L'uso di cellule staminali per la rigenerazione ossea perivascolari

Summary

Le cellule staminali perivascolari (PSC) sono una nuova classe di cellule staminali per la rigenerazione tissutale scheletrico simili alle cellule staminali mesenchimali (MSC). CSP possono essere isolati mediante FACS (fluorescenza selezione cellulare attivata) da tessuto adiposo prelevati durante le normali procedure di liposuzione, poi combinato con un osteoinduttiva impalcatura per ottenere la formazione ossea

Abstract

Cellule staminali perivascolari (PSC) può essere isolato in numero sufficiente da diversi tessuti a fini di ^1-3 scheletrico ingegneria dei tessuti. PSC sono una popolazione FACS-ordinata di 'periciti' (CD146 + CD34-CD45-) e 'cellule avventiziale "(CD146-CD34 + CD45-), ciascuno dei quali abbiamo già riferito di avere proprietà delle cellule staminali mesenchimali. PSC, come MSC, sono in grado di subire differenziazione osteogenico, nonché secernono pro-osteogenico ^1,2 citochine. Nel presente Protocollo, dimostriamo la osteogenicity del PSC in diversi modelli animali tra cui un impianto muscolare sacchetto in SCID (immunodeficienza combinata grave) topi SCID, una difetto del mouse cranica e un difetto femorale segmentale (FSD) nei ratti atimici. Il muscolo della coscia modello sacchetto viene utilizzato per valutare la formazione ectopica dell'osso. Difetti calvaria sono centrate con l'osso parietale e sono ordinariamente 4 mm di diametro (criticamente imprese) ^8. FSD sono bicorticale e sono stabilizzate conuna barra di polietilene e K-fili ^4. La FSD è descritto anche un difetto dimensione critica, che non influisce significativamente guarire da ⁴ stessa. Al contrario, se le cellule staminali o fattori di crescita vengono aggiunti al sito del difetto, rigenerazione ossea significativo può essere apprezzato. L'obiettivo generale di xenotrapianto PSC è quello di dimostrare la capacità osteogenico di questo tipo di cellule in modelli ossee sia ectopiche e ortotopico di rigenerazione.

Protocol

1. Perivascolare Stem isolamento cellulare

Questo è descritto in dettaglio nella adiacente "purificazione delle cellule staminali umane perivascolari da tessuto adiposo bianco" articolo di M. Corselli et al.

2. Scaffold Creation

1. Ponteggi sono su misura per il protocollo precedentemente pubblicato da poli (lattico-co-glicolico) (PLGA, Burmingham Polymer) con rivestimento in idrossiapatite ^4-6. Apatite rivestite impalcature PLGA sono fabbricati da 85/15 PLGA da solvente per colata e un processo di lisciviazione particolato. Le impalcature sono creati in una forma sferica (2-mm di diametro) per l'impianto muscolo sacchetto, una forma discoidale (4 mm di diametro) per l'impianto cranica, o cilindrica (4 mm di diametro, 6 mm di lunghezza) per femorale difetti segmentale.
2. In breve, PLGA / cloroformio soluzioni miste con saccarosio (polimero / rapporto meno di 5/95, w / w) sono fusi in uno stampo del diametro di 200-300-micron Teflon per creare su misura construct. Dopo liofilizzazione overnight, ponteggi vengono rimosse dallo stampo e Teflon immerso in ddh ₂ O per sciogliere il saccarosio. Le impalcature sono disinfettati per immersione in 70% etanolo per 30 min, seguito da tre lavaggi di ddh ₂ O.
3. Per rivestimento di apatite, un fluido corporeo simulato soluzione (SBF) viene preparata sciogliendo sequenzialmente CaCl _2, MgCl2 • 6H ₂ O, NaHCO _3, e K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O in ddh ₂ O. PH della soluzione si abbassa a 6 con l'aggiunta di acido cloridrico 1M per aumentare la solubilità. Na ₂ SO _4, KCl, e NaCl vengono aggiunti e il pH finale viene regolata a 6,5 (SBF 1).
4. Mg2 + e HCO ₃ - libera SBF (SBF 2) viene preparata aggiungendo CaCl ₂ e K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O in ddh ₂ O e si abbassa il pH a 6. KCl e NaCl vengono aggiunti e il pH finale viene regolata a 6,8. Tutte le soluzioni sono sterili filtrata attraverso un membr 0,22 micron PESAne (Nalgene). Immediatamente prima del processo di rivestimento, i ponteggi essiccati PLGA sono sottoposti a bagliore scarico plasma di argon etching (Harrick Scientific) per migliorare la bagnatura e uniformità di rivestimento.
5. Etched ponteggi vengono poi incubate in SBF 1 per 12 ore e cambiato Mg2 + e HCO ₃ - libero SBF 2 per un'altra h 12 a 37 ° C sotto leggera agitazione. Ponteggi rivestiti vengono lavati con ddh ₂ O per rimuovere gli ioni in eccesso e liofilizzati prima di ulteriori studi.

3. Il Muscle Pouch impianto modello

1. 100 pl di una sospensione PSC in PBS (tampone fosfato salino) sono delicatamente cadere sulla sferica PLGA basato impianto subito prima dell'impianto. Le cellule sono state pre-etichettato mediante inserimento lentivirale luciferasi di lucciola, così da consentire dopo l'impianto in vivo inseguimento. Densità cellulare è di 2,5 x 10 ⁵ per ogni impianto.
2. SCID (grave immunodeficienza combinata), i topi sono utilizzati a 6 settimane di età. Gli animali sono anesthetized per inalazione isoflurano e premedicazione con buprenorfina (Bedford Labs). Dopo la preparazione Betadine standard, incisioni bilaterali negli arti posteriori sono realizzati (longitudinale e 2 mm di lunghezza).
3. Tasche vengono tagliati nei muscoli bicipite femorale da parallelo smussa all'asse della fibra muscolare lungo. Per ciascun topo, il PLGA basata impianto con PSC viene inserito, e la fascia sovrastante il muscolo viene suturata con 5-0 Vicryl (Ethicon).
4. La pelle è chiusa con successivo 5-0 Vicryl in un modello sottocuticolare. Gli animali vengono trattati nel postoperatorio con buprenorfina per 48 ore e TMP / SMX (trimetoprim / sulfametossazolo; Qualitest) per 10 giorni.

4. Il cranica Defect impianto modello

1. Dopo l'anestesia isoflurano di topi SCID (12-14 settimane), i capelli sono tagliati e la pelle disinfettato con Betadine per protocollo.
2. A 8 mm incisione cutanea è praticata lungo la sutura sagittale della volta cranica topo. Successivamente, il CALVarial periostio viene delicatamente rimosso da Q-tip applicazione.
3. Successivamente, utilizzando diamantate punte trapano in un trapano ad alta velocità dentale, uno da 4 mm difetto parietale è stato creato. Il difetto è tutto spessore - tuttavia si ha cura di non danneggiare il sottostante dura mater.
4. La misura PLGA-based impianto con PSC trapiantati viene poi messo delicatamente nel sito del difetto. Densità cellulare è di 2,5 x 10 ⁵ per ogni impianto. Infine, la cute viene suturata con 6-0 Vicryl. Gli animali vengono trattati nel postoperatorio con buprenorfina per 48 ore e TMP / SMX per 10 giorni.

5. Il difetto femorale segmentale impianto modello

1. Atimici ratti (12-14 settimane di età) sono anestetizzati con isoflurano inalazione. Il femore è rimosso e preparato secondo la procedura standard con Betadine (Figura 1).
2. A 27-30-millimetri incisione longitudinale è realizzata sulla faccia antero-laterale del femore. Il femore è quindi esposto separando il lat vastoeralis e muscoli bicipite femorale (Figura 2).
3. Per massimizzare la coerenza di rigenerazione ossea, il periostio sovrastante il difetto femorale viene completamente rimosso con il segmento asportato femorale.
4. Una piastra di polietilene (lunghezza, 23 mm, larghezza, 4 mm, altezza, 4 mm) è posto sulla superficie antero-laterale del femore. La piastra contiene sei fori predisposti per accogliere 0,9 mm di diametro fili di Kirschner filettati (Zimmer). Prendendo la piastra come modello, sei fili di Kirschner filettati sono perforati attraverso la piastra ed entrambe le corticali (Figura 3).
5. Successivamente, con una lama piccola sega oscillante (Stryker, MI), a 6 mm mid-diafisario difetto è stato creato. Difetti segmentali vengono poi trattati con l'inserimento di impianti PLGA base che sono stati carica di celle come da protocollo (Figura 4).
6. Il muscolo e la fascia sovrastante sono chiusi con 4-0 punti di sutura riassorbibili Vicryl per fissare l'impianto in posizione, e la pelle viene suturata.

   6. Valutazioni in vivo

   1. Valutazioni radiografiche sono eseguite in maniera longitudinale sia XR alta risoluzione e ad alta risoluzione μCT (micro tomografia computerizzata) analisi. Per l'analisi μCT (Skyscan 1172F), le immagini sono state scansionate ad una risoluzione di 19,73 micron (100 kV e 100 mA sorgente di radiazione, utilizzando un filtro in alluminio da 0,5 mm). Le immagini sono analizzate utilizzando DataViewer, Recon, CTAN e software CTVol.
   2. Immagini bioluminescenza è anche fatto in modo seriale per valutare l'attecchimento delle cellule, vitalità, proliferazione ed escludere la migrazione dal sito dell'impianto. Immagini bioluminescenza è effettuato con un dispositivo di IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Uscite di luce vengono quantificati utilizzando il software Living Image (Xenogen). Emissione luminosa complessiva è registrata in fotoni / secondo / cm ² / steradiante.
   3. L'analisi istologica e istomorfometrica viene eseguito post mortem. Macchie di routine impiegate includono Masson tricromica, blu di anilina, pentachrome, e Picrosirius rosso. L'analisi istomorfometrica viene eseguita facilmente con uno blu anilina o macchie pentachrome, in cui appare osteoide blu scuro e giallo, rispettivamente. Pixel per campo di alta potenza sono calcolati utilizzando lo strumento bacchetta magica in Adobe Photoshop.

   7. Risultati rappresentativi

   Poiché entrambi i difetti cranica e femorale sono critiche imprese, non significativa la guarigione dovrebbe essere previsto senza trattamento con fattori di crescita o cellule staminali esogeni.

   In termini di manovre chirurgiche, la dissezione sacca muscolare dovrebbe essere lungo i piani fasciali e quindi sanguinamento minimo si dovrebbero incontrare. Anche se il modello sacca muscolare viene eseguita bilateralmente, il mouse deve essere a piedi con facilità il giorno postoperatorio 1. Per il difetto cranico, emorragia si incontra, ma può essere intrisa di una Q-tip. Prestare estrema attenzione a non ferire la dura sottostante dura - perché questo potrebbe interferirecon la guarigione normale. Per il modello FSD, si ha cura di non danneggiare i vasi sanguigni più importanti in modo da non provocare un sanguinamento eccessivo o il nervo femorale per evitare danni neurologici. Fili di Kirschner sono perforati con una leggera pressione in modo da non danneggiare l'osso corticale nel processo.

   
   Figura 1. Preparazione preoperatoria per difetto di femore (FSD) nei ratti atimici. Ratti maschi (12-14 settimane di età) sono anestetizzati con isoflurano inalazione. Il femore è rimosso e preparata secondo la procedura standard con Betadine.

   
   Figura 2. L'esposizione chirurgica per femorale segmentale Defect (FSD) creazione. A 27-30 millimetri incisione longitudinale è realizzata sulla faccia antero-laterale del femore. L'aspetto laterale della diafisi femorale è quindi esposto separando il vasto lateralebicipite femorale e muscoli.

   
   Figura 3. Di fissaggio per femorale segmentale Defect (FSD) creazione. Una piastra di polietilene (lunghezza, 23 mm, larghezza, 4 mm, altezza, 4 mm) è posto sulla superficie antero-laterale del femore. La piastra contiene sei fori predisposti per accogliere 0,9 mm di diametro fili di Kirschner filettati. Prendendo la piastra come modello, sei fili di Kirschner filettati sono perforati attraverso la piastra ed entrambe le corticali. Successivamente, da 6 mm mid-diafisario difetto viene creato. Una volta che questo viene eseguita una misura scaffold è inserito direttamente che si adatta esattamente sito del difetto (non mostrato).

   
   Figura 4. Esempio di difetto cranico post-operatorio. A mm 4, difetto circolare cranica viene creato nel parietale destro nei topi atimici. Creata l'immagine qui è un sito del difetto impiantati conPSC a 8 settimane post-operatorie. Si noti la presenza di nuovo tessuto osseo all'interno del sito del difetto.

Discussion

L'isolamento di PSC è ben descritto altrove ^1-3, compresa una pubblicazione JOVE separatamente presentato specificatamente legati protocolli di isolamento PSC e metodi. Lo scopo specifico di questo articolo è quello di descrivere e dimostrare 3 protocolli per PSC in applicazione vivo per la formazione dell'osso / rigenerazione. La SCID sacchetto muscolare del mouse è un modello comunemente descritto per la formazione ectopica di osso umano ^7. Notevoli differenze esistono tra ectopiche e ortotopico (difetto) i modelli per l'osso, compresa l'interazione con l'host paracrino ossee ⁸ così come l'abbondanza di osteogeniche fattori di segnalazione presenti nel microambiente difetto scheletrico. Due difetti sono presentati qui, un defect8 cranica e femorale difetto di ^4. Entrambe sono ben documentati per essere critici imprese (vale a dire non guarire da soli).

Interessanti differenze esistono tra i difetti cranica e femorale. In primo luogo, lacell: interazione cellulare tra PSC xenotrapiantati e cellule endogene è molto diversa. In termini di un difetto cranica, PSC interagire con il mater sottostante dura (lo strato più esterno delle meningi), nonché quelle osteoblasti e cellule periostali circoscrivono sito del difetto. È importante sottolineare che l'interazione tra cellule impiantate e osteoblasti circostanti ^8, o cellule impiantate e sottostante dura madre (Levi et al., In stampa) sono critici per cellule staminali normali mediata osteogenesi procedere. In termini di difetto femorale segmentale (FSD), PSC xenotrapiantati sono esposti a una cella diversa ambiente e citochine. Ad esempio, il sito FSD è composto delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo e di accompagnamento, così come la endosteum, periostio e delle ossa lunghe osteoblasti. Teoricamente, ogni cella ha la sua propria reazione al danno, e ognuno può avere l'interazione fra cellule con xenotrapianti PSC.

Altre differenze esistano tra cranicae difetti femorali. Le ossa cranica inizialmente formare attraverso ossificazione intramembranosa, mentre le ossa lunghe formano attraverso un intermedio cartilagine (encondrale). Inoltre, il processo riparativo post-infortunio anche imita queste origini dello sviluppo. Post-FSD, formazione del callo osseo la cartilagine si osserva, considerando che non intermedia cartilagine è formata all'interno di un difetto osseo parietale. Infine, l'origine embrionale del cranio può differire da quella delle ossa lunghe. La maggior parte del cranio (comprese cellule perivascolari - periciti - della regione intera testa) è derivato dalla cresta neurale (mesectoderm), mentre lo scheletro appendicolare è di derivazione mesoderma parassiale ^9. Tutte queste differenze possono portare a differenze significative in termini di PSC-mediata riparazione ossea.

L'uso di PSC ha diversi vantaggi rispetto ai tradizionali cellule stromali derivate da tessuto adiposo (CSA). PSC non richiedono la cultura e sono una popolazione di cellule purificate WHIch non include altre cellule stromali che non partecipano - e può anche regolano negativamente - differenziazione osteogenico, come le cellule endoteliali ^10. Al contrario, per esempio, analisi clonali di ASC mostrano che solo una sottopopolazione sono capaci di subire differenziazione osteogenico in vitro ^11. In definitiva, scheletriche sforzi di ingegneria tissutale probabilmente integrare una cella osteocompetent staminali (come PSC) con fattori di crescita esogeni e uno scaffold osteoconduttivo (come HA-PLGA usato nei presenti metodi) per guarire meglio difetti scheletrici.