Summary
İnsan perivasküler kök hücreler (PSC'ler) mezenkimal kök hücreler (MKH) benzer iskelet doku yenilenmesine yönelik yeni bir kök hücre sınıfı vardır. PSC'ler standart bir yağ emme prosedürleri sırasında temin adipoz dokusu FACS (floresans aktive hücre ayırma) yoluyla izole edilebilir, ardından kemik oluşumunu sağlamak için bir osteoendüktif iskelesi ile kombine
Abstract
İnsan perivasküler kök hücreler (PSC'ler) iskelet doku mühendisliği 1-3 amacıyla birden fazla dokuların yeterli sayıda izole edilebilir. PSC'ler bir 'perisitler' bir FACS-sıralı nüfus (CD146 + CD34-CD45-) ve biz daha önce mezenkimal kök hücre özelliklerine sahip bildirdin her biri 'adventisyal hücreler' (CD146-CD34 + CD45-) vardır. PSC'ler, MKH gibi osteojenik farklılaşma gibi salgılar yanlısı osteojenik sitokinler 1,2 geçmesi edebiliyoruz. Mevcut protokolde, biz SCID bir kas kese implantasyonu dahil olmak üzere birçok hayvan modellerinde PSC'ler arasında osteogenicity göstermek (ağır kombine immün yetmezliği) fareler, bir SCID fare kalvaryal defekt ve atimik sıçan femoral segmental defekt (FSD). Uyluk kas kese modeli ektopik kemik oluşumu değerlendirmek için kullanılmıştır. Kalvaryum kusurları parietal üzerinde yoğunlaştı ve çapı standart olarak 4 mm (eleştirel boyutta) 8 olarak uygulanır. FSDs bicortical olup ile stabilize edilmektedirpolietilen bir bar ve K-telleri 4. Açıklanan FSD de önemli ölçüde kendi 4 iyileşmeyen bir kritik boyutu bozukluğudur. Kök hücreleri ya da büyüme faktörleri kusurun sitesi eklenir Buna zıt olarak, önemli ölçüde kemik rejenerasyonu takdir edilebilir. PSC xenografting genel amacı ektopik ve ortotopik hem kemik rejenerasyonu modellerinde bu hücre tipi osteojenik yeteneği göstermektir.
Protocol
1. Perivasküler Kök Hücre İzolasyonu
Bu, M. Corselli ve arkadaşları tarafından, bitişik makalesi "İnsan beyaz adipoz dokusu perivasküler Kök Hücreler saflaştırılması" de ayrıntılı olarak tarif edilmektedir.
2. İskele Yaratılış
- İskelelerin poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA, Burmingham Polimer) hidroksiapatit kaplama 4-6 ile daha önce yayınlanmış protokol başına özel yapılır. Apatit kaplı PLGA iskeleleri çözücü döküm ve partikül liç işlemi ile PLGA 85/15 imal edilir. Iskelelerinin kas kese implantasyon, femoral segmental kusurlar için bir diskoid kalvarial implantasyon için şekil (4 mm çapında), veya silindir (4 mm çapında, 6 mm uzunluk) için bir küresel şekle (2-mm çap) oluşturulur.
- Kısaca, PLGA / kloroform çözümler ısmarlama eksilerini oluşturmak için 200-300-mikron çaplı teflon kalıp içine dökme sakkaroz (polimer / sakaroz oranı 5/95, w / w) ile karışıktruct. Gece dondurarak kurutma sonra, iskele teflon kalıp kaldırılır ve sukroz eritmek için GKD 2 O dalmış. Iskelelerinin GKD 2 O. üç durulama takiben, 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde daldırılarak dezenfekte
- Apatit kaplama için, yapay vücut sıvısı (SBF) çözümü sırayla GKD 2 O içinde CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO 3 ve K 2 HPO 4 • 3H 2 O çözülmesiyle hazırlanmıştır Çözelti pH çözülürlüğünü artıracaktır 1M hidroklorik asit ilave edilerek 6 'e düşürülmüştür. Na 2 SO 4, KCl, ve NaCl eklenmiş ve nihai pH'ı 6.5 (SBF 1) 'e ayarlanır.
- Mg2 + ve HCO 3 - ücretsiz SBF (SBF 2) CaCl 2 ve GKD 2 O ve K 2 HPO 4 • 3H 2 O ekleyerek ve pH 6 indirilir tarafından hazırlanmıştır. KCl ve NaCl eklenmiş ve nihai pH'ı 6.8 'e ayarlanır. Bütün çözümler 0.22 um bir PES membr süzüldü sterildirane (Nalgene). Kaplama işlemi hemen önce, kurutulmuş PLGA iskelesi ıslatma ve kaplama yeknesaklık parıltı deşarjı iyileştirmek için argon plazma gravürü (harrick Scientific) tabi tutulur.
- Desenli iskeleleri sonra 12 saat SBF 1 inkübe ve Mg2 + ve HCO 3 değiştirilir - 37 başka bir 12 saat ücretsiz SBF 2 ° C nazik karıştırma altında. Kaplamalı iskeleleri fazla iyonları uzaklaştırmak için GKD 2 O ile yıkanır ve önceden ileri çalışmalar için liyofilize edilir.
3. Muscle Kılıfı Modeli İmplantasyonu
- PBS içinde bir PSC süspansiyon 100 ul (fosfat tamponlu tuz) hafifçe implantasyonu hemen önce küresel PLGA tabanlı implantın üzerine bırakılır. Hücreler bu nedenle in vivo izleme sonrası implantasyon izin verecek şekilde, Firefly lusiferaz of lentiviral ekleme tarafından önceden etiketli edilmiştir. Hücre yoğunluğu implant başına 2.5 x 10 5'tir.
- SCID (ağır kombine immün yetmezliği) farelerin yaş 6 hafta kullanılmaktadır. Hayvanlar anestezi vardırisofluran tarafından major'un ve buprenorfin (Bedford Labs) ile premedikasyon. Standart Betadine hazırlanmasından sonra, arka ayaklarda bilateral insizyon (uzunluğu boyuna ve 2 mm) yapılır.
- Cepler kas lifi uzun eksenine künt diseksiyon paralel biseps femoris kasları kesilir. Her fare için, PSC'ler ile PLGA tabanlı implant yerleştirilir ve kas örten fasya 5-0 Vicryl (Ethicon) ile sütüre edilir.
- Cilt yanındaki bir subkutiküler desen 5-0 vicryl ile kapatılır. 10 gün boyunca; Hayvanlar 48 saat ve TMP / SMX (Qualitest Trimetoprim / Sulfamethoxazole) için buprenorfin ile postoperatif tedavi edilir.
4. Kalvaryum Arıza Modeli İmplantasyonu
- SCID farelerinde (12-14 haftalık) ve izofluran anestezisi sonra, saçları kesilmiş ve cilt protokol başına betadin ile dezenfekte edilir.
- A 8 mm.lik kesi fare kalvaryumun orta sagital dikiş boyunca yapılır. Sonra, calvarial periost hafifçe Q-tip uygulama tarafından kaldırılır.
- Sonra, bir yüksek hızlı diş matkap elmaslı trepan bit kullanarak, 4 mm'lik parietal kemik defekti oluşturulur. Defekt tam kalınlıkta - ancak bakım altında yatan duramater kesmemeye alınır.
- Engrafted PSC'ler ile ısmarlama PLGA bazlı implant sonra kusurun sitesi içinde yavaşça yerleştirilir. Hücre yoğunluğu implant başına 2.5 x 10 5'tir. Son olarak, derinin 6-0 Vicryl ile dikilir edilir. Hayvanlar 48 saat ve 10 gün boyunca TMP / SMX için buprenorfin ile postoperatif tedavi edilir.
5.. Femoral bölüm Defekt Model İmplantasyonu
- Atimik sıçan (12-14 haftalık) isofluran anestezisi altında bulunmaktadır. Femur temizlendi ve betadin standart protokolü (Şekil 1) başına hazır.
- A 27-30-mm uzunlamasına insizyon femurun anterolateral yönü üzerinde yapılır. Femur sonra vastus lat ayırarak maruzeralis ve biseps femoris kasları (Şekil 2).
- Kemik rejenerasyonu tutarlılığı artırmak için femur kusur örten periost tamamen rezeke femoral segmentte ile kaldırılır.
- A plakalı polietilen (uzunluğu 23 mm; genişliği, 4 mm; yüksekliği, 4 mm) femur anterolateral yüzeyi üzerine yerleştirilir. Plaka 0.9 mm çapında yivli Kirschner (Zimmer) karşılamak için altı önceden delinmiş delikleri içerir. Bir şablon olarak plakası alarak, altı yivli Kirschner teli plakası ve iki korteksleri (Şekil 3) aracılığıyla delinir.
- Sonra, küçük bir el testeresi bıçağı (Stryker, MI) ile, 6 mm orta diafiz defekti oluşturulur. Defektlerinin sonra protokol uyarınca hücreleri (Şekil 4) yüklü olmuştur PLGA tabanlı implant yerleştirilmesi ile tedavi edilirler.
- Örten kas ve fasya yerine implant sabitlemek için 4-0 Vicryl emilebilir dikişlerle kapatılır ve cilt sütüre edilir.
6. Vivo Değerlendirmeleri yılında
- Radyolojik değerlendirmeler yüksek çözünürlüklü XR ve yüksek çözünürlüklü μCT (mikro bilgisayarlı tomografi) analizi ikisi tarafından uzunlamasına bir şekilde yapılmaktadır. ΜCT analizi (Skyscan 1172F) için, resimler 19.73 mikron (100 kV ve 100 mA radyasyon kaynağı, bir 0.5 mm alüminyum filtre kullanılarak) çözünürlükte taranır. Görüntüler DataViewer, Recon, CTAN ve CTVol yazılımları kullanılarak analiz edilmektedir.
- Biyolüminesens görüntüleme aynı zamanda hücre transplantasyon, canlılığı, proliferasyon değerlendirmek ve implant sitenin göç dışlamak için bir seri şekilde yapılır. Biyolüminesens görüntüleme bir IVIS Lumina II cihazı (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanılarak yapılır. Işık çıkışı Living Image Software (Xenogen) kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Toplam ışık çıkışı fotonlar / ² / saniye cm / steradyan kaydedilir.
- Histolojik ve histomorfometrik analizi otopsi yapılır. Istihdam Rutin lekeleri Masson'un trikrom, anilin mavisi, p dahilentachrome ve Picrosirius kırmızı. Histomorfometrik analizi osteoid sırasıyla, mavi ve koyu sarı göründüğü, anilin mavisi veya pentachrome lekeleri ya kolayca yapılır. Yüksek güç alanı başına düşen piksel Adobe Photoshop'ta sihirli değnek aracı kullanılarak hesaplanmıştır.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Kalvaryal ve femoral kusurları kritik iki boyutlu olduğu için, anlamlı bir iyileşme büyüme faktörleri veya ekzojen kök hücreleri ile tedavi olmadan beklenmelidir.
Cerrahi manevra açısından, kas kese Diseksiyon fascial düzlemler boyunca olmalıdır ve bu nedenle çok az kanama karşılaşılan edilmelidir. Kas kılıfı modeli bilateral olsa bile, fare postoperatif 1. günde rahatlıkla yürüyüş yapılmalıdır. Kalvaryal kusur için, kanama karşılaştı ama bir Q-tip ile ıslatılmış olabilir. Aşırı bakım yatan duramater kesmemeye dikkat edilmelidir - bu engel olacak şekildenormal iyileşme ile. FSD model için bakım nörolojik hasarı önlemek için aşırı kanama veya femoral sinir neden olmayacak şekilde büyük kan damarları kesmemeye alınır. Kirschner teli şekilde işleminde kortikal kemik zarar vermemek için nazik bir basınç ile delinir.
Şekil 1.. Atimik Sıçanlarda Femoral bölüm Defekt için Ameliyat öncesi hazırlık (FSD). Erkek sıçanlarda (12-14 haftalık) isofluran anestezisi altında bulunmaktadır. Femur temizlendi ve betadin ile standart protokol başına prepped.
Şekil 2. Femoral bölüm Defekt (FSD) oluşturulması için cerrahi pozlama. Bir 27-30 mm uzunlamasına insizyon femurun anterolateral yönü üzerinde yapılır. Femur lateral sonra vastus lateralis ayırarak maruzve biseps femoris kasları.
Şekil 3. Femoral bölüm Defekt (FSD) oluşturulması için Fiksasyon. A plakalı polietilen (uzunluğu 23 mm; genişliği, 4 mm; yüksekliği, 4 mm) femur anterolateral yüzeyi üzerine yerleştirilir. Plaka 0.9 mm çapında yivli Kirschner karşılamak için altı önceden delinmiş delikleri içerir. Bir şablon olarak plaka alarak, altı yivli Kirschner plaka ve her iki korteks ile delinir. Sonra, 6 mm orta diafiz defekti oluşturulur. Bu gerçekleştirildikten sonra, bir ölçüye iskelesi doğrudan tam olarak hangi (gösterilmemiştir) kusurun sitesi uyan sokulur.
Şekil 4. Postoperatif Kalvaryum Hata örneği. Bir 4 mm, dairesel kalvarial kusurun atimik farelerde sağ yan kemik oluşturulur. Görüntülü buraya takılan bir kusur sitesiAmeliyat sonrası 8 hafta PSC'ler. Defekt site içinde yeni kemik varlığını unutmayın.
Discussion
PSC'ler izolasyonu iyi özellikle PSC izolasyon protokolleri ve yöntemleri ele alan bir ayrı bir müracaat Vallahi yayını dahil olmak üzere, başka bir yerde 1-3 açıklanmıştır. Bu makalenin amacı, belirli bir kemik oluşumu / rejenerasyonu için in vivo uygulamada PSC için 3 protokollerini açıklamak ve göstermektir. SCID fare kas kılıfı ektopik insan kemik oluşumu 7 için yaygın olarak açıklanan model. Önemli farklar parakrin konak kemik yapan hücreler 8 ile etkileşim gibi iskelet defekt mikro mevcut osteojenik sinyalizasyon faktörlerin bolluğu da dahil olmak üzere kemik ektopik ve ortotopik (kusur) modelleri arasında var. İki kusurları, burada bir kalvaryal defect8 ve femoral segmental defekt 4 sunulmaktadır. Her ikisi de (yani kendi başlarına hiç iyileşmeyecek) ölçekli kritik olarak iyi belgelenmiştir.
İlginç farklılıklar kalvaryal ve femoral kusurları arasında var. İlk olarak,Hücre: xenografted PSC'ler ve endojen hücreler arasında hücre etkileşimi çok farklıdır. Bir kalvarial kusurun açısından, PSC'ler yatan duramater (menenjlerin en dış katmanın) yanı sıra, kusurun sitesi çevreleyen bu osteoblastlar ve periost hücreleri ile etkileşir. Önemlisi, nakledilen hücrelerin ve çevresindeki osteoblastlar 8, veya implante hücreleri ve altta yatan dura (Levi ve ark., Baskıda) arasındaki etkileşimi devam etmek osteogenezisi aracılık Normal kök hücre için önemlidir. Femoral segmental defekt (FSD) açısından, xenografted PSC'ler çok farklı hücre ve sitokin ortamına maruz kalmaktadır. Örneğin, FSD sitesi iliği ve ilişikteki mezenkimal kök hücrelerin yanı sıra endosteum, periost ve uzun kemik osteoblastlar oluşur. Teorik olarak, her bir hücre hasarı kendi reaksiyonu vardır ve her hücrenin olabilir: PSC xenogreftler ile hücre etkileşimleri.
Diğer belirgin farklılıklar kalvaryal arasında mevcutve femoral kusurları. Uzun kemikler bir kıkırdak ara (yon) ile ir yandan kalvaryal kemikler başlangıçta intramembranous kemikleşme yoluyla oluşturur. Dahası, onarıcı işlemi sonrasında yaralanması aynı zamanda, bu gelişme kökenleri taklit eder. Hiçbir kıkırdak ara bir parietal kemik defekti içinde oluşur ise Post-FSD, kıkırdak kallus oluşumu görülür. Son olarak, kafatasının embriyonik kökeni uzun kemiklerin farklı olabilir. Kafatası (- perisitler - perivasküler hücreler de dahil olmak üzere tüm kafa bölgesinde) çoğunluğu apendiküler iskelet paraxial mezoderm derivasyon 9 iken, nöral krest (mesectoderm) türetilmiştir. Bütün bu farklılıklar PSC-aracılı kemik onarımı açısından önemli farklılıklar neden olabilir.
PSC'ler kullanımı geleneksel yağ kaynaklı stromal hücreler (TSK) üzerinde birçok faydası vardır. PSC'ler kültür gerektirir ve saflaştırılmış hücre popülasyonu WHI vardır değilve hatta olumsuz düzenler - - osteojenik farklılaşması gibi 10 endotel hücreleri gibi ch yer almayan diğer stromal hücreleri içermez. Bunun aksine olarak, örneğin, TSK klonal analizleri sadece bir alt vitro 11'de osteojenik farklılaşma geçiren yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Sonuçta, iskelet doku mühendisliği çabaları olasılıkla en iyi iskelet kusurları iyileşecek şekilde eksojen büyüme faktörleri ile bir osteocompetent kök hücre (örneğin PSC'ler gibi) ve bir osteokondüktif iskelesi (örneğin HA-PLGA olarak mevcut yöntemlerde kullanılan) dahil edecektir.
Disclosures
KT, BP, ve CS UCLA'dan yayımlandı perivasküler kök hücre ile ilgili patent mucitleri. Dr. KT, ve CS UC Regents gelen perivasküler kök hücre ile ilgili patent alt lisansları Scarless Laboratories Inc kurucuları vardır. Dr Chia Soo da Scarless Laboratories, Inc bir subay olan
Acknowledgments
Bu çalışma CIRM Erken Translasyonel II Araştırma Ödülü TR2-01.821, NIH / NIDCR (hibe R21 DE0177711 ve RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10.677, AWJ ve RKS tarafından desteklenen sahip T32 eğitim bursu ödülü (5T32DE007296-14), JNZ Bir CIRM eğitim bursu (TG2-01.169) vardır.
References
- Crisan, M. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).
- Chen, C. W. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both. Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).
- Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells. Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).
- Zara, J. Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model. Plast. Reconstr. Surg. , Forthcoming (2010).
- James, A. W. Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo. Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).
- Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds. Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).
- Aghaloo, T. A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation. Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).
- Levi, B. Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts. Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).
- Leucht, P. Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135, 2845-2854 (2008).
- Rajashekhar, G. IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling. Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).
- Zuk, P. A. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).
