（土井等人 ，2005年）瞬时转染。我们侦测到lentivirally转只要显微注射后3个月OSNs。 OSNs在成年啮齿类动物的寿命通常是1-3个月之间。因此，慢病毒感染OSNs可以通过其一生中的大部分的可视化，让OSN的轴突的生长，突触形成和维持，以及嗅觉刺激的反应和周转过程中的调查。此外，慢病毒可以感染祖细胞，并允许更长的时间OSNs的可视化。腺病毒容易transduces OSNs时进入鼻腔注入（赵等人 ，1996年）。然而，腺病毒感染往往是广泛的接触点，并不会产生孤立的单细胞传导作为可靠的慢病毒。 OSNs慢病毒介导的基因操纵，因此一个基因在体内的单个OSNs功能强大的特性和有效的技术。
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Disclosures
该协议是生物安全2级标准。已经建立了相应的所有适当的工作区，保护人身安全，和病毒废物遏制措施。根据IACUC指引，所有动物的程序进行。
Acknowledgments
支持这项研究是由美国国立卫生研究院DC052256和DC006015和NSF 0324769 Qg和T32 - DC008072符合BS。
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06). Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution. Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software. |
References
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- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
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