Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Summary

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu erreichen

Abstract

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) können in ausreichender Zahl aus verschiedenen Geweben zum Zwecke der Skelett-Tissue-Engineering ^3.1 isoliert werden. PSCs sind FACS-sortierten Population von "Perizyten" (CD146 + CD34-CD45-) und "Adventitia-Zellen" (CD146-CD34 + CD45-), jeder von denen wir bereits berichtet haben, um die Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen. PSCs, wie MSCs können osteogene Differenzierung sowie sezernieren pro-osteogene Cytokine ^1,2 unterzogen. Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir den osteogenicity von PSCs in mehreren Tiermodellen einschließlich eines Muskels Beutel Implantation in SCID (severe combined immundefizienten) Mäuse, eine SCID-Maus Kalvariamodell Defekt und einen femoralen segmentalen Defekt (FSD) in athymischen Ratten. Der Oberschenkelmuskel Beutel Modell wird verwendet, um ektopische Knochenbildung zu beurteilen. Kalvariamodell Defekte sind auf dem Scheitelbein zentriert und sind standardmäßig 4 mm im Durchmesser (kritisch Größe) ^8. FSDs sind bikortikale stabilisiert und sind mitein Polyethylen-Bar und K-Drähte ^4. Der FSD beschrieben ist auch eine kritische Größe Defekt, der nicht wesentlich auf seine eigenen ^vier heilen. Im Gegensatz dazu, wenn Stammzellen oder Wachstumsfaktoren der defekten Stelle hinzugefügt wurden, können signifikante Knochenregeneration geschätzt. Das übergeordnete Ziel der PSC Xenografting ist es, das osteogene Potenzial dieser Zellart in beide ektopen und orthotopen Knochenregeneration Modelle zu demonstrieren.

Protocol

1. Perivaskuläre Stammzellisolation

Dies wird in Einzelheiten in der nebenstehenden Artikel "Die Reinigung von Perivaskuläre Stammzellen aus menschlichen weißen Fettgewebe" beschrieben, vertreten durch M. CORSELLI et al.

2. Scaffold Creation

1. Gerüste sind an zuvor veröffentlichten Protokolls aus Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA, Burmingham Polymer) mit Hydroxyapatit-Beschichtung ^4-6 Maß. Apatit-beschichteten PLGA Gerüste werden von 85/15 PLGA im Gießverfahren und einem teilchenförmigen Laugung hergestellt. Gerüste sind in einer sphärischen Form (2 mm Durchmesser) für Muskel Beutel Implantation, eine Scheibenform (4 mm Durchmesser) für Calvaria Implantation oder zylindrische (4 mm Durchmesser, 6 mm Länge) für femorale Segmentdefekten erstellt.
2. Kurz gesagt, PLGA / Chloroform-Lösungen mit Saccharose (Polymer / Saccharose-Verhältnis 5/95, w / w) gemischt werden, in einen 200-300-Mikrometer Durchmesser Teflonform, um die maßgeschneiderte Nachteile schaffen gegossentruct. Nach dem Gefriertrocknen über Nacht werden die Gerüste aus Teflon-Form entfernt und in ddH ₂ O, um die Saccharose zu lösen. Gerüste werden durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 min desinfiziert, gefolgt von drei Spülungen ddH ₂ O.
3. Für Apatit-Beschichtung wird ein simulierter Körperflüssigkeit (SBF) Lösung durch sequentielles Lösen von CaCl _2, MgCl 2 • 6H ₂ O, NaHCO ₃ und K ₂ HPO ₄ • 3 H ₂ O in ddH ₂ O. vorbereitet Lösung auf pH 6 mit indem 1 M Salzsäure zur Erhöhung der Löslichkeit verringert. Na ₂ SO _4, KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,5 (SBF 1) eingestellt.
4. Mg2 + und HCO ₃ - frei SBF (SBF 2) wird durch Zugabe von CaCl ₂ und K ₂ HPO ₄ • 3 H ₂ O in ddH ₂ O und pH-Wert auf 6 gesenkt vorbereitet. KCl und NaCl zugegeben und der End-pH auf 6,8 eingestellt. Alle Lösungen sind steril durch eine 0,22 um PES Membr gefiltertane (Nalgene). Unmittelbar vor dem Beschichten werden die getrockneten PLGA Gerüsten Glimmentladung Argon-Plasma-Ätzen (Harrick Scientific) unterzogen, um die Benetzung und Beschichtungsgleichmäßigkeit zu verbessern.
5. Geätzte Gerüste werden dann in SBF 1 für 12 h inkubiert und geändert werden, um Mg 2 + und HCO ₃ - freien SBF 2 für weitere 12 h bei 37 ° C unter leichtem Rühren. Beschichtete Gerüste werden mit ddH ₂ O gewaschen, um überschüssige Ionen zu entfernen und lyophilisiert vor der weiteren Untersuchungen.

3. Das Muscle Pouch Modell Implantation

1. 100 ul einer PSC-Suspension in PBS (Phosphate Buffered Saline) werden vorsichtig auf die sphärische PLGA-basierte Implantat unmittelbar vor der Implantation gesunken. Die Zellen wurden durch lentiviralen Einsetzen der Firefly-Luciferase voretikettiert, um in vivo nach der Implantation Tracking zu ermöglichen. Die Zelldichte von 2,5 x 10 ⁵ pro Implantat.
2. SCID (severe combined immundefizienten) Mäuse werden am Alter von 6 Wochen eingesetzt. Die Tiere sind Anesthetized durch Einatmen und Isofluran Prämedikation mit Buprenorphin (Bedford Labs). Nach dem Standard-Betadin Herstellung werden die bilateralen Einschnitte in den hinteren Gliedmaßen aus (Längs-und 2 mm in der Länge).
3. Taschen sind in den Bizeps femoris durch stumpfe Präparation parallel zur Muskelfaser langen Achse geschnitten. Für jede Maus, wird das PLGA-basierte Implantat mit PSCs eingeführt und der Faszie des Muskels mit 5-0 Vicryl (Ethicon) vernäht.
4. Die Haut wird mit 5-0 Vicryl nächste in einer subkutanen Muster geschlossen. Für 10 Tage; Tiere sind postoperativ mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX (Qualitest Trimethoprim / Sulfamethoxazol) behandelt.

4. Die Schädeldecken Defektmodell Implantation

1. Nach Isofluran-Narkose von SCID-Mäusen (12-14 Wochen alt), wird das Haar geschoren und die Haut mit Betadine pro Protokoll desinfiziert.
2. Ein 8-mm Hautschnitt entlang der Mitte Pfeilnaht der Maus Kalotte hat. Als nächstes wird die calvArial Periost wird sanft von Q-Tip-Anwendung entfernt.
3. Dann wurde unter Verwendung diamantbeschichteten Trephine Bits in einem Breitband-Dentalbohrers wird ein 4-mm-parietalen Knochendefekt erstellt. Der Defekt ist voller Stärke - aber nicht darauf geachtet wird, um die darunterliegende Dura mater zu verletzen.
4. Der maßgefertigte PLGA-basierte Implantat mit eingepflanzten PSCs wird dann vorsichtig in der defekten Stelle platziert. Die Zelldichte von 2,5 x 10 ⁵ pro Implantat. Schließlich wird die Haut mit 6-0 Vicryl vernäht. Die Tiere werden nach der Operation mit Buprenorphin für 48 Stunden und TMP / SMX für 10 Tage behandelt.

5. Der Femur segmentalen Defekt Modell Implantation

1. Athymischen Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und zubereitete pro Standard-Protokoll mit Betadine (Abbildung 1).
2. Ein 27-30-mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Der Femurschaft wird dann durch die Trennung der vastus lat. ausgesetzteralis und M. biceps femoris (Abbildung 2).
3. Um die Konsistenz der Knochenregeneration zu maximieren, wird das Periost über der femoralen Defekt vollständig mit der resezierten femoralen Segment entfernt.
4. Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte (Zimmer) unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales (Abbildung 3) niedergebracht.
5. Als nächstes wird mit einer kleinen oszillierenden Sägeblatt (Stryker, MI) wird eine 6-mm-Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Segment Defekte werden dann durch die Insertion von PLGA Implantaten auf die beladen worden mit Zellen gemäß Protokoll (4) behandelt wurden.
6. Die darüber liegende Muskeln und Faszien sind mit 4-0 Vicryl resorbierbaren Fäden verschlossen, um das Implantat zu fixieren, und die Haut vernäht.

   6. In-vivo-Beurteilungen

   1. Radiographische Bewertungen sind in einer Längsrichtung Weise sowohl Hochauflösung XR und Hochauflösung μCT (Mikro-Computertomographie)-Analyse durchgeführt. Für μCT-Analyse (Skyscan 1172F), werden die Bilder bei einer Auflösung von 19,73 um (100 kV und 100 mA Strahlungsquelle mit Hilfe eines 0,5 mm Aluminium-Filter) gescannt. Bilder werden mit Hilfe DataViewer, Recon, CTAN, und CTVol Software.
   2. Biolumineszenz-Bildgebung wird auch in serieller Weise zu Zelle Transplantation, Lebensfähigkeit, der Vermehrung zu beurteilen und schließt Migration aus der Implantationsstelle getan. Biolumineszenz-Bildgebung erfolgt mit Hilfe eines IVIS Lumina II Gerät (Caliper Life Sciences). Licht-Ausgänge werden quantifiziert durch lebende Image Software (Xenogen). Insgesamt Lichtleistung wird in Photonen / Sekunde / cm ² / Steradiant aufgezeichnet.
   3. Histologische und histomorphometrische Analyse wird post mortem durchgeführt. Routinefärbungen eingesetzt werden, umfassen Masson, Anilinblau, S.entachrome und Picrosirius rot. Histomorphometrische Analyse lässt sich leicht entweder mit Anilinblau oder pentachrome Flecken durchgeführt, bei dem Osteoid dunkelblau und gelb, bzw. erscheint. Pixel pro starkem Gesichtsfeld berechnet mit dem Zauberstab-Werkzeug in Adobe Photoshop.

   7. Repräsentative Ergebnisse

   Da sowohl die Schädeldecken und femoralen Defekte kritischen Größe sind, sollten keine signifikante Heilung ohne Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder exogene Stammzellen zu erwarten.

   In Bezug auf die chirurgische Manöver sollte der Muskel Beutel Dissektion entlang Faszien sein und damit minimale Blutung sollte begegnet werden. Auch wenn der Muskel Beutel Modell bilateraler Ebene durchgeführt wird, sollte die Maus mit Leichtigkeit am Tag nach der Operation ein zu Fuß. Für die Kalvariamodell Defekt wird Blutungen auftreten, kann aber mit einem Wattestäbchen getränkt werden. Äußerste Sorgfalt sollte nicht auf die zugrunde liegende Dura mater verletzt werden - wie dies störenmit normaler Heilung. Für die FSD-Modell wird darauf geachtet, nicht um die großen Blutgefäße zu verletzen, so wie nicht übermäßige Blutungen oder den N. femoralis zu veranlassen, um neurologische Schäden zu verhindern. Kirschner-Drähte mit leichtem Druck gebohrt, um nicht den kortikalen Knochen in dem Verfahren beschädigt werden.

   
   Abbildung 1. Präoperative Vorbereitung für Femur segmentalen Defekt (FSD) in athymischen Ratten. Männliche Ratten (12-14 Wochen alt) sind unter Isofluran-Inhalation betäubt. Der Oberschenkel ist geschrubbt und desinfiziert pro Standard-Protokoll mit Betadine.

   
   Abbildung 2. Operative Freilegung für Femur segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein 27-30 mm Längsinzision über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Die lateralen Seite des Femurs wird dann durch Trennen des Musculus vastus lateralis ausgesetztund M. biceps femoris.

   
   Abbildung 3. Fixierung für Femoral segmentalen Defekt (FSD) Schöpfung. Ein Polyethylen-Platte (Länge, 23 mm, Breite 4 mm, Höhe, 4 mm) an der antero-Oberfläche des Femur. Die Platte enthält sechs vorgebohrten Löcher bis 0,9 mm Durchmesser Gewinde-Kirschner-Drähte unterzubringen. Unter die Platte als Schablone werden sechs Gewinde Kirschner-Drähte durch die Platte und beide Kortikales gebohrt. Als nächstes wird eine 6 mm Mitte-diaphysären Defekt erzeugt. Sobald dies durchgeführt wird, wird eine maßgeschneiderte Gerüst direkt eingefügt, die genau den Defekt vor Ort (nicht dargestellt).

   
   Abbildung 4. Beispiel für Kalvariamodell Defect Postoperative. Ein 4 mm, kreisförmigen Calvaria Defekt in der rechten Scheitelbein in athymischen Mäusen erzeugt. Abgebildeten hier ist ein Defekt implantiert mitPSCs nach 8 Wochen postoperativ. Notieren Sie sich die Anwesenheit des neuen Knochens innerhalb der defekten Stelle.

Discussion

Die Isolierung von PSCs ist gut an anderer Stelle beschrieben ^1-3, einschließlich eines separat eingereicht JoVE Veröffentlichung speziell an PSC Isolation Protokolle und Methoden. Der spezifische Zweck dieses Artikels ist zu beschreiben und zu zeigen, 3-Protokolle für die PSC in vivo-Anwendung für die Knochenbildung / Regeneration. Die SCID-Maus-Muskel-Tasche ist eine häufig beschriebene Modell für menschliche ektopische Knochenbildung ^7. Wichtige Unterschiede gibt es zwischen ektopen und orthotopen (Defekt) Modelle für die Knochen, darunter parakrine Interaktion mit dem Host Knochen bildenden Zellen ⁸ sowie einer Fülle von osteogenen Faktoren Signalisierung in der Skelett-Defekt Mikroumgebung. Zwei Mängel werden hier vorgestellt und eine Kalvariamodell defect8 femoralen segmentalen Defekts ^4. Beide sind gut dokumentiert, kritisch zu sein Größe (dh nicht auf ihren eigenen heilen).

Interessante Unterschiede gibt es zwischen Kalvariamodell und femoralen Defekte. Zuerst wird derZell: Zell-Interaktion zwischen Heterotransplantattumor PSCs und körpereigenen Zellen ist sehr unterschiedlich. Im Sinne einer Calvaria Defekt, interagieren PSCs mit dem darunter liegenden Dura mater (die äußerste Schicht der Hirnhaut), ebenso wie diejenigen Osteoblasten und Periostzellen aufweist, die die defekten Stelle. Wichtig ist, dass die Wechselwirkung zwischen der implantierten Zellen und umgebenden Osteoblasten ⁸ oder implantierten Zellen und die zugrunde liegenden Dura (Levi et al., Im Druck) für die normale Stamm-Zell-vermittelte Osteogenese, um fortzufahren. Im Hinblick auf die femorale segmentalen Defekt (FSD), werden Xenotransplantat PSCs zu einem ganz anderen Zelle und Cytokin Umgebung ausgesetzt. Zum Beispiel wird die FSD Seite der zugehörigen Knochenmark und mesenchymale Stammzellen, sowie die Endost, Periost und langer Röhrenknochen Osteoblasten besteht. Theoretisch weist jede Zelle einen eigenen Reaktion auf eine Verletzung, und jede Zelle haben kann: Zell-Interaktionen mit PSC-Xenotransplantaten.

Weitere deutliche Unterschiede bestehen zwischen Kalvariamodellund femoralen Defekte. Die Schädeldecken Knochen bilden zunächst durch intramembranöse Ossifikation, während die langen Knochen durch einen Knorpel-Zwischenprodukt (enchondralen Ossifikation) zu bilden. Darüber hinaus ist die reparative Verfahren nach der Verletzung auch ahmt diese Entwicklungsstörungen Herkunft. Post-FSD, wird Knorpel Kallusbildung beobachtet, während keine Zwischen-Knorpel in einem Scheitelbein Defekt gebildet wird. Schließlich kann die embryonale Herkunft des Schädels aus, dass der langen Knochen unterscheiden. Die Mehrheit der Schädel (einschließlich perivaskuläre Zellen - Perizyten - in der ganzen Kopfbereich) von der Neuralleiste (mesectoderm) abgeleitet, während die appendicularis Skelett der paraxialen Mesoderm Ableitung ^9. All diese Unterschiede können in signifikanten Unterschiede in Bezug auf die PSC-vermittelte Knochenreparatur führen.

Der Einsatz von PSCs hat einige Vorteile gegenüber traditionellen Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASC). PSCs erfordern keine Kultur und eine gereinigte Zellpopulation which beinhaltet keine anderen Stromazellen, die nicht in nicht teilnehmen - und kann sogar negativ regulieren - osteogene Differenzierung, wie Endothelzellen ^10. Im Gegensatz zum Beispiel für klonale Analysen ASC, dass nur eine Subpopulation der Lage einer osteogenen Differenzierung in vitro ¹¹ sind. Letztendlich wird das Skelettgewebe Entwicklungsanstrengungen wahrscheinlich enthalten eine osteocompetent Stammzellen (zB PSC) mit exogenen Wachstumsfaktoren und eine osteokonduktive Matrix (wie HA-PLGA verwendet in den vorliegenden Verfahren), um die besten zu heilen Skelettdefekten.