人类血管周围干细胞用于骨再生

Summary

人体血管周围干细胞（PSCS）是一种新型的干细胞间充质干细胞（MSCs）相似的骨骼组织再生类。物业服务公司可以通过流式细胞仪（荧光激活细胞分选）在标准吸脂程序采购的脂肪组织中分离，然后结合骨修复支架，以达到骨形成

Abstract

分离出人体血管周围干细胞（PSCS）可以从多个组织足够数量的^1-3骨组织工程的目的。物业服务公司是一个'周细胞流式细胞仪排序人口（CD146 + CD34-CD45 - ）和“外膜细胞（CD146的CD34 + CD45-），其中每一个我们曾报告有间质干细胞的特性。产品分成合同，间充质干细胞一样，是能够接受的成骨细胞分化，以及分泌亲成骨细胞因子^1,2。在本议定书中，我们证明在多种动物模型，包括在SCID肌袋植入osteogenicity产品分成合同（严重联合免疫缺陷）小鼠，SCID小鼠颅骨缺损和股骨缺损在athymic大鼠（消防处）。大腿肌肉袋模型，用于评估异位骨形成。颅骨缺损集中在顶骨和标准直径为4毫米（批判地中型^）8。 FSDS是bicortical的的和稳定与聚乙烯栏的K-线^4。消防处的描述，也是一个关键尺寸的缺陷，这并不显着医治自己的^4。相反，如果添加到缺损部位的干细胞或生长因子，可以显着的骨再生赞赏。 PSC的异种移植的总体目标是证明这种细胞类型的成骨能力，在异位和原位骨再生模型。

Protocol

1。血管周围的干细胞的分离

这是在相邻的文章“从人类白色脂肪组织中的血管周围干细胞的分离纯化”详细阐述，由M. Corselli 等。

2。脚手架创作

1. 棚架每先前公布的协议（聚乳酸-乙醇酸）（PLGA的，Burmingham聚合物）与羟基磷灰石涂层^4-6定制。磷灰石涂层PLGA支架的制作从85/15共聚物溶剂浇铸和微粒浸出过程。支架创建肌袋植入术，颅骨植入术，盘状的外形（直径4毫米）或圆柱（4毫米，直径6毫米的长度），股骨缺损的形状为球形（直径2毫米）。
2. 简言之，PLGA /氯仿溶液混合与蔗糖（聚合物/蔗糖比5/95，W / W）200-300微米直径铁氟龙模具创建定制的利弊投truct。冷冻干燥过夜后，支架从聚四氟乙烯模具，并沉浸在DDH ₂解散蔗糖。棚架由70％的乙醇浸泡消毒30分钟，由三个DDH _{2 O}冲洗
3. 磷灰石涂层，模拟体液（SBF）中的解决方案，准备按顺序溶于DDH _{2 O 2}氯化钙，氯化镁·6H _{2 O 3，}碳酸氢钠，和K ₂ HPO _{4•3H 2}加入1M的盐酸，以增加溶解度，溶液的pH值降低到6。添加的Na ₂ SO _4，氯化钾，氯化钠，最终的pH值调整到6.5（SBF中1）。
4. Mg2 +和HCO ₃ -免费模拟体液（SBF中2）准备加入CaCl ₂和K ₂ HPO _{4•3H 2 O的} DDH _2，pH值降低到6。 KCl和NaCl添加和最终的pH值调整到6.8。所有的解决方案是无菌过滤通过0.22微米的PES membrANE（NALGENE）。紧接涂层工艺，干PLGA支架受到辉光放电氩等离子体刻蚀（Harrick科学），以提高润湿性和涂层均匀。
5. 蚀刻支架，然后在SBF 1孵育12小时，并改变对Mg2 +和HCO ₃ -免费SBF的另外12小时在37°C下轻轻搅拌。涂层支架与DDH ₂ O冲洗，以去除多余的负离子和冻干前进一步的研究。

3。肌袋模型植入

1. 100力晶暂停在PBS液（磷酸盐缓冲液）轻轻下降到球形共聚物为基础的种植立即植入前。细胞已被预标记的萤火虫荧光素酶的慢病毒插入，从而允许在体内植入跟踪后。细胞密度为2.5×10％植入^5。
2. 用于免疫缺陷（严重联合免疫缺陷）小鼠6周龄。动物是anesthetized异氟醚吸入和躁动的丁丙诺啡（贝德福德实验室）。标准的优碘制剂后，在后肢的双边切口（纵向长度在2毫米）。
3. 口袋被切断股二头肌肌肉钝性分离肌纤维长轴平行。对于每个鼠标，插入，与产品分成合同为基础的PLGA植入和覆肌肉筋膜缝合用5-0 Vicryl（爱惜康）。
4. 接下来的皮肤封闭在皮下的模式与5-0 Vicryl。对待动物与丁丙诺啡术后48小时内和TMP / SMX为主（甲氧苄啶/磺胺甲恶唑; Qualitest）10天。

4。颅骨缺损模型植入

1. SCID小鼠（12-14周龄）的异氟醚麻醉后，头发被截断，每个协议的优碘消毒皮肤。
2. 一个8毫米的皮肤切口中矢状缝沿鼠标颅骨的。接下来，在calv宋体骨膜轻轻删除由棉条申请。
3. 接下来，用高速牙钻金刚石涂层的环钻位，4毫米的顶骨缺损的创建。缺陷是全厚度 - 然而，护理是采取不伤害底层的硬脑膜。
4. 定制栽种的产品分成合同为基础的共聚物植入然后轻轻地放置在缺损部位。细胞密度为2.5×10％植入^5。最后，皮肤缝合用6-0 Vicryl。动物与丁丙诺啡治疗，术后48小时和TMP / SMX为主的10天。

5。股骨缺损模型植入

1. （12-14周龄）裸鼠大鼠在异氟醚吸入麻醉。股骨擦洗和准备每优碘标准协议（ 图1）。
2. 股骨外侧方面取得了一个-30-27毫米的纵向切口。然后暴露分离股纬度的股骨干eralis和股二头肌肌肉（ 图2）。
3. 为了最大限度地提高骨再生的一致性，覆股骨缺损骨膜完全切除股骨段删除。
4. 聚乙烯板（长度，23毫米，宽4毫米，高4毫米）放在股骨外侧表面。板包含六个预钻孔，以容纳直径为0.9毫米的螺纹克氏针（齐默）。以板为模板，6个螺纹克氏针钻板和两个皮质（ 图3）。
5. 接下来，用一个小的振荡锯片（斯瑞克，MI），创建中期骨干缺损6毫米。然后插入的PLGA已经充满了每个协议的细胞（ 图4）基于植入治疗节段性缺损。
6. 覆肌肉和筋膜4-0的Vicryl吸收缝线关闭到位，以确保植入物，与皮肤缝合。

   6。 在体内评估

   1. 影像学评估在纵向的方式进行，由两个高分辨率的XR和高分辨率μCT（微型​​计算机断层扫描）分析。对于μCT分析（Skyscan 1172F），图像扫描19.73微米（100千伏和100毫安辐射光源，用0.5毫米的铝过滤器）的决议。使用DataViewer的，侦察，CTAN，和CTVol软件分析图像。
   2. 生物发光成像也做了一个串行的方式来评估细胞植入，活力，增殖和排除植入部位的迁移。生物发光成像使用的IVIS Lumina的第二设备（卡尺生命科学版）。光输出被量化的生活图像软件（精诺真）。总的光输出记录在光子/秒/平方厘米/球面度。
   3. 组织学和形态计量学分析进行抛尸。受聘的日常污渍，包括Masson染色，苯胺蓝，Pentachrome，天狼猩红。组织形态计量学的分析是很容易与任何苯胺蓝pentachrome的污渍，骨质深蓝色和黄色，分别出现在其中。在Adobe Photoshop中使用魔棒工具，每高功率场的像素计算。

   7。代表结果

   由于颅骨和股骨缺损的关键尺寸，预计应无显着性愈合，无生长因子或外源性干细胞治疗。

   肌袋清扫手术演习的条款，应是沿筋膜飞机，从而减少出血，应遇到。即使肌袋模型进行双边，鼠标应走便于术后第1天。颅骨缺损，出血遇到，但可以用一个Q尖端浸泡。格外小心，应采取不损害底层硬脑膜 - 因为这会干扰与正常愈合。消防处的模型，护理是采取不损伤主要血管，以免引起出血过多或股神经，以防止神经系统的损害。克氏针钻与温和的压力，以免破坏过程中的骨皮质。

   
   图1。 （消防处）在athymic大鼠股骨缺损的术前准备 。 （12-14周龄）雄性大鼠在异氟醚吸入麻醉。股骨擦洗prepped每晚用优碘的标准协议。

   
   图2。手术暴露股骨缺损（FSD）的创造 。股骨外侧方面取得了一个27-30毫米的纵向切口。股骨干的侧面，然后分离股外侧暴露和股二头肌的肌肉。

   
   图3。内固定治疗股骨缺损（消防处）创建 。聚乙烯板（长度，23毫米，宽4毫米，高4毫米）放在股骨外侧表面。该板块包含6个前钻洞，以容纳直径为0.9毫米的螺纹克氏针。以板为模板，通过六个螺纹克氏针钻板和两个皮质。接下来，创建6毫米中旬骨干缺损。一旦执行，这是一个特制的棚架直接插入，这完全符合缺损部位（未显示）。

   
   图4。颅骨缺损手术的例子 。创建于裸鼠的右顶骨4毫米，圆形颅骨缺损。成像这里是一个缺损部位植入在8个星期术后的产品分成合同。注意内新骨缺损部位的存在。

Discussion

PSCS隔离是很好的描述其他地方^1-3，其中包括一个单独提交的朱庇特的出版物，特别是解决PSC的隔离协议和方法。这篇文章的具体目的是描述和演示3 PSC的协议， 在体内骨形成/再生的应用。 SCID小鼠肌袋是常用描述模型异位人骨形成^7。异位和原位（缺陷）的模型，包括旁互动与宿主骨形成细胞^8，以及丰富的成骨细胞信号的因素目前在骨骼缺陷微骨之间存在重要的差异。两个缺陷在这里，的颅骨defect8和股骨缺损^4。两者都记录是至关重要的大小（即不会自行愈合）。

有趣的差异之间存在颅骨和股骨缺损。首先，细胞的：裸鼠PSC和内源性细胞的细胞之间的相互作用是非常不同的。产品分成合同的颅骨缺损，互动与底层的硬脑膜（最外层的脑膜），以及那些成骨细胞和骨膜细胞circumscribing缺损部位。重要的是，和周围的成骨细胞植入的细胞^8，或植入的细胞和基础硬脑膜（列维等。新闻）之间的相互作用是正常干细胞的关键介导的骨进行。在股骨缺损（消防处），裸鼠的产品分成合同暴露在一个非常不同的细胞和细胞因子的环境。例如，消防处的网站是由骨髓和相应的间充质干细胞，以及内膜，骨膜及长骨成骨细胞。从理论上讲，每个单元有伤害自己的反应，每个人都可能有细胞：与PSC移植瘤细胞的相互作用。

其他明显的差异之间存在颅骨股骨缺损。颅骨骨骼初步形成通过膜内骨化，而通过中间软骨（软骨内骨化）长骨形成。此外，损伤后的修复过程也模仿这些发展的起源。消防处后，被发现，而没有软骨中间形成内顶骨缺损软骨骨痂形成。最后，可能会有所不同胚胎起源的头骨长骨。头骨（ -周细胞-包括血管周围细胞在整个头部区域）大部分是来自神经嵴（mesectoderm），而四肢骨骼的近轴中胚层衍生^9。所有这些差异可能会导致在在力晶介导的骨修复方面的显着性差异。

使用产品分成合同已超过传统的脂肪来源的基质细胞（ASCs的）有几个好处。物业服务公司并不需要文化和纯化细胞人口WHICH不包括其他不参加-甚至可以负调控的基质细胞-内皮细胞，如¹⁰成骨细胞分化。与此相反，例如，ASCs的克隆分析表明，只有一个亚群是能够接受成骨细胞分化的体外 ^11。最终，骨组织工程的努力可能会纳入osteocompetent干细胞与外源性生长因子（如物业服务公司）和骨传导支架（如在本方法中使用的HA-PLGA的），以便以最好的治疗骨缺损。