El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Summary

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de hueso

Abstract

Las células madre perivasculares (PSC) puede ser aislado en un número suficiente de múltiples tejidos para fines de tejido esquelético ingeniería ^1-3. PSC son una población FACS-ordenados de 'pericitos' (CD146 + CD34-CD45-) y de células adventicias (CD146-CD34 + CD45-), cada uno de los cuales ya hemos informado que tienen propiedades de las células madre mesenquimales. PSC, como MSC, son capaces de someterse a la diferenciación osteogénica, así como secretan pro-osteogénico ^1,2 citoquinas. En el presente protocolo, se demuestra la osteogenicity del PSC en varios modelos animales, incluyendo un implante de bolsa muscular en SCID (inmunodeficiencia combinada severa) en ratones, un defecto del ratón SCID del calvario y un defecto femoral segmentaria (FSD) en ratas atímicos. El músculo del muslo modelo de bolsa se utiliza para evaluar la formación de hueso ectópico. Defectos de calota se centran en el hueso parietal y son de forma estándar de 4 mm de diámetro (tamaño crítico) ^8. FSD son bicortical y se estabilizan conuna barra de polietileno y ⁴ K-cables. El FSD descrito es también un defecto de tamaño crítico, que no curan significativamente en su propio ^4. Por el contrario, si las células madre o factores de crecimiento son añadidos al sitio del defecto, la regeneración ósea significativa se puede apreciar. El objetivo general de xenoinjerto PSC es demostrar la capacidad osteogénica de este tipo de células en modelos de regeneración tanto ectópicos y hueso ortotópico.

Protocol

1. Stem Cell perivascular aislamiento

Esto se describe en detalles en el artículo adyacente "La purificación de las células madre de tejido humano perivasculares adiposo blanco", por M. Corselli et al.

2. Andamio Creación

1. Los andamios están hechos a medida de acuerdo al protocolo previamente publicado a partir de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, Burmingham polímero) con recubrimiento de hidroxiapatita ^4-6. Apatito recubiertos andamios PLGA se fabrican a partir de 85/15 PLGA por moldeo con disolvente y un proceso de lixiviación de partículas. Los andamios se crean en una forma esférica (2-mm de diámetro) para la implantación músculo bolsa, una forma discoidal (4 mm de diámetro) para la implantación calota, o cilíndricas (4 mm de diámetro, 6 mm de longitud) para femorales defectos segmentarios.
2. En pocas palabras, PLGA / cloroformo soluciones mezclada con sacarosa (polímero / proporción de sacarosa 5/95, w / w), se han puesto en un diámetro de 200 a 300 micras-molde de teflón para crear los contras a la medidatruct. Tras la liofilización, durante la noche, los andamios se retira del molde de teflón y se sumergió en ddH ₂ O para disolver la sacarosa. Los andamios son desinfectadas por inmersión en etanol al 70% durante 30 minutos, seguido de tres lavados de ddH ₂ O.
3. Para el revestimiento de la apatita, un cuerpo simulado una solución líquida (SBF) se prepara disolviendo de forma secuencial _CaCl2, MgCl2 • 6H ₂ O, NaHCO ₃ y K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O en ddH ₂ O. PH de la solución se reduce a 6 por adición de ácido clorhídrico 1M para aumentar la solubilidad. Na ₂ SO _4, KCl, NaCl y se añaden y el pH final se ajustó a 6,5 (SBF 1).
4. Mg2 + y HCO ₃ - libre SBF (SBF 2) se prepara mediante la adición de CaCl ₂ y K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O en ddH ₂ O y el pH se reduce a 6. KCl y NaCl se añaden y el pH final se ajustó a 6,8. Todas las soluciones son estériles filtró a través de un membr micras 0,22 PSAAne (Nalgene). Inmediatamente antes del proceso de recubrimiento, las secas andamios PLGA se someten a descarga luminiscente de plasma de argón grabado (Harrick Scientific) para mejorar la humectación y la uniformidad de recubrimiento.
5. Andamios Etched se incuban en SBF 1 durante 12 horas y cambió a Mg2 + y HCO ₃ - libre SBF 2 para otra h 12 a 37 ° C bajo agitación suave. Andamios recubiertas se lavan con ddH ₂ O para eliminar el exceso de iones y se liofilizó antes de estudios adicionales.

3. La bolsa muscular modelo de implantación

1. 100 l de una suspensión PSC en PBS (tampón fosfato salino) son suavemente dejó caer en el esférico PLGA basada implante inmediatamente antes de la implantación. Las células han sido pre-etiquetados por inserción lentiviral de luciferasa de luciérnaga, que permitan la implantación posterior en vivo de seguimiento. La densidad celular es de 2,5 x 10 ⁵ por implante.
2. SCID (inmunodeficiencia combinada severa) los ratones se utilizan a las 6 semanas de edad. Los animales son anestesiathetized por inhalación isoflurano y premedicados con buprenorfina (Laboratorios Bedford). Después de la preparación de Betadine estándar, incisiones bilaterales en las patas traseras están hechas (longitudinal y 2 mm de longitud).
3. Los bolsillos están cortados en los músculos bíceps femoral mediante disección roma en paralelo al eje de la fibra muscular de largo. Para cada ratón, el implante de PLGA-basado con PSC se inserta, y la fascia que recubre el músculo se sutura con Vicryl 5-0 (Ethicon).
4. La piel está próxima cerrado con 5-0 Vicryl en un patrón subcuticular. Los animales son tratados con buprenorfina después de la operación durante 48 horas y TMP / SMX (TMP / SMX; Qualitest) durante 10 días.

4. El defecto del calvario de implantación del modelo

1. Después de la anestesia con isoflurano de ratones SCID (12-14 semanas de edad), el pelo se recorta y la piel desinfectada con betadine por protocolo.
2. Una incisión en la piel 8-mm está hecho a lo largo de la sutura sagital medio de la bóveda craneal del ratón. A continuación, el CALVarial periostio se quita suavemente por Q-tip aplicación.
3. A continuación, utilizando adiamantadas bits de trepanación en un taladro dental de alta velocidad, un defecto parietal 4-mm hueso se crea. El defecto es de espesor total - sin embargo se tiene cuidado de no lesionar la duramadre subyacente.
4. El producto a medida PLGA basada implante con PSC injertadas se coloca entonces suavemente en el sitio del defecto. La densidad celular es de 2,5 x 10 ⁵ por implante. Por último, la piel se suturó con Vicryl 6-0. Los animales son tratados con buprenorfina después de la operación durante 48 horas y TMP / SMX durante 10 días.

5. El femoral defecto segmentario implantación de modelos

1. Ratas atímicos (12-14 semanas de edad) son anestesiados bajo inhalación de isoflurano. El fémur se limpia y preparada según el protocolo estándar con betadine (Figura 1).
2. Se hace una incisión longitudinal de 27 a 30 mm se realiza sobre la cara anterolateral del fémur. El eje femoral está expuesto a continuación, mediante la separación de la latitud vastoeralis y los músculos bíceps femoral (Figura 2).
3. Para maximizar la consistencia de la regeneración ósea, el periostio que recubre el defecto femoral se elimina por completo con el segmento resecado femoral.
4. Una placa de polietileno (longitud, 23 mm; ancho, 4 mm, altura, 4 mm) se coloca sobre la superficie anterolateral del fémur. La placa contiene seis agujeros previamente perforados para dar cabida a los cables de 0,9 mm de diámetro de rosca de Kirschner (Zimmer). Tomando la placa como una plantilla, seis alambres de Kirschner roscados se perforan a través de la placa y ambas corticales (Figura 3).
5. A continuación, con una pequeña hoja de sierra oscilante (Stryker, MI), un niño de 6 mm a mediados de la diáfisis defecto se crea. Defectos segmentarios se tratan a continuación por la inserción de los implantes de PLGA basados ​​en que han sido cargados con células según el protocolo (Figura 4).
6. El músculo y la fascia suprayacente se cierra con suturas absorbibles Vicryl 4-0 para asegurar el implante en su lugar, y la piel se sutura.

   6. En estudios in vivo

   1. Evaluaciones radiográficas se realizan en forma longitudinal por tanto alta resolución XR y de alta resolución μCT (micro tomografía computarizada) análisis. Para el análisis de μCT (Skyscan 1172F), las imágenes son escaneadas a una resolución de 19.73 m (100 kV y 100 mA fuente de radiación, utilizando un filtro de 0,5 mm de aluminio). Las imágenes se analizaron mediante DataViewer, Recon, CTAN, y programas de CTVol.
   2. Imágenes de bioluminiscencia también se hace en forma secuencial para evaluar el injerto de células, la viabilidad, proliferación y no incluyen la migración fuera de la zona del implante. Imágenes de bioluminiscencia se realiza mediante un dispositivo de IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Salidas de luz se cuantificó usando el software Image Vida (Xenogen). Salida de luz total se registra en forma de fotones por segundo / sq cm / estereorradián.
   3. El análisis histológico e histomorfométrico se realiza post-mortem. Tinciones de rutina empleadas incluyen tricrómico de Masson, azul de anilina, pentachrome y rojo Picrosirius. El análisis histomorfométrico se lleva a cabo fácilmente, ya sea con azul de anilina o manchas pentachrome, en el que osteoide aparece de color azul oscuro y amarillo, respectivamente. Píxeles por campo de alta potencia se calculan utilizando la herramienta Varita mágica en Adobe Photoshop.

   7. Los resultados representativos

   Dado que tanto los defectos craneales y femorales son críticos de tamaño, no hay curación significativa se debe esperar sin tratamiento con factores de crecimiento exógenos o células madre.

   En cuanto a las maniobras quirúrgicas, la disección bolsa muscular debe ser a lo largo de planos fasciales y por lo tanto sangrado mínimo debe ser encontrado. A pesar de que el modelo de bolsa muscular se lleva a cabo bilateralmente, el ratón debe caminar con facilidad el primer día postoperatorio 1. Por el defecto craneal, hemorragia se encuentra, pero puede ser empapado con un Q-tip. El cuidado extremo debe tener cuidado de no lesionar la duramadre subyacente - ya que esto va a interferircon la curación normal. Para el modelo de FSD, se tenga cuidado de no lesionar los vasos sanguíneos grandes a fin de no causar sangrado excesivo o el nervio femoral para evitar el daño neurológico. Alambres de Kirschner se perforan con una presión suave para no dañar el hueso cortical en el proceso.

   
   Figura 1. La preparación preoperatoria de defecto segmentario femoral (FSD) en ratas atímicos. Las ratas macho (12-14 semanas de edad) son anestesiados bajo inhalación de isoflurano. El fémur se limpia y se prepara según el protocolo estándar con betadine.

   
   Figura 2. La exposición quirúrgica de defectos segmentales femoral (FSD) la creación. Se hace una incisión longitudinal de 27 a 30 mm se realiza sobre la cara anterolateral del fémur. La cara lateral de la caña femoral se expone entonces separando el vasto lateraly los músculos bíceps femoral.

   
   Figura 3. La fijación femoral de defecto segmentario (FSD) la creación. Una placa de polietileno (longitud, 23 mm; ancho, 4 mm, altura, 4 mm) se coloca sobre la superficie anterolateral del fémur. La placa contiene seis agujeros previamente perforados para dar cabida a los cables de 0,9 mm de diámetro de rosca de Kirschner. Tomando la placa como una plantilla, seis alambres de Kirschner roscados se perforan a través de la placa y cortezas ambos. A continuación, una de 6 mm a mediados de la diáfisis defecto se crea. Una vez que esto se realiza, un andamio a medida que se insertan directamente que encaja exactamente el sitio del defecto (no mostrado).

   
   Figura 4. Ejemplo de defecto postoperatorio del calvario. A 4 mm, un defecto del calvario circular se creó en el hueso parietal derecho en ratones atímicos. Toma de imágenes de aquí es un sitio del defecto implantado conPSC a las 8 semanas postoperatorias. Tenga en cuenta la presencia de hueso nuevo en el sitio del defecto.

Discussion

El aislamiento del PSC está bien descrito en otra parte ^03.01, incluyendo una publicación por separado Jove presentó específicamente a los protocolos de aislamiento del PSC y los métodos. El propósito específico de este artículo es describir y demostrar 3 protocolos de PSC en la aplicación in vivo para la formación de hueso / regeneración. La bolsa muscular de ratón SCID es un modelo comúnmente descrito para la formación ectópica de hueso humano ^7. Existen importantes diferencias entre ectópicos y ortotópico (defecto) los modelos de los huesos, incluyendo la interacción con los receptores que forman paracrina ósea las células ^8, así como una gran cantidad de factores osteogénicos de señalización presentes en el microambiente del defecto óseo. Dos defectos se presentan aquí, un defect8 calota y el defecto femoral segmentaria ^4. Ambos están bien documentados a ser crítico de tamaño (es decir, no se curan por sí solas).

Existen diferencias interesantes entre los defectos craneales y femorales. En primer lugar, elcelular: la interacción entre las células y las células PSC xenoinjertados endógenos es muy diferente. En términos de un defecto craneal, PSC interactuar con la duramadre subyacente (la capa más externa de las meninges), así como aquellos osteoblastos y células periósticos que circunscriben el sitio del defecto. Es importante destacar que la interacción entre las células implantadas y los osteoblastos que rodean ^8, o de las células implantadas y que subyace a la duramadre (Levi et al., En prensa) son fundamentales para la célula madre normal mediada la osteogénesis para continuar. En términos del defecto femoral segmentaria (FSD), PSC xenoinjertados están expuestos a una celda muy diferente y el medio ambiente de citoquinas. Por ejemplo, el sitio FSD se compone de las células madre de médula ósea y de acompañamiento mesenquimales, así como el endostio, periostio y los osteoblastos de huesos largos. En teoría, cada célula tiene su propia reacción a una lesión, y cada uno puede tener de células: las interacciones celulares con xenoinjertos PSC.

Otras claras diferencias existen entre la calotay los defectos femorales. Los huesos craneales inicialmente forman a través de osificación intramembranosa, mientras que los huesos se forman largas a través de un intermedio de cartílago (osificación endocondral). Por otra parte, el proceso de reparación después de la lesión también imita estos orígenes evolutivos. Después de la FSD, la formación de cartílago de callos se observa, mientras que no intermedia del cartílago se forma dentro de un defecto de hueso parietal. Finalmente, el origen embrionario del cráneo puede diferir de la de los huesos largos. La mayoría del cráneo (incluyendo las células perivasculares - pericitos - en la región de la cabeza entera) se deriva de la cresta neural (mesectoderm), mientras que el esqueleto apendicular es de derivación mesodermo paraxial ^9. Todas estas diferencias pueden resultar en diferencias significativas en cuanto a la reparación ósea mediada por PSC.

El uso de la PSC tiene varias ventajas sobre los tradicionales derivadas de tejido adiposo células del estroma (ASC). PSC no requieren de la cultura y son una población de células purificadas WHIch no incluye otras células del estroma que no participan en el - e incluso se puede regular negativamente - la diferenciación osteogénica, como las células endoteliales ^10. En contraste, por ejemplo, los análisis clonales de ASCs muestran que sólo una subpoblación son capaces de experimentar diferenciación osteogénica in vitro ^11. En última instancia, los esfuerzos de ingeniería de tejidos esqueléticos probable que incorpore una célula madre osteocompetent (como PSC) con factores de crecimiento exógenos y un osteoconductivo andamio (tales como HA-PLGA utilizada en los presentes métodos) para curar mejor defectos óseos.