Brug af menneskelige perivaskulær stamceller til Bone Regeneration

Summary

Humane perivaskulære stamceller (PSC) er en hidtil ukendt stamcelle klasse for knoglevæv regenerering lignende mesenchymale stamceller (MSC'er). PSC kan isoleres ved FACS (fluorescens-aktiveret cellesortering) fra adipøst væv udtages under standardbetingelser fedtsugning procedurer, kombineres derefter med en osteoinducerende stillads for at nå knogledannelse

Abstract

Humane perivaskulære stamceller (PSC) kan isoleres i tilstrækkeligt antal fra flere væv i forbindelse med knoglevæv engineering ^1-3. PSC er en FACS-sorterede population af "pericytes (CD146 + CD34-CD45-) og 'adventitiale celler (CD146-CD34 + CD45-), som hver Vi har tidligere rapporteret at have egenskaber af mesenchymal-stamceller. PSC, som MSC'er, er i stand til at undergå osteogen differentiering, såvel som udskiller pro-osteogene cytokiner ^1,2. I den foreliggende protokol, viser vi osteogenicity af PSC i adskillige dyremodeller, herunder en muskel pose implantation i SCID (svær kombineret immundefekte) mus, en SCID-mus calvariale defekt og en femoralis segmentær defekt (FSD) i athymiske rotter. Lårmusklen pose model anvendes til at vurdere ektopisk knogledannelse. Calvariale defekter er centreret på den parietale knoglen og er standardmæssigt 4 mm i diameter (kritisk størrelse) ^8. FSDs er bicortical og stabiliseret meden polyethylen bar og K-tråde ^4. Den beskrevne FSD er også en kritisk størrelse defekt, som ikke væsentligt hele sin egen ^4. I modsætning hertil, hvis stamceller eller vækstfaktorer tilsættes til det defekte sted, kan signifikant knogleregenerering blive værdsat. Det overordnede mål med PSC xenografting er at demonstrere osteogene evne af denne celletype i både ektopiske og ortotopisk knogle regeneration modeller.

Protocol

1. Perivaskulær Stem Cell Isolation

Dette er beskrevet i detaljer i det tilstødende artiklen "Oprensning af perivaskulære stamceller fra humane hvidt adipost væv", af M. Corselli et al.

2. Stillads Creation

1. Stilladser er skræddersyet pr tidligere offentliggjort protokol fra poly (mælke-co-glycolsyre) (PLGA, Burmingham polymer) med hydroxyapatit coating ^4-6. Apatit-coatede PLGA scaffolds er fremstillet af 85/15 PLGA ved støbning med opløsningsmiddel og et partikelformigt udludningsfremgangsmåde. Stilladser er skabt i en sfærisk form (2 mm diameter) til muskel pose implantation, en skiveform (4 mm i diameter) for calvariale implantation, eller cylindrisk (4 mm i diameter på 6 mm i længde) til femorale segmentdefekter defekter.
2. Kort fortalt PLGA / chloroform opløsninger blandes med saccharose (polymer / saccharose forhold 5/95, vægt / vægt) er støbt ind i en 200-300-um diameter Teflon formen for at skabe de skræddersyede ulempertruct. Efter fryse-tørring natten over, stilladser fjernes fra Teflon formen og nedsænkedes i _ddH2O at opløse saccharose. Stilladser er desinficeret ved nedsænkning i 70% ethanol i 30 minutter, efterfulgt af tre skylninger af Ddh ₂ O.
3. For apatit coating er en simuleret kropsvæske (SBF) opløsning fremstillet ved sekventielt at opløse _CaCl2, MgCl2 • 6H _{H2O, NaHCO3} og _{K2 HPO4} • 3H ₂ O i ddh ₂ O. PH sænkes til 6 ved tilsætning af 1M saltsyre for at forøge opløseligheden. _{Na2 SO4,} KCl, og NaCl tilsættes, og endelig pH indstilles til 6,5 (SBF 1).
4. Mg2 + og HCO ₃ - fri SBF (SBF 2) fremstilles ved tilsætning af _{CaCl2 og} K2 _HPO4 • 3H ₂ O i _ddH2O og pH sænkes til 6. KCI og NaCI tilsættes, og den endelige pH-værdien indstilles til 6,8. Alle opløsninger er sterilfiltreret gennem et 0,22 um PES membrAne (Nalgene). Umiddelbart før belægningsprocessen, er de tørrede PLGA stilladser underkastes glimudladning argon plasmaætsning (Harrick Scientific) for at forbedre befugtning og coating ensartethed.
5. Ætsede stilladser inkuberes derefter i SBF 1 til 12 h og ændret til Mg2 + og HCO ₃ - fri SBF 2 i yderligere 12 timer ved 37 ° C under forsigtig omrøring. Coatede stilladser vaskes med Hedeselskabet ₂ O for at fjerne overskydende ioner og frysetørret forud for yderligere undersøgelser.

3. Musklen Pouch Model Implantation

1. 100 ul af en PSC suspension i PBS (phosphatpufret saltvand) forsigtigt ned på den sfæriske PLGA-baserede implantat umiddelbart før implantering. Cellerne er blevet præ-mærket ved lentiviral insertion af ildflue-luciferase, således at tillade in vivo sporing efter implantation. Celletæthed er 2,5 x 10 ⁵ pr implantat.
2. SCID (svær kombineret immundefekt) mus anvendes ved 6 ugers alderen. Dyr er Anesthetized af isofluran inhalation og præmedicineres med buprenorphin (Bedford Labs). Efter standard Betadine fremstilling er bilaterale indsnit i baglemmer fremstillet (langsgående og 2 mm i længden).
3. Lommerne er skåret i biceps femoris muskler ved stump dissektion parallelt med muskelfibrene længdeakse. For hver mus er PLGA-baserede implantat med PSC indsat, og fascia overliggende musklen sutureres med 5-0 Vicryl (Ethicon).
4. Huden dernæst lukkes med 5-0 Vicryl i en subkutikulær mønster. Dyrene behandles postoperativt med buprenorphin i 48 timer og TMP / SMX (Trimethoprim / sulfamethoxazol; QualiTest) i 10 dage.

4. Den calvariale Defekt Model Implantation

1. Efter isofluran-anæstesi af SCID-mus (12-14 uger gamle), håret klippes og huden desinficeres med betadin per protokol.
2. En 8 mm hud incision langs midten sagittale sutur af muse calvarium. Dernæst calvarial periosteum forsigtigt fjernet ved Q-tip ansøgning.
3. Dernæst anvendelse diamantbelagt trepanen bit i en højhastigheds-tandlægebor er en 4 mm parietale knogledefekt skabt. Defekten er fuld tykkelse - men omhu for ikke at skade den underliggende dura mater.
4. Den specialfremstillede PLGA-baserede implantat med indpodede PSC placeres derefter forsigtigt i det defekte område. Celletæthed er 2,5 x 10 ⁵ pr implantat. Endelig huden sutureres med 6-0 Vicryl. Dyrene behandles postoperativt med buprenorphin i 48 timer og TMP / SMX i 10 dage.

5. Den Femoral segmentdefekt Model Implantation

1. Athymiske rotter (12-14 uger gamle) bedøves under isofluran inhalation. Femur er skrubbet og forberedt pr standardprotokol med betadin (figur 1).
2. En 27-30-mm længde incision over den anterolaterale af lårbenet. Lårbensskaftet eksponeres derefter ved adskillelse af vastus lateralis og biceps femoris muskler (figur 2).
3. For at maksimere konsistens knogleregenerering er periosteum overliggende femorale defekten fuldstændigt fjernet med den resekterede femorale segment.
4. En polyethylen plade (længde 23 mm, bredde, 4 mm, højde, 4 mm) anbringes på den anterolaterale overflade af femur. Pladen indeholder seks forborede huller til at rumme 0,9 mm i diameter gevind Kirschner tråde (Zimmer). Idet pladen som en template, er der seks gevindskårne Kirschner ledninger boret gennem pladen, og begge cortex (figur 3).
5. Dernæst med en lille oscillerende savblad (Stryker, MI), er en 6 mm midten diafyseal defekt skabt. Segmentariske defekter behandles derefter ved indføring af PLGA-baserede implantater, der er blevet fyldt med celler, som pr protokol (figur 4).
6. Den overliggende muskler og fascia er lukket med 4-0 Vicryl absorberbare suturer for at fastgøre implantatet på plads, og huden sutureres.

   6. In vivo-vurderinger

   1. Radiografiske vurdering udføres i et langsgående måde ved både høj opløsning XR og høj opløsning μCT (mikro computertomografi) analyse. For μCT analyse (Skyscan 1172F), der scannes med en opløsning af 19,73 um (100 kV og 100 mA strålingskilden ved anvendelse af en 0,5 mm aluminium filter). Billeder analyseres ved hjælp af DataViewer, Recon, CTAN, og CTVol software.
   2. Bioluminescens billeddannelse udføres også på en seriel måde at vurdere celle transplantation, levedygtighed, proliferation og udelukker migrering ud af implantatstedet. Bioluminescence billedbehandling udføres ved hjælp af en IVIS Lumina II-enhed (Caliper Life Sciences). Lette udgange kvantificeres ved hjælp af levende billede software (Xenogen). Alt lys produktionen registreres i fotoner / sekund / sq cm / steradian.
   3. Histologiske og histomorfometrisk analyse udføres postmortem. Rutine, der anvendes pletter indbefatter Massons trichrom, anilin blå, s.entachrome og Picrosirius rød. Histomorfometriske analyse udføres let med enten anilin blå eller pentachrome pletter, hvor osteoid synes mørk blå og gul, hhv. Pixels per høj powered område er beregnet ved hjælp af værktøjet Tryllestav i Adobe Photoshop.

   7. Repræsentative resultater

   Både som calvariale og femorale defekter er kritiske størrelse, bør ingen signifikant heling forventes uden behandling med vækstfaktorer eller exogene stamceller.

   I form af kirurgiske manøvrer, bør musklen posen dissektion være langs fascial fly og dermed minimal blødning bør forekomme. Selvom musklen pose modellen udføres bilateralt, skal musen være at gå med lethed den postoperative dag 1. For calvariale defekt, er blødning stødt, men kan lægges i blød med en Q-tip. Extreme man skal passe ikke at skade den underliggende dura mater - da dette vil forstyrremed normal heling. For FSD model er omhu for ikke at skade de store blodkar, for ikke at forårsage overdreven blødning eller den femorale nerve at forhindre neurologisk beskadigelse. Kirschner ledninger er boret med et let tryk for ikke at beskadige den korticale knogle i processen.

   
   Figur 1. Præoperativ præparat til Femoral segmentdefekt (FSD) på athymiske rotter. Hanrotter (12-14 uger gamle) bedøves under isofluran inhalation. Den lårben er skrubbet og prepped per standard protokol med betadin.

   
   Figur 2. Kirurgisk eksponering for Femoral Segmentoplysninger Defect (FSD) skabelse. En 27 til 30 mm indsnit foretages i den anterolaterale af lårbenet. Den laterale side af lårbensskaftet udsættes derefter ved adskillelse af vastus lateralisog biceps femoris muskler.

   
   Figur 3. Fiksering for Femoral Segmentoplysninger Defect (FSD) skabelse. En polyethylen plade (længde 23 mm, bredde, 4 mm, højde, 4 mm) anbringes på den anterolaterale overflade af femur. Pladen indeholder seks forborede huller til at rumme 0,9 mm i diameter gevind Kirschner tråde. Idet pladen som en template, er der seks gevindskårne Kirschner ledninger boret gennem pladen, og begge cortex. Dernæst bliver en 6 mm midten diafyseal defekt skabt. Når dette er udført, er en skræddersyet stillads direkte indsat som præcist passer til defekte sted (ikke vist).

   
   Figur 4. Eksempel calvariale defekt Postoperativ. En 4 mm, cirkulært calvariale defekt er skabt i højre parietal knogle i atymiske mus. Billedbærende her er et defektsted implanteret medPSC på 8 uger efter operation. Konstatere tilstedeværelsen af ​​ny knogle på det defekte sted.

Discussion

Isoleringen af PSC er godt beskrevet andetsteds ^1-3, herunder et separat indsendt JOVE publikation der specifikt henvender sig PSC isolation protokoller og metoder. Det konkrete formål med denne artikel er at beskrive og demonstrere 3 protokoller for PSC in vivo ansøgning om knogledannelse / regenerering. SCID mus musklen posen er en almindeligt beskrevne model for ektopisk human knogledannelse ^7. Væsentlige forskelle mellem ektopiske og orthotopisk (defekt) modeller for knogle, herunder parakrin interaktion med værts knogledannende celler ⁸ samt en overflod af osteogene signalering faktorer er til stede i skelettet defekten mikromiljø. To fejl er præsenteret her, en calvariale defect8 og femoralis segmentdefekt ^4. Begge er veldokumenteret at være kritisk størrelse (dvs. ikke helbrede alene).

Interessante forskelle mellem calvariale og femoral defekter. For det førstecelle: celle interaktion mellem xenotransplanteret PSC og endogene celler er meget anderledes. I form af en calvariale defekt, interagerer PSC med den underliggende dura mater (det yderste lag af meninges), såvel som de osteoblaster og periosteale celler omgiver det defekte sted. Vigtigt, at interaktionen mellem implanterede celler og omgivende osteoblaster ⁸ eller implanterede celler og underliggende dura (Levi et al., I trykken) er kritiske for normal stamcelle medieret osteogenese at fortsætte. I form af den femorale segmentdefekt (FSD), der xenotransplanteret PSC udsat for en meget anderledes celle og cytokin miljø. For eksempel er FSD stedet sammensat af marv og ledsagende mesenchymale stamceller, såvel som endosteum, periosteum og lange knogler osteoblaster. Teoretisk hver celle har sin egen reaktion på læsion, og hver kan have celle: celleinteraktioner med PSC xenotransplantater.

Andre tydelige forskelle mellem calvarialeog femorale defekter. De calvariale knogler indledningsvis dannelse gennem intramembranous forbening, medens de lange knogler form gennem en brusk mellemprodukt (endochondral ossifikation). Desuden reparative proces efter skaden også efterligner disse udviklingsmæssige oprindelse. Post-FSD er brusk callusdannelse observeret, hvorimod ingen brusk mellemprodukt dannet i en parietal knogledefekt. Endelig kan den embryoniske oprindelse kraniet adskiller sig fra de lange knogler. Størstedelen af kraniet (herunder perivaskulære celler - pericytes - i hele hovedet region) er afledt af crista neuralis (mesectoderm), mens appendicular skelet er paraksiale mesoderm afledning ^9. Alle disse forskelle kan medføre betydelige forskelle med hensyn til PSC-medieret knogle reparation.

Brugen af ​​PSC har flere fordele i forhold til de traditionelle fedt-afledte stromale celler (ASC). PSC ikke kræver kulturen og er en oprenset cellepopulation which omfatter ikke andre stromale celler, som ikke deltager i - og kan endda negativt regulere - osteogen differentiering, såsom endotelceller ^10. I modsætning hertil, for eksempel klonale analyser af ASC'er viser, at kun en subpopulation er i stand til at undergå osteogen differentiering in vitro ^11. I sidste ende vil knoglevæv teknik indsatsen kan inkorporere en osteocompetent stamcelle (såsom PSC) med exogene vækstfaktorer og en osteokonduktivt stillads (såsom HA-PLGA anvendes i de foreliggende fremgangsmåder), således at den bedste helbrede skelet defekter.