Användning av mänskliga perivaskulär stamceller för benuppbyggnad

Summary

Mänskliga perivaskulära stamceller (PSC) är en ny stamcell klass för skelett vävnadsregenerering liknar mesenkymala stamceller (MSC). PSC kan isoleras genom FACS (fluorescensaktiverad cellsortering) från fettvävnad anskaffas under normal fettsugning förfaranden, kombinerades sedan med ett osteoinduktivt byggnadsställning för att uppnå benbildning

Abstract

Mänskliga perivaskulära stamceller (PSC) kan isoleras i tillräckligt antal från flera vävnader för att de skall skelett tissue engineering ^1-3. PSC är en FACS-sorterade populationen av "pericyter '(CD146 + CD34-CD45-) och' adventitiala celler" (CD146-CD34 + CD45-), vilka var och vi har tidigare rapporterats att ha egenskaper av mesenkymala stamceller. PSC, som MSC, kan undergå osteogen differentiering, såväl som utsöndrar pro-osteogent cytokiner ^1,2. I det nuvarande protokollet, visar vi osteogenicity av PSC i flera djurmodeller, inklusive en muskel påse implantation i SCID (allvarlig kombinerad immunbrist) möss, en SCID möss calvarial felet och en femoral segmentell defekt (FSD) i atymiska råttor. Lårmuskeln påsen modell används för att bedöma ektopisk benbildning. Calvarial defekter centrerade på parietala benet och är standardmässigt 4 mm i diameter (kritiskt storlek) ^8. FSDs är bicortical och är stabiliserade meden polyeten bar och K-trådar ^4. FSD beskrivs är också en kritisk storlek fel, som inte signifikant läker på egen hand ^4. Om däremot stamceller eller tillväxtfaktorer tillsättes till det defekta stället, kan betydande benregenerering inses. Det övergripande målet för PSC xenografting är att visa osteogena förmågan hos denna celltyp i både ektopiska och ortotopisk modellerna ben förnyelse.

Protocol

1. Perivaskulär Stem Cell Isolation

Detta beskrivs i detalj i det intilliggande artikeln "Rening av perivaskulär stamceller från mänskliga vit fettvävnad", av M. Corselli et al.

2. Scaffold Creation

1. Byggnadsställningar är skräddarsydd enligt tidigare offentliggjorda protokollet från poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) (PLGA, Burmingham Polymer) med hydroxyapatit beläggning ^4-6. Apatit-belagda PLGA ställningar är tillverkade av 85/15 PLGA genom lösningsmedelsgjutning och en partikelformig lakningsprocessen. Byggnadsställningar skapas i en sfärisk form (2-mm i diameter) för muskelpåsen implantering, en skivformen (4 mm i diameter) för calvarial implantation eller cylindrisk (4 mm i diameter, 6 mm i längd) för femoral segmentala defekter.
2. Kortfattat PLGA / kloroform lösningar blandades med sackaros (polymer / sackaros-förhållande 5/95, vikt / vikt) är ingjutna i en 200-300 | im diameter Teflon formen för att skapa de skräddarsydda nackdelartruct. Efter frystorkning över natten, ställningar avlägsnas från Teflon formen och nedsänktes i ddHaO ₂ O för upplösning av sackarosen. Ställningar skall desinficeras genom nedsänkning i 70% etanol under 30 min, följt av tre sköljningar av Ddh ₂ O.
3. För apatit beläggning, är en simulerad kroppsvätska (SBF) lösning framställdes genom att sekventiellt upplösning _CaCl2, MgCl2, • ₆ H2O, NaHCOs _3, och K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O i ddHaO ₂ O. Lösningens pH sänktes till 6 genom tillsats av 1 M saltsyra för att öka lösligheten. Na _{2 SO4,} KCl och NaCl tillsätts och det slutliga pH-värdet justeras till 6,5 (SBF 1).
4. Mg2 + och HCO ₃ - fri SBF (SBF 2) framställes genom tillsats av _CaCl2 och K ₂ HPO ₄ • 3H ₂ O i ddHaO ₂ O och pH sänks till 6. KCl och NaCl tillsätts och det slutliga pH-värdet justeras till 6,8. Alla lösningar är sterila filtrerades genom en 0,22 fim PES Membrane (Nalgene). Omedelbart före beläggningsprocessen, de torkade PLGA stödstrukturema underkastades glimurladdning argon plasmaetsning (Harrick Scientific) för att förbättra vätning och beläggningens jämnhet.
5. Etsade ställningar inkuberas sedan i SBF 1 under 12 h och ändras med Mg2 + och HCO ₃ - fri SBF 2 för en annan 12 h vid 37 ° C under försiktig omröring. Belagda ställningar tvättas med ddHaO ₂ O för att avlägsna överskott joner och frystorkas före till fortsatta studier.

3. Muskelpåsen Model implantation

1. 100 pl av en PSC-suspension i PBS (fosfatbuffrad saltlösning) försiktigt droppas på den sfäriska PLGA-baserade implantat omedelbart före implantering. Cellerna har märkt i förväg genom lentivirala insättning av eldflugeluciferas, så att tillåta in vivo-spårning efter implantation. Celltätheten är 2,5 x 10 ⁵ per implantat.
2. SCID (allvarlig kombinerad immunbrist)-möss användes vid 6 veckors ålder. Djur är Anesthetized av isofluran inandning och premedicineras med buprenorfin (Bedford Labs). Efter standardupparbetning Betadine framställning är bilaterala snitt i bakbenen gjorts (längsgående och 2 mm i längd).
3. Fickor är skurna i biceps femoris muskler genom trubbig dissektion parallell med muskelfibrer längdaxel. För varje mus, är PLGA-baserade implantat med PSC införas, och fascia överliggande muskeln sutureras med 5-0 Vicryl (Ethicon).
4. Huden Nästa stängs med 5-0 Vicryl i ett subkutikulär mönster. Djuren behandlas postoperativt med buprenorfin under 48 timmar och TMP / SMX (Trimetoprim / Sulfametoxazol; Qualitest) under 10 dagar.

4. Den Calvarial defektmodell Implantering

1. Efter isoflurananestesi av SCID-möss (12-14 veckor gamla) är håret klippt och huden desinficeras med betadin per protokoll.
2. En 8-mm snitt i huden sker längs mitten sagittala sutur av musen calvarium. Vidare gäller calvArial periostet försiktigt avlägsnas med Q-tip ansökan.
3. Därefter, med hjälp av diamantbelagda trefin bitar i en hög hastighet tandläkarborr är en 4-mm parietala bendefekten skapas. Felet är full tjocklek - men man är noga med att inte skada den underliggande dura mater.
4. Den skräddarsydda PLGA-baserade implantat med ympade PSC placeras sedan försiktigt i det defekta stället. Celltätheten är 2,5 x 10 ⁵ per implantat. Slutligen huden sutureras med 6-0 Vicryl. Djuren behandlas postoperativt med buprenorfin under 48 timmar och TMP / SMX under 10 dagar.

5. Den femorala segmental defekt Modell Implantering

1. Atymiska råttor (12-14 veckor gamla) sövs i isofluran inandning. Lårbenet är skrubbas och beredd per standardprotokoll med Betadine (figur 1).
2. En 27-30-mm längsgående snitt görs över den främre laterala sidan av lårbenet. Lårbensskaftet sedan exponeras genom att separera vastus lateralis och biceps femoris muskler (figur 2).
3. För att maximera enhetlighet benregenerering är benhinnan överliggande den femorala felet helt avlägsnas med resekerade femorala segmentet.
4. En polyeten-platta (längd, 23 mm, bredd, 4 mm, höjd, 4 mm) placeras på den anterolaterala ytan av lårbenet. Plattan innehåller sex förborrade hål för att rymma 0,9 mm diameter gängade Kirschnertrådar (Zimmer). Med plattan som mall, är sex gängade Kirschnertrådar borrade genom plattan och båda cortex (Figur 3).
5. Därefter, med en liten svängande sågklinga (Stryker, MI), är en 6-mm mitten diafysealt defekt skapas. Segmentala defekter behandlas sedan genom införing av PLGA baserade implantat som har lastat med celler enligt protokollet (figur 4).
6. Den överliggande muskel och fascia är tillslutna med 4-0 Vicryl-absorberbara suturer för att fästa implantatet på plats, och huden sutureras.

   6. In vivo-bedömningar

   1. Radiografiska bedömningar utförs på ett längsgående sätt av både hög upplösning XR och hög upplösning μCT (mikro datortomografi)-analys. För μCT analys (SkyScan 1172F) är bilderna skannas med en upplösning på 19,73 m (100 kV och 100 mA strålkälla med hjälp av en 0,5 mm aluminium filter). Bilderna analyseras med DataViewer, Recon, CTAN och CTVol mjukvaror.
   2. Bioluminescens avbildning sker också i ett seriellt sätt att bedöma cellen engraftment, livskraft, tillväxt och utesluta migrering av implantatstället. Bioluminescens avbildning utförs med hjälp av en IVIS Lumina II apparat (Caliper Life Sciences). Lätta utgångar kvantifieras med Living Image mjukvara (Xenogen). Total ljusflöde registreras i fotoner per sekund / sq cm / steradian.
   3. Histologiska och histomorfometrisk analys utförs efter döden. Rutinmässiga anställda fläckar inkluderar Massons trikrom, anilin blå, s.entachrome och Picrosirius rött. Histomorfometrisk analys utförs enkelt med antingen anilin blå eller pentachrome fläckar, där osteoid verkar mörkt blå och gul, respektive. Pixlar per hög effekt fält beräknas med hjälp av trollstaven i Adobe Photoshop.

   7. Representativa resultat

   Eftersom både calvarial och femorala brister är kritiska storlek, bör ingen signifikant läkning kan förväntas utan behandling med tillväxtfaktorer eller exogena stamceller.

   När det gäller kirurgiska manövrar bör muskelpåsen dissektionen vara längs fascian plan och därmed minimal blödning bör påträffas. Även om muskelpåsen modell utförs bilateralt ska musen skall gå lätt på postoperativ dag 1. För calvarial felet är blödningar uppstår, men kan läggas i blöt med en Q-tip. Extrem försiktighet bör iakttas för att inte skada den underliggande dura mater - eftersom detta kommer att störamed normal läkning. För FSD modellen omsorg inte skada de stora blodkärlen så att inte orsaka alltför stora blödningar eller femorala nerven för att förhindra neurologisk skada. Kirschner-vajrar är borrade med lätt tryck för att inte skada det kortikala benet i processen.

   
   Figur 1. Preoperativa förberedelsen för femoral segmental defekt (FSD) i atymiska råttor. Hanråttor (12-14 veckor gamla) bedövades enligt isofluran inhalering. Lårbenet är skrubbas och förberedd per standardprotokoll med betadin.

   
   Figur 2. Kirurgisk exponering för femoral Segmentell Defect (FSD) skapelse. En 27-30 mm längsgående snitt görs över anterolateralt av lårbenet. Den laterala aspekten av den femorala benpipan exponeras sedan genom separering av vastus lateralisoch biceps femoris muskler.

   
   Figur 3. Fixering för femoral Segmentell Defect (FSD) skapelse. En polyeten-platta (längd, 23 mm, bredd, 4 mm, höjd, 4 mm) placeras på den anterolaterala ytan av lårbenet. Plattan innehåller sex förborrade hål för att rymma 0,9 mm diameter gängade Kirschner trådar. Med plattan som mall, är sex gängade Kirschnertrådar borrade genom plattan och båda cortex. Därefter en 6 mm i mitten av diafysealt defekt skapas. När detta utförs, är en skräddarsydd ställning direkt in som exakt passar defekta platsen (visas ej).

   
   Figur 4. Exempel på Calvarial Defekt Postoperativ. En 4 mm, cirkulär calvarial defekt skapad i den högra parietala benet i atymiska möss. Bildförsedda är här en defekta stället implanterades medPSC vid 8 veckor efter operation. Observera närvaron av nytt ben inom det defekta stället.

Discussion

Isoleringen av PSC är väl beskriven på annat håll ^1-3, bland annat en separat in JUPITER publicering särskilt behandlar PSC isolering protokoll och metoder. Det specifika syftet med denna artikel är att beskriva och visa 3 protokoll för PSC in vivo ansökan om benbildning / regenerering. SCID-musen muskelpåsen är en allmänt beskrivna modellen för ektopisk humant benbildning ^7. Viktiga skillnader mellan ektopisk och ortotopisk (fel) modeller för ben, inklusive parakrin interaktion med värd benbildande celler ⁸ och ett överflöd av osteogena signalering faktorer i skelettet felet mikromiljö. Två fel presenteras här, en calvarial defect8 och femorala segmentell defekt ^4. Båda är väl dokumenterade att vara kritisk storlek (dvs kommer inte läka på egen hand).

Intressanta skillnader mellan calvarial och femorala defekter. Första, dencell: cell interaktion mellan xenoympade PSC och endogena celler är mycket olika. I termer av en calvarial defekt, PSC interagera med det underliggande dura mäter (det yttersta skiktet av meningerna), såväl som de osteoblaster och periosteala celler som omskriver det defekta stället. Viktigare är att växelverkan mellan implanterade cellerna och omgivande osteoblaster ⁸ eller implanterade celler och underliggande dura (Levi et al., Under tryckning) är kritiska för normal stamcell medieras osteogenes för att fortsätta. I termer av den femorala segmental defekt (FSD), är xenoympade PSC exponeras för en helt annan cell och cytokin miljö. Till exempel är det FSD platsen består av märg och åtföljande mesenkyma stamceller, såväl som den endosteum, periosteum och långa rörben osteoblaster. Teoretiskt har varje cell en egen reaktion på skada, och vardera kan ha cell: cellsinteraktioner med PSC-xenotransplantat.

Andra tydliga skillnader mellan calvarialoch femorala defekter. De calvarial benen bildar en början genom intramembranös ossifikation, medan de långa benen bildar genom en brosk intermediär (endokondral ossifikation). Dessutom reparativa processen efter skada också efterliknar dessa utvecklingseffekter ursprung. Post-FSD är brosk kallus-bildning observerades däremot ingen brosk intermediär bildas inom en parietal bendefekt. Slutligen kan embryonalt ursprung av skallen skiljer sig från de långa benen. Majoriteten av skallen (inklusive perivaskulära celler-pericyter - i hela huvudet regionen) är härledd från neurallisten (mesectoderm), medan den appendicular skelettet är av axelparallella mesoderm härledning ^9. Alla dessa skillnader kan leda till betydande skillnader i fråga om PSC-medierad ben reparation.

Användningen av PSC har flera fördelar jämfört med traditionella adipos-stromala celler (ASC: er). PSC kräver inte kultur och är en renad cellpopulation which omfattar inte andra stromaceller som inte deltar i - och kan även negativt reglera - osteogen differentiering, t.ex. endotelceller ^10. I motsats till exempel klonala analyser av ASC: er visar att endast en subpopulation har förmåga att genomgå osteogen differentiering in vitro ^11. I slutändan kommer skelettvävnad teknikarbete inkorporera sannolikt en osteocompetent stamcell (t ex PSC) med exogena tillväxtfaktorer och en osteokonduktivt stödstruktur (såsom HA-PLGA används i föreliggande metoder) för att bäst läka skelettdefekter.