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Immunology and Infection

फिडेलिटी और वायरस वायरस उत्परिवर्तन आवृत्ति के शाही सेना के विशेषता के वेरिएंट के अलगाव

doi: 10.3791/2953 Published: June 16, 2011

Summary

वर्तमान लेख को अलग करने और शाही सेना वायरस और कैसे उत्परिवर्तन आवृत्ति डेटा का उपयोग करने के लिए निष्ठा टिशू कल्चर में परिवर्तन की पुष्टि की शाही सेना पोलीमरेज़ निष्ठा वेरिएंट विशेषताएँ करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन है.

Abstract

आरएनए वायरस आरएनए निर्भर शाही सेना पोलिमेरासिज़ का उपयोग करने के लिए उनके जीनोम को दोहराने. इन एंजाइमों के आंतरिक रूप से उच्च त्रुटि दर चरम जनसंख्या विविधता है कि वायरस अनुकूलन और विकास की सुविधा की पीढ़ी के लिए एक बड़ा योगदान है. सबूत बढ़ाने से पता चलता है कि आंतरिक त्रुटि दर, और शाही सेना वायरस के परिणामस्वरूप उत्परिवर्तन आवृत्तियों, सूक्ष्म वायरल पोलीमरेज़ करने के लिए अमीनो एसिड परिवर्तन द्वारा modulated किया जा सकता है. हालांकि जैव रासायनिक assays कुछ वायरल शाही सेना पोलिमेरासिज़ कि समावेश निष्ठा के मात्रात्मक उपाय की अनुमति के लिए मौजूद है, यहाँ हम कि के रूप में निष्ठा फेरबदल म्यूटेशन की पहचान करने में जैव रासायनिक दृष्टिकोण के रूप में सटीक साबित हो गया है आरएनए वायरस के उत्परिवर्तन आवृत्तियों को मापने की एक सरल विधि का वर्णन. दृष्टिकोण पारंपरिक virological और अनुक्रमण तकनीक है कि अधिकांश जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया जा सकता है है का उपयोग करता है. अलग - अलग वायरस के एक नंबर के साथ हमारे अनुभव के आधार पर, हम महत्वपूर्ण कदम है कि निष्ठा अलग वेरिएंट और सांख्यिकीय महत्व के डेटा पैदा करने की संभावना बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए पहचान की है. अलगाव और निष्ठा फेरबदल म्यूटेशनों के लक्षण वर्णन पोलीमरेज़ संरचना और समारोह 1-3 में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा, इन निष्ठा वेरिएंट वायरस अनुकूलन और विकास 4-7 के तंत्र निस्र्पक में उपयोगी उपकरण किया जा सकता है.

Protocol

1. उत्परिवर्तजन सांद्रता की सीमा निर्धारित करें कि न्यूनतम कोशिकाओं को विषाक्त है

इस अभ्यास का उद्देश्य निर्धारित करने के लिए क्या उत्परिवर्तजन सांद्रता के रेंज अतिरिक्त सेल विषाक्तता के बिना एक संक्रमण के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है. मूलतः, आप स्थिति है कि वायरस के संक्रमण के लिए आवश्यक हो जाएगा पुन: पेश करना चाहते हैं जाएगा. सबसे वायरस, पिछले 2 और 7 दिनों के बीच संक्रमण. प्रत्येक दिन में नमूना कोशिकाओं को पर्याप्त प्लेटें तैयार करें. यदि गैर पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, प्रोटोकॉल तदनुसार संशोधित.

  1. जिस दिन पहले प्रयोग, बीज 7 x 10 5 / 6 अच्छी तरह से एक थाली है कि उप - मिला हुआ एक monolayer (75%) प्रयोग के दिन को प्राप्त करने में अच्छी तरह से HELA कोशिकाओं. थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से उत्परिवर्तजन की एक अलग एकाग्रता के साथ इलाज किया जाएगा, 6 सांद्रता के एक श्रृंखला की अनुमति है.
  2. प्रयोग के दिन, टिशू कल्चर माध्यम में उत्परिवर्तजन dilutions तैयार करते हैं. HELA कोशिकाओं के लिए आधार analogs के लिए 0 से 1000 सुक्ष्ममापी की एक श्रेणी (ribavirin, 5 fluorouracil, 5 azacytidine), 2 MgCl के लिए 0 से 50 मिमी, और 2 MnCl के लिए 0 से 5 मिमी का उपयोग करें.
  3. कुओं से मध्यम Aspirate और 2 मिलीलीटर मध्यम उत्परिवर्तजन पूरक और इनक्यूबेटर वापसी के लिए के साथ की जगह.
  4. हर 24 घंटे, कक्षों की एक प्लेट का उपयोग करने के लिए सेल व्यवहार्यता की जांच. यह नीले trypan धुंधला प्रदर्शन या commercialized / प्रतिदीप्ति luminescence assays (जैसे Promega CellTiter-Glo ® Luminescent सेल व्यवहार्यता परख) का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है.
  5. Trypan नीले अपवर्जन धुंधला के लिए, एक प्लेट (उत्परिवर्तजन के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज) और धीरे centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं कोशिकाओं से अलग हैं.
  6. पीबीएस में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं (सीरम धुंधला के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं) को त्यागें.
  7. 1 मात्रा के साथ 0.4% trypan नीले, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते पीबीएस में 1 मात्रा सेल निलंबन मिक्स.
  8. एक hemacytometer में, (अस्थिर) व्यवहार्य और गैर - व्यवहार्य कोशिकाओं (नीला दाग) गिनती. उत्परिवर्तजन में से प्रत्येक एकाग्रता के लिए अनुपचारित नियंत्रण सहित व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना. हम जानते हैं कि स्थिति है कि संक्रमण endpoint के द्वारा कम से कम 50% कोशिका मृत्यु (जब अधिकतम titers पहुँच रहे हैं) में परिणाम उत्परिवर्तजन प्रतिरोध के अलगाव के लिए आदर्श होते हैं पाते हैं.

2. इष्टतम गैर विषाक्त उत्परिवर्तजन एकाग्रता कि मामूली वायरस titers कम कर देता है (लगभग 0.5-2 लॉग कमी) का निर्धारण

इस अभ्यास उत्परिवर्तजन की एकाग्रता है कि अधिक आबादी mutagenizing के बिना एक मजबूत चयनात्मक दबाव लागू होगा निर्धारित करता है. आरएनए उत्परिवर्तजन के लिए, हम पाते हैं कि इस वायरस टिटर में 10.5-2 लॉग कटौती करने के लिए संगत. इन सांद्रता में, हर जीनोम कम से कम एक या दो पदों में mutated है. उत्परिवर्तजन प्रतिरोध उत्परिवर्तन, जो तब बीतने पर चुना जाएगा पीढ़ी में सहायता कर सकते हैं. यदि भी कई परिवर्तन (बहुत उच्च सांद्रता में उत्परिवर्तजन) शुरू कर रहे हैं, प्रतिरोध उत्परिवर्तन असर म्यूटेंट खुद lethally mutagenized हो जाएगा, उनके अलगाव impeding.

  1. चरण 1 के लिए के रूप में एक ही शर्तों का उपयोग कोशिकाओं के साथ बीज प्लेटें
  2. प्रयोग के दिन, टिशू कल्चर माध्यम में उत्परिवर्तजन dilutions तैयार करते हैं. सांद्रता का एक ही रेंज इसके बाद के संस्करण के रूप में निर्धारित का उपयोग करें, लेकिन सांद्रता है कि 50 से अधिक% कोशिका मृत्यु के परिणामस्वरूप बाहर. पर्याप्त तैयार मध्यम प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार कवर (अच्छी तरह से 4 प्रति मिलीलीटर), कोशिकाओं के संक्रमण से पहले एक pretreatment के लिए अनुमति देता है उत्परिवर्तजन के प्रत्येक एकाग्रता के साथ.
  3. 2 घंटे के लिए मध्यम उत्परिवर्तजन पूरक में incubating उत्परिवर्तजन के साथ मध्यम और pretreat कोशिकाओं Aspirate. सबसे सेल प्रकार के लिए, इस उत्परिवर्तजन के तेज के लिए पर्याप्त समय है.
  4. मध्यम निकालें और संक्रमण के कम बहुलता MOI (0.1 या 0.01) एक न्यूनतम मात्रा में (6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 200 μl) के वायरस से संक्रमित है. 15-60 मिनट सेते वायरस कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अनुमति देते हैं. नियमित अंतराल पर थाली रॉक करने के लिए सुनिश्चित करें कि inoculum सेल monolayer शामिल है.
  5. Inoculated वायरस Aspirate और 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार धोने के लिए के रूप में संभव के रूप में inoculum की बहुत दूर.
  6. प्रत्येक 3-6 प्रतिकृति चक्र के बराबर के लिए अच्छी तरह से और सेते कोशिकाओं उत्परिवर्तजन की उचित सांद्रता के साथ मध्यम जोड़ें.
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से फसल काटने वाले वायरस और वायरस टिटर पर antiviral प्रभाव को निर्धारित है. यह मानक पट्टिका परख या कमजोर पड़ने सीमित (50 TCID) द्वारा किया जा सकता है . नोट: वायरस की तकनीक द्वारा मात्रा उपाय है कि केवल शाही सेना संश्लेषण उपयुक्त नहीं हो सकता है क्योंकि mutagenic प्रभाव का पता लगाया जा नहीं हो सकता है. Mutagenized घातक म्यूटेशन युक्त जीनोम अभी भी उदाहरण के लिए QRT-पीसीआर द्वारा पता लगाया जा, लेकिन वायरस व्यवहार्यता assays में मनाया नहीं होगा.
  8. गणना titers से 10.5-2 लॉग भी है कि कोशिकाओं (आदर्श, विषाक्तता कम से कम 50%) के लिए अत्यधिक नहीं विषाक्त द्वारा उत्परिवर्तजन की एकाग्रता (अनुपचारित नियंत्रण संक्रमण की तुलना में) है कि वायरस titers को कम कर देता है की पहचान.

3. अलगाव और पहचानउत्परिवर्तजन प्रतिरोधी वेरिएंट के दिखाएं

इष्टतम उत्परिवर्तजन ऊपर परिभाषित एकाग्रता में बड़ी आबादी का आकार मार्ग प्रदर्शन और बीतने श्रृंखला के पार वायरस titers की जाँच. किसी नियंत्रण के रूप में, किसी भी उत्परिवर्तजन बिना विकास माध्यम में पारित होने के वायरस. एक और नियंत्रण के रूप में दोषपूर्ण हस्तक्षेप कण (डि) के संभावित उद्भव पर नजर रखने के लिए, उत्परिवर्तजन के अभाव में प्रत्येक बीतने कदम (unpassaged नियंत्रण) के ताजा संक्रमण पर प्रदर्शन.

  1. संक्रमण के बीज, 25 सेमी से पहले दिन में 1.5 x 10 6 HELA कोशिकाओं (अन्य फ्लास्क आकार का इस्तेमाल किया जा सकता है) के साथ 2 बोतल उप - मिला हुआ monolayers अगले दिन प्राप्त करने के लिए.
  2. संक्रमण के दिन, प्रत्येक उत्परिवर्तजन के इष्टतम एकाग्रता, धारा 2 में निर्धारित युक्त मध्यम के साथ 2 घंटे के लिए कोशिकाओं pretreat.
  3. मध्यम निकालें और एक MOI का 1 या MOI सबसे बड़ा है कि दोषपूर्ण हस्तक्षेप (डि) कण के गठन में परिणाम नहीं के लिए वायरस का अध्ययन किया जा रहा करता है पर एक न्यूनतम मात्रा के साथ कोशिकाओं को संक्रमित.
  4. संक्रमण के 30-60 मिनट के बाद, inoculum aspirate और पीबीएस के साथ दो बार धोने, तो ताजा उपयुक्त सांद्रता में उत्परिवर्तजन के साथ पूरक मध्यम जोड़ने.
  5. 1 वर्गों और 2 जो इन परिस्थितियों में अधिकतम वायरस टिटर संगत में निर्धारित समय की अवधि के लिए सेते हैं. संतान वायरस हार्वेस्ट.
  6. प्रत्येक बीतने पर टिटर वायरस और 3 पिछले चरणों को दोहराएँ.
  7. पहले कुछ अंश के दौरान, उत्परिवर्तजन इलाज के नमूने के वायरस titers के अनुसार, मूल वायरस टिटर और नियंत्रण (अनुपचारित और unpassaged) वायरस titers की तुलना में छोड़ देना चाहिए. यदि उत्परिवर्तजन के वायरस titers passaged नमूने अनुपचारित नियंत्रण के रूप में एक ही स्तर के लिए वापस चढ़ाई, जनसंख्या की संभावना एक उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी संस्करण शामिल हैं. 20 या 30 अंश तक, आवश्यक हो सकता है हालांकि हम हमारे निष्ठा वेरिएंट के 5 और 15 अंश के बीच सबसे अलग.
  8. एक बार एक दिया पारित होने श्रृंखला के लिए वायरस titers अनुपचारित नियंत्रण titers के रूप में एक ही परिमाण तक पहुँचने, एक ही मार्ग संख्या से अनुपचारित नियंत्रण सहित सभी नमूनों से शाही सेना निकाल सकते हैं. शाही सेना निकासी किट या Trizol निकासी में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. RT-पीसीआर प्रदर्शन प्राइमरों कि हित के वायरस के पोलीमरेज़ या replicase जीन बढ़ाना का उपयोग. एक दूसरे चरण में, पूरे जीनोम (कम से कम कोडन क्षेत्रों) जांच करने के लिए कि प्रतिरोध phenotypes अन्य वायरस के जीन के लिए के रूप में अच्छी तरह से नक्शा अनुक्रम होना चाहिए. इस आधार ribavirin, जो वायरस और सेल समारोह के अन्य पहलुओं को प्रभावित करता है जैसे अनुरूप उत्परिवर्तजन, के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. इस मामले में संस्करण इन अन्य antiviral गतिविधियों के लिए प्रतिरोधी हो सकता है और एक विश्वस्तता संस्करण नहीं होगा हो सकता है.
  10. RT-पीसीआर एक पीसीआर शुद्धि किट और अनुक्रम का उपयोग करने के लिए जनसंख्या उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी आम सहमति अनुक्रम प्राप्त उत्पादों शुद्ध. अनुक्रमण त्रुटि के लिए पृष्ठभूमि नियंत्रण शामिल (चर्चा देखें).
  11. एक संदर्भ के रूप में एक अनुक्रम संरेखण सॉफ्टवेयर और वायरस आम सहमति अनुक्रम का प्रयोग, दृश्यों संरेखित करें. किसी भी है कि उत्परिवर्तजन इलाज आबादी में विशेष रूप से बीतने पर दिखाई देते हैं जहां वायरस titers सामान्य स्तर तक पहुँचने के लिए विशेष ध्यान के साथ नए बिंदु उत्परिवर्तन को पहचानें. यदि यह परिवर्तन पहले के मार्ग में मौजूद है और एक ही मार्ग संख्या (सेल संस्कृति पारित होने के लिए अनुकूलन का संकेत) से अनुपचारित नियंत्रण में मौजूद नहीं है नहीं है, तो इस परिवर्तन की संभावना जिम्मेदार है, भाग में कम से कम उत्परिवर्तजन प्रतिरोध के लिए. आधार बुलाया अनुक्रम (अनुक्रम का पाठ संस्करण) और संरेखण सॉफ्टवेयर अकेले पर भरोसा मत करो. अल्पसंख्यक चोटियों कि संरेखण सॉफ्टवेयर द्वारा याद किया गया हो सकता है के लिए चेक chromatograms. एक उत्परिवर्ती कुल जनसंख्या का 20-30% का प्रतिनिधित्व अब भी एक चोटी के रूप में दिखाने के लिए, लेकिन बहुत छोटे के लिए एक मानक अनुक्रम विश्लेषण द्वारा 'एन' के रूप में पहचाना जा.

4. अलग एक बार एक उत्परिवर्तन की पहचान की गई है, या संस्करण पैदा करते हैं और कई शाही सेना उत्परिवर्तजन करने के लिए प्रतिरोध phenotype पुष्टि

अगले, पहचान संस्करण पेश उत्परिवर्तन प्रतिरोध phenotype के लिए लिंक की पुष्टि करने के लिए अलग है. यह आवश्यक है कि निष्ठा बदलने की संदिग्ध उत्परिवर्तन एक आनुवंशिक साफ पृष्ठभूमि में अध्ययन किया है (जो है, पेश अतिरिक्त म्यूटेशनों जीनोम में कहीं नहीं है). सबसे अच्छी स्थिति में है, एक संक्रामक सीडीएनए क्लोन मौजूद है कि साइट पर एक साफ आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्देशित mutagenesis के द्वारा उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी संस्करण के एक शेयर की पीढ़ी की अनुमति होगी. इस मामले में धारा 4 के लिए आवश्यक नहीं है. हालांकि, अगर एक सीडीएनए क्लोन उपलब्ध नहीं है, अलगाव वायरस की पट्टिका शुद्धि, नीचे वर्णित किया जा सकता है. पट्टिका शुद्धि के एक से अधिक दौर के लिए एक साफ, आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर संस्करण को अलग करने के लिए आवश्यक हो सकता है है.

  1. पट्टिका परख द्वारा उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी उत्परिवर्ती के अलगाव.
    1. अलग पहचान उत्परिवर्ती, agarose (0.5 से 1% अंतिम wt / खंड) 6 अच्छी तरह प्लेटें में उपरिशायी के तहत एक मानक पट्टिका परख करते हैं. वायरस के धारावाहिक dilutions, शेयर titers के आधार पर तैयार करने के लिए दिलutions है कि 10 और 50 अच्छी तरह से अलग सजीले टुकड़े के बीच का उत्पादन होगा.
    2. जब सजीले टुकड़े स्पष्ट रूप से दिखाई (आमतौर पर 2 से 5 दिन पोस्ट संक्रमण, वायरस के आधार पर) कर रहे हैं, प्लेटों पर सजीले टुकड़े के स्थान चिह्नित करने और फिल्टर टिप के साथ एक P200 पिपेट का उपयोग करने के लिए, धीरे agarose उपरिशायी किया जा रहा है के माध्यम से टिप डुबकी के लिए सावधान नहीं बेदखल और ओवरले की स्थिति में बदलाव (जो व्यक्तिगत सजीले टुकड़े के पार संदूषण में नतीजा होगा).
    3. ध्यान से टिप उपरिशायी के बाहर उठा और एक मध्यम और भंवर के 250 μl युक्त Eppendorf टिप में निहित agarose प्लग हस्तांतरण. मत करो चिंता मत करो अगर टिप है कि हटा दिया है agarose नहीं शामिल करता है, कई आरएनए वायरस के लिए, कई आरएनए वायरस के लिए एक औसत पट्टिका 10 5 वायरस होते हैं और एक पर्याप्त राशि पट्टिका की सतह के लिए टिप छू द्वारा बस हस्तांतरित होगा.
    4. उत्परिवर्तजन उपचार 10 प्रति सजीले टुकड़े उठाओ. अनुक्रमण कि उत्परिवर्तन की पहचान की chromatograms पर निर्भर करता है, लगभग अनुमान जनसंख्या का प्रतिशत क्या वांछित उत्परिवर्तन होता है. उद्देश्य उत्परिवर्तन के साथ तीन या चार सजीले टुकड़े अलग है. इन म्यूटेंट के कुछ भी अतिरिक्त, अवांछित म्यूटेशनों, जो बाद में अनुक्रमण द्वारा पहचाना जाएगा ले जाएगा.
    5. इन नमूनों से शाही सेना निकालें (लेकिन नमूना के आधे से बचाने के लिए वायरस का एक बड़ा स्टॉक बनाने के लिए), और RT-PCRs है कि संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण की अनुमति देगा प्रदर्शन. इस प्रकार, अनुक्रम 3 या 4 पट्टिका एक समय में वायरस शुद्ध को अलग करने के लिए कि किसी भी अतिरिक्त परिवर्तन के बिना वांछित उत्परिवर्तन होता है की पहचान, औसत पर, आरएनए वायरस आम सहमति अनुक्रम करने के लिए सम्मान के साथ दो mutational अंतर करने के लिए शामिल होंगे.
    6. एक बार की पहचान की है, सभी बहाव के अध्ययन के लिए इस वायरस का एक बड़ा शेयर करना, पट्टिका शुद्ध ऊपर प्राप्त नमूने का उपयोग करने के लिए एक T75 फ्लास्क में कोशिकाओं, जैसे 8x10 6 HELA कोशिकाओं का बड़ा फ्लास्क को संक्रमित ..
  2. उत्परिवर्तजन संवेदनशीलता / प्रतिरोध की पहचान उत्परिवर्तन द्वारा प्रदत्त की पुष्टि करें.
    1. पृथक या नव उत्पन्न क्लोन है, और एक जंगली प्रकार नियंत्रण वायरस समान शर्तों के तहत तैयार का प्रयोग, 2 खंड में प्रयोग दोहराने या तो उत्परिवर्तजन सांद्रता का एक पूरी रेंज, या एकाग्रता, जिस पर प्रतिरोध उत्परिवर्तन उत्पन्न किया गया है का उपयोग.
    2. कई अलग अलग शाही सेना mutagenic शर्तों का उपयोग करें (ribavirin, 5 fluorouracil, 5 azacytidine, वृद्धि हुई मिलीग्राम 2 + 2 Mn + ). यदि पोलीमरेज़ संस्करण उत्परिवर्तजन के एक से अधिक प्रकार के लिए प्रतिरोधी है, तो यह अधिक संभावना है कि इस प्रकार उच्च विश्वस्तता है. वैकल्पिक रूप से, यह संभव है कि एक प्रतिरोध उत्परिवर्तन एक एकल mutagenic हालत के लिए विशिष्ट है, खासकर के बाद से 8 तंत्र के एक नंबर के माध्यम से इन यौगिकों के कुछ आरएनए वायरस को प्रभावित.

5. प्रतिकृति दरों की जाँच करें

चूंकि निष्ठा म्यूटेशनों सबसे अक्सर पोलीमरेज़ नक्शा फेरबदल, यह संभव है कि एक ही पोलीमरेज़ उत्परिवर्तन काफी प्रतिकृति कैनेटीक्स बदल जाएगा और यह महत्वपूर्ण है को समानता और प्रतिकृति में मतभेद है कि उत्परिवर्तन आवृत्तियों में मतभेद की एक बेहतर तुलना के नीचे प्रदर्शन की अनुमति होगी निर्धारित. एक है कि वायरस उत्पादन और दूसरा कि शाही सेना संश्लेषण की जाँच की जाँच - ऐसा करने के लिए, कम से कम दो मानार्थ दृष्टिकोण द्वारा नकल की जांच.

  1. एक कदम वायरस विकास कैनेटीक्स
    1. जिस दिन पहले प्रयोग, 6 अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में जरूरत के बीज, समय पर परीक्षण किया जा बिंदु प्रति एक प्लेट. प्रत्येक उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के वायरस के लिए तीन प्रतियों कुओं का उपयोग पर विचार करें.
    2. प्रयोग के दिन, मध्यम हटाने और प्रत्येक वायरस के साथ एक 10 MOI में कुओं करने के लिए सुनिश्चित करें कि हर कोशिका एक साथ संक्रमित है संक्रमित. 37 पर 30-60 मिनट सेते ° सी.
    3. रॉक हर 10 मिनट प्लेटों के लिए सेल monolayer के सूखने से बचने. वायरस निकालें और 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार धोने. यह महत्वपूर्ण है के रूप में संभव के रूप में inoculum की बहुत दूर. मध्यम विकास के साथ बदलें.
    4. = 0, फसल के वायरस के समय में एक थाली से संक्रमण के बाद. इनक्यूबेटर करने के लिए प्लेटें लौटें और नियमित अंतराल है कि एक एकल प्रतिकृति चक्र (3h के लिए उदाहरण के लिए, 5H, 7, 9h, 12h, 24 घंटों) की अवधि पर वायरस फसल.
    5. टिटर वायरस, हर बार बिंदु (जैसे पट्टिका परख, TCID50, FFU परख) पर काटा, और ग्राफ टिटर बनाम समय के विकास घटता.
  2. शाही सेना संश्लेषण के कैनेटीक्स
    शाही सेना संश्लेषण के कैनेटीक्स दृष्टिकोण के नीचे संकेत का उपयोग कर नजर रखी जा सकता है. यदि संभव हो तो, एक ही नमूने के लिए एक कदम विकास कैनेटीक्स का निर्धारण किया जाता शाही सेना के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    1. QRT - पीसीआर. इस प्रक्रिया में एक बड़ी रेंज पर प्रतिकृति के अत्यधिक मात्रात्मक उपायों देता है, कुछ जीनोम प्रतियां से 10 10> परख की संवेदनशीलता पर निर्भर करता है. डिजाइन प्राइमरों और जांच है कि एक अत्यधिक संरक्षित जीनोमिक क्षेत्र का एक छोटा सा टुकड़ा (<200 बीपी) को कवर. उत्तरी धब्बा विश्लेषण. कम QRT - पीसीआर की तुलना में मात्रात्मक हालांकि, इस तकनीक का दृश्य पुष्टि परमिट कि प्रतिकृति परिणाम पूर्ण लंबाई जीनोम में और कोई महत्वपूर्ण श्रृंखला समाप्ति पोलीमरेज़ उत्परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में होता है.
    2. एक पत्रकार के जीन की अभिव्यक्ति. यदि एक सीडीएनए क्लोन व्यक्त एक पत्रकार जीन (जैसे luciferase) उपलब्ध है, तो यह replicative क्षमता की जांच के किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, अन्य अनुप्रयोगों (जैसे उत्परिवर्तन आवृत्ति का निर्धारण) के लिए पुनः संयोजक वायरस का उपयोग नहीं किया है के बाद से इस वायरस पर अभिनय चयनात्मक दबाव ही नहीं हो, विशेष रूप से के बाद से इन वायरस डाला रिपोर्टर जीन को हटाने की प्रवृत्ति है चाहिए.

6. उपाय उत्परिवर्तन आवृत्तियों

यह पुष्टि है कि पहचान पोलीमरेज़ उत्परिवर्तन उत्परिवर्तजन बदल प्रतिकृति निष्ठा प्रतिरोध प्रदान करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि यहाँ मापा उत्परिवर्तन आवृत्तियों उत्परिवर्तन दरों को नहीं हैं है. दरों, प्रतिकृति कैनेटीक्स का एक बहुत सावधान माप (संश्लेषित शाही सेना की राशि और प्रतिकृति चक्र की लंबाई) निर्धारित करने के लिए उत्परिवर्तन आवृत्तियों लेकिन मापने के अंदर सकारात्मक असर होना चाहिए, के रूप में लंबे समय बीतने के इतिहास और प्रतिकृति कैनेटीक्स के रूप में निगरानी कर रहे हैं, प्रतिकृति की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मात्रात्मक उपायों प्रदान करता है निष्ठा. उत्परिवर्तन आवृत्तियों व्यवहार्य वायरस जनसंख्या (पट्टिका क्लोन या कमजोर पड़ने सीमित) में या कुल वायरस जनसंख्या (वायरस शेयर या सतह पर तैरनेवाला) में निर्धारित किया जा सकता है है. उत्परिवर्तन आवृत्तियों का निर्धारण करने के लिए, बाद में एक मार्ग (जैसे 2 बीतने या परे) से वायरस स्टॉक तैयार है. यह महत्वपूर्ण है कि वायरस जनसंख्या के एक संतुलन उत्परिवर्तन चयन करने के लिए करीब करने के लिए अपने आनुवंशिक विविधता का विस्तार करने का समय पड़ा है.

  1. व्यवहार्य वायरस जनसंख्या का उत्परिवर्तन आवृत्तियों
    यह दृष्टिकोण, हालांकि अधिक श्रमसाध्य, कितने म्यूटेशनों औसत जीनोम कि प्रतिकृति क्षमता बरकरार रखती है पर मौजूद हैं पर जानकारी देता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए तथापि, कि उच्च फिटनेस वेरिएंट के लिए एक पूर्वाग्रह घटित होगा और कम रखरखाव, व्यवहार्य वेरिएंट है कि आसानी से पट्टिका नहीं है, उदाहरण के लिए, पता नहीं किया जा सकता है. जैसे, यह भी पर्याय के बेहतर उपाय (डी एस) और गैर पर्याय (DN) nucleotide substitutions है कि चाहे सकारात्मक चयन जनसंख्या पर काम कर रहा है पता लगाने के इस्तेमाल किया जा सकता है परमिट. हालांकि, क्योंकि कम म्यूटेशनों मात्रा निर्धारित किया जाएगा, दृश्यों की एक बड़ी संख्या में सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक हो जाएगा. इस तकनीक को या तो पट्टिका शुद्धि या कमजोर पड़ने सीमित द्वारा अलग - अलग वायरस के अलगाव पर निर्भर करता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, हम 48 जंगली प्रकार के वायरस और उत्परिवर्तजन - प्रतिरोधी संस्करण के व्यक्तिगत "क्लोन" के अलगाव की सलाह देते हैं. प्रत्येक clonal इस तरीके से अलग आबादी के लिए ले जाने के उत्परिवर्तन जो भी संस्थापक जीनोम प्रस्तुत की उम्मीद है. शाही सेना की राशि पृथक पट्टिका में मौजूद हैं या कमजोर पड़ने अच्छी तरह से आम तौर पर सीमित है RT-पीसीआर द्वारा प्रवर्धन के लिए पर्याप्त है. यदि आवश्यक हो, कक्षों की एक न्यूनतम संख्या (जैसे 24 अच्छी तरह से थाली प्रारूप) पर एक छोटी प्रवर्धन (कम से कम एक प्रतिकृति चक्र) अधिक शाही सेना प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, न्यूनतम प्रवर्धन नए परिवर्तन के संचय से बचने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए है. ध्यान दें कि प्रत्येक क्लोन और आबादी की तुलना में प्रतिकृति चक्र का एक ही नंबर से गुजरना चाहिए.
    1. पट्टिका शुद्धि या सीमित कमजोर पड़ने से 24 से 48 वायरस क्लोन अलग.
    2. पृथक clonal आबादी से शाही सेना निकालें
    3. RT-पीसीआर 3kb प्रत्येक नमूना के लिए कवर टुकड़ा बढ़ाना. यह सबसे अच्छा है के लिए संरचनात्मक प्रोटीन क्षेत्र है, जो गैर संरचनात्मक जीन की अधिक संरक्षित क्षेत्रों की तुलना में अधिक व्यावहारिक परिवर्तन को बर्दाश्त जाता कवर.
    4. पीसीआर उत्पादों अनुक्रम, शुद्ध और उत्परिवर्तन विश्लेषण (7 खंड) का प्रदर्शन.
  2. वायरस की कुल जनसंख्या का उत्परिवर्तन आवृत्तियों
    हालांकि इस दूसरी विधि का एक लाभ यह है कि यहां तक ​​कि कम फिटनेस वेरिएंट अनुक्रमण में शामिल किया जाएगा, परिवर्तन के स्पेक्ट्रम के एक व्यापक तस्वीर की अनुमति है. हालांकि, यह वंशावली विश्लेषण है कि व्यवहार्य वायरस की आबादी (जैसे मूल्यों / DN डी एस) और सबसे अधिक प्रासंगिक परिवर्तन की पहचान मान के लिए आदर्श नहीं हो सकता है, के बाद से घातक परिवर्तन (बदल शाही सेना संरचना, रोक codons, नाटकीय एमिनो एसिड परिवर्तन) पूरी तरह से पहचान नहीं कर सकते हैं और विश्लेषण में बनाए रखा जाएगा. फिर भी, यह इस तकनीक शोधकर्ता परमिट के लिए सबसे सांख्यिकीय महत्वपूर्ण डेटा प्राप्त करने के लिए निष्ठा के परिवर्तन की पुष्टि जब वहाँ इन विट्रो जैव रासायनिक परख में एक की कमी है. यह तकनीक कम फिटनेस या घातक परिवर्तन है कि सजीले टुकड़े का उत्पादन नहीं होगा के साथ जीनोम सहित कुल virion शाही सेना, RT-पीसीआर प्रवर्धन पर निर्भर करता है है. उत्परिवर्तन इस विधि द्वारा प्राप्त आवृत्तियों 10 गुना पट्टिका या कमजोर पड़ने क्लोनिंग सीमित द्वारा की तुलना में उच्च किया जा सकता है.
    1. Virion की कुल आबादी से शाही सेना निकालें
    2. RT-पीसीआर amplify 800 से 1200 जीनोमिक कोडन अनुक्रम कि परिवर्तन सहन और आनुवंशिक विचरण (उदाहरण के लिए संरचनात्मक प्रोटीन) जाना जाता है के एक भाग के से nucleotide क्षेत्र. बड़े टुकड़े आसानी TopoTA जैसे क्लोनिंग वैक्टर में सम्मिलित नहीं और transformants की अपर्याप्त संख्या का उत्पादन होगा. हालांकि छोटे टुकड़े भी बेहतर कर रहे हैं, जीनोम अनुक्रम का कवरेज भी सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने के लिए कुछ हो सकता है. कम से कम 800 बीपी का एक टुकड़ा दो प्राइमरों के साथ अनुक्रम कवरेज परमिट और अनुक्रम अधिकतम कवरेज और अनुक्रमण लागत कम से कम के बीच एक अच्छा समझौता है है. हमें लगता है कि दृश्यों के बीच 70 और 100 एक 800 nucleotide क्षेत्र को कवर reproducibly वेरिएंट हम प्रयोगशाला में अध्ययन किया है बदल निष्ठा की पुष्टि. ध्यान दें कि अन्य वेक्टर / क्लोनिंग तरीकों समान दक्षता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
    3. RT-पीसीआर उत्पाद शुद्ध एक वाणिज्यिक या मानक डीएनए निष्कर्षण / वर्षण द्वारा किट का उपयोग.
    4. यदि RT-पीसीआर एंजाइमों आप उपयोग overhangs उपज नहीं है, एक सुक्ष्ममापी एटीपी और Taq पोलीमरेज़ जोड़कर एक 10 मिनट के विस्तार प्रदर्शन
    5. निर्माता के निर्देशों निम्नलिखित TopoTA क्लोन
    6. प्रत्येक वायरस जनसंख्या का अध्ययन किया जा करने के लिए, 96 कालोनियों, XGal लेपित प्लेटों पर एक नीले / सफेद स्क्रीनिंग द्वारा सकारात्मक डालने वाले के रूप में पहचान का चयन करें. प्रारंभ में, प्रत्येक अलग जीनोम क्षेत्र क्लोन किया जा रहा के लिए आवेषण की उपस्थिति का परीक्षण, agarose जैल या एकल कॉलोनी पीसीआर पर प्लाज्मिड आकार स्क्रीनिंग द्वारा नीले / सफेद स्क्रीनिंग की वैधता की पुष्टि करने के लिए. टुकड़ा आकार और उपरोक्त शर्तों का उपयोग करना, हम 90% सकारात्मक प्राप्त करने के
    7. तरल शोरबा में प्रत्येक कॉलोनी रातोंरात लेग माध्यम से 1 मिलीलीटर में 96 अच्छी तरह से बैक्टीरिया संस्कृति प्लेटों में आगे बढ़ें
    8. अगले दिन 96 अच्छी तरह प्रारूप में minipreps तैयार करते हैं.
    9. अनुक्रम पर्याप्त प्राइमरों (उदाहरण के लिए RT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों, या TopoTA m13 प्राइमरों) क्लोन खंड की अधिकतम कवरेज प्राप्त करने के साथ प्रत्येक थाली. उत्परिवर्तन विश्लेषण प्रदर्शन (7 अनुभाग).

7. अनुक्रम विश्लेषण

अनुक्रम विश्लेषण का उपयोग कर एक संदर्भ या प्रत्येक जनसंख्या और उचित संरेखण सॉफ्टवेयर के लिए आम सहमति अनुक्रम प्रदर्शन. हम Lasergene या Sequencher है कि आम सहमति के लिए सम्मान के साथ आसानी से SNPs की पहचान कर सकते हैं सलाह देते हैं.

  1. उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे Lasergene या Sequencher) का उपयोग कर दृश्यों संरेखित करें.
  2. गरीब गुणवत्ता दृश्यों (बुरा आधार बुला रहा था, भी कई 'एन या लंबाई में बहुत छोटा) त्यागें. Nucleotide रेंज है जो सभी दृश्यों के द्वारा कवर किया जाता है पहचानें. जीनोम के विभिन्न क्षेत्रों के बाद से और अधिक या कम म्यूटेशनों बर्दाश्त नहीं करेगा, तुलना कारणों के लिए यह आवश्यक है कि एक ही क्षेत्र पूरी तरह से विश्लेषण के लिए प्रत्येक अनुक्रम बनाए रखा क्लोन के लिए कवर किया जाता है. इस प्रकार, यदि कई अनुक्रम प्रतिक्रियाओं प्रति क्लोन प्रदर्शन कर रहे हैं, और एक अनुक्रम एक दिया क्लोन के लिए विफल रहता है, विश्लेषण से क्लोन (सभी दृश्यों) त्यागें.
  3. पहचानें और SNPs कि संदर्भ तनाव से अलग कर रहे हैं गिनती.
  4. Nucleotides के अनुक्रम (क्लोन क्षेत्र अनुक्रम एक्स लंबाई की संख्या) कुल संख्या के द्वारा की पहचान की SNPs के कुल संख्या को विभाजित करके उत्परिवर्तन आवृत्ति गणना. इस संख्या को पेश 10K NT के अनुक्रम के अनुसार परिवर्तन की औसत संख्या के रूप में संख्या में और अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल तो renders यह nucleotide प्रति के रूप में छोड़कर. उदाहरण के लिए, तालिका 1, 55 में जंगली प्रकार जनसंख्या के लिए mutations/121, 978 कुल १०,००० एक्स nucleotides = 10,000 nucleotides प्रति 4.51 म्यूटेशनों अनुक्रम.
  5. यदि एक ही SNP क्लोनों की एक बड़ी संख्या पर दिखाई देता है, दो मानों कि शामिल करने या बाहर इन दोहराया म्यूटेशनों उपस्थित थे. आम तौर पर, एक वायरस एक समरूप माता पिता (पट्टिका शुद्धि या एक संक्रामक क्लोन से) से उत्पादन और सेल संस्कृति में केवल एक बार कुछ passaged आबादी के लिए सकारात्मक चयन इसके प्रभाव पर्याप्त नहीं exerted है वही SNP का संचय और उत्परिवर्तन के कारण आवृत्ति मूल्यों मापा सकारात्मक या शुद्ध चयन के कम से कम प्रभाव के साथ इस तरह बेहतर पोलीमरेज़ की आवृत्ति त्रुटि को प्रतिबिंबित.
  6. उत्परिवर्तन वितरण का निर्धारण करते हैं. प्रत्येक आबादी में एक क्लोन की संख्या के स्थान पर सूची है कि मौजूद 0, 1, 2, 3, आदि .. क्षेत्र में परिवर्तन अनुक्रम.
  7. जोड़ो दूरी की तुलना द्वारा वायरल जनसंख्या विविधता की गणना. से और साफ दस्ती रूप से संपादित दृश्यों संदर्भ क्षेत्र सहित एक संरेखण तैयार. ClustalW / एक्स (वहाँ कई संरेखण प्रोग्राम उपलब्ध हैं: http://www.clustal.org/ ), मांसपेशी ( http://www.drive5.com/muscle/ ), मैक उपयोगकर्ताओं के लिए EbioX ( http://www. ebioinformatics.org / / ebiox ), आदि यह सुनिश्चित करें कि आपके सभी दृश्यों को एक ही लंबाई हैं, यदि आवश्यक हो तो फसल. यह सिफारिश की है कि दृश्यों की शुरुआत एक कोडन codon पीछे विश्लेषण की सुविधा है. हम fasta स्वरूप है, जो आसानी से से सबसे उपलब्ध सॉफ्टवेयर के द्वारा पढ़ा है में सभी संरेखण रखने के सुझाव देते हैं.
  8. पर्याय (डी एस) और जनसंख्या के भीतर गैर पर्याय (DN) मान आसानी से प्राप्त किया जा सकता है. हम मेगा सॉफ्टवेयर (http://www.megasoftware.net/) उपयोगी और विश्लेषण के इस तरह के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल पाते हैं.
  9. चयन दिशा प्राप्त करने के लिए हम दो संभावनाओं दे हालांकि वे केवल संभव वाले नहीं हैं. 1) डी.एन. और डी एस के बीच अनुपात प्राप्त करते हैं. 1 से अधिक मान सकारात्मक चयन मतलब है. 1 से कम मान शुद्ध चयन मतलब है. 2) का प्रयोग करें Datamonkey वेबसर्वर (http://www.datamonkey.org/ ). Fasta प्रारूप में अपने संरेखण को अपलोड करने और उन्हें SLAC मॉड्यूल के साथ विश्लेषण. यह आपको DN / डी एस के एक अनुमान दे देंगे.
  10. सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करना. डेटा और दृश्यों की संख्या की मात्रा पर निर्भर करता है, परीक्षणों के एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है. कुछ अध्ययनों से जहां सभी क्लोनों 9 संयुक्त कर रहे हैं आम सहमति nucleotides की कुल संख्या बनाम परिवर्तन की कुल संख्या के ची वर्ग परीक्षणों पर भरोसा है. अन्य अध्ययनों फिशर सटीक परीक्षण प्रदर्शन किया है, 10 म्यूटेशनों के बिना दृश्यों की संख्या की तुलना में परिवर्तन पेश दृश्यों की संख्या पर गणना. यदि पर्याप्त mutational डेटा उत्पन्न होता है, हम जैसे मान व्हिटनी अमेरिकी रैंक राशि परीक्षण ऐसा करने के लिए प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं, प्रत्येक शाही सेना अनुक्रम पर मौजूद म्यूटेशनों की संख्या से प्रत्येक वायरस आबादी में क्लोनों की संख्या रैंक. मान व्हिटनी तो आबादी के उत्परिवर्तन के वितरण में मतभेद के लिए परीक्षण करेंगे. इस कारण से, हम कम से कम 800 आधार जोड़े अनुक्रमण अनुशंसा करते हैं, कई म्यूटेशनों के साथ क्लोन खोजने की संभावना में वृद्धि. यह परीक्षण मजबूत है, लेकिन बड़ा नमूना आकार की आवश्यकता है. दूसरी ओर, यह दो आबादी की तुलना की जा रही के लिए एक ही नमूना आकार की आवश्यकता नहीं है (उदाहरण के लिए, तालिका 1 से नमूने n 1 = 148 और 2 n = 84).

8. प्रतिनिधि परिणाम:

सेल व्यवहार्यता और वायरस व्यवहार्यता पर उत्परिवर्तजन एकाग्रता की खुराक पर निर्भर प्रभाव चित्र 1 में दिखाया गया है इस उदाहरण में, हमने पाया कि 100 सुक्ष्ममापी AZC में वायरस पारित वायरस टिटर में लक्षित लॉग 10.5-2 द्वारा कम किया गया था, लेकिन HeLa सेल व्यवहार्यता था 2 वायरस के संक्रमण के लिए आवश्यक दिनों के दौरान नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं है. इस पायलट वायरस के धारावाहिक पारित करने के लिए 100 सुक्ष्ममापी AZC एकाग्रता का चुनाव करने के लिए नेतृत्व में प्रयोग उत्परिवर्तजन प्रतिरोध के लिए चयन करने के लिए चित्रा 2 टिटर में प्रारंभिक कमी, एक उत्परिवर्तजन प्रतिरोध phenotype के उद्भव के बाद दिखाता है.. उत्परिवर्तजन में पहले कुछ अंश के दौरान, के रूप में घातक म्यूटेशनों संचित, वायरस titers में एक महत्वपूर्ण गिरावट होती है. धीरे धीरे, एक उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी संस्करण उभर एक अपने उद्भव वायरस titers कोई अनुपचारित नियंत्रण से अलग करने के लिए एक वापसी के साथ मेल खाता है. इस स्तर पर, वायरस की आबादी का एक बड़ा प्रतिशत प्रतिरोध उत्परिवर्तन प्रस्तुत करता है. इस वायरस की आबादी का अनुक्रमण एमिनो एसिड परिवर्तन (ओं) को जिम्मेदार पता चलता है. एक बार की पहचान की है, और अलग या उत्पन्न नव प्रतिरोधी वायरस उत्परिवर्तजन अलग शाही सेना उत्परिवर्तजन जंगली प्रकार (अलग संरचना के आधार analogs, उदाहरण के लिए) की तुलना में कम संवेदनशील चित्रा 3 एक शाही सेना उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी Coxsackie वायरस B3 कि अधिक से अधिक titers से पता चलता है. सकता है ribavirin, 5 फ्लूरोरासिल, और 5 azacytidine, और उच्च 2 MgCl और MnCl 2 की उपस्थिति में जंगली प्रकार. शाही सेना उत्परिवर्तजन ब्रॉड प्रतिरोध वृद्धि हुई प्रतिकृति निष्ठा के एक मजबूत संकेत है. निष्ठा प्रकार की प्रतिकृति कैनेटीक्स सत्यापित जंगली प्रकार के वायरस के समान है उत्परिवर्तन आवृत्तियों की तुलना में सहायता करेगा चित्रा 4 जंगली प्रकार की तुलना में एक उच्च विश्वस्तता संस्करण की एक कदम विकास कैनेटीक्स दर्शाया गया है. . यदि प्रतिकृति दरों और अंतिम titers समान नहीं हैं, तो कदम समान आकार के वायरस आबादी, कि प्रतिकृति के दौर के एक ही नंबर आया है की तुलना में ले लिया होना चाहिए. शाही सेना संश्लेषण की दर और प्रतिकृति निष्ठा के बीच की कड़ी vivo में, विशेष रूप से अच्छी तरह विशेषता नहीं है . एक धीमी प्रतिकृति दर कम उत्परिवर्तन आवृत्ति (उच्च विश्वस्तता) में परिणाम है, हालांकि यह एक पूर्ण नियम नहीं है हो सकता है, के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है. उपरोक्त मापदंडों के साथ स्थापित, निष्ठा संस्करण और जंगली प्रकार आबादी के उत्परिवर्तन आवृत्तियों बदल प्रतिकृति निष्ठा की आनुवंशिक पुष्टि प्राप्त की तुलना में किया जा सकता है 5 चित्रा एक जंगली प्रकार और उच्च विश्वस्तता संस्करण की एक अनुक्रम संरेखण से पता चलता है, साथ बिंदु उत्परिवर्तन की पहचान.. म्यूटेशनों गिना रहे हैं, क्लोन प्रति उत्परिवर्तन (तालिका 1) की संख्या के अनुसार क्रमित है, और जनसंख्या के प्रति एक औसत उत्परिवर्तन आवृत्ति के रूप में प्रतिनिधित्व, प्रति 10,000 nucleotides के अनुक्रम, चित्रा 6 .


चित्रा 1. इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए शाही सेना उत्परिवर्तजन प्रतिरोध के लिए चयन करें: एक उदारवादी (वायरस टिटर में 1-2 लॉग ड्रॉप) HELA कोशिकाओं के साथ उच्च सेल व्यवहार्यता की अवधारण ribavirin का संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया और एक MOI में जंगली प्रकार Coxsackie वायरस B3 से संक्रमित 0.01 की. 48 घंटे के बाद संक्रमण, संतान वायरस काटा था और titers 50 TCID द्वारा निर्धारित किया गया है . 48 घंटे के उपचार के जीवित कोशिकाओं का प्रतिशत Trypan नीले रंग धुंधला हो जाना द्वारा निर्धारित किया जाता है, x-अक्ष के नीचे संकेत दिया है. परिणाम बताते हैं कि 100 और 200 सुक्ष्ममापी की सांद्रता सेल व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना 1-2 लॉग वायरस titers कम.

चित्रा 2
चित्रा 2. आरएनए उत्परिवर्तजन के उदारवादी सांद्रता की उपस्थिति में सीरियल बीतने उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी आबादी के लिए चयन इस आंकड़े में, चिकनगुनिया वायरस HELA कोशिकाओं में 50 सुक्ष्ममापी ribavirin (धूसर बार) की उपस्थिति में passaged था. नियंत्रण मार्ग ribavirin का अभाव (काली सलाखों) में प्रदर्शन किया गया. प्रत्येक पारित होने के बाद, वायरस संतान BHK कोशिकाओं पर क्लासिक पट्टिका परख द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था. mutagenic प्रभाव पहली मार्ग के दौरान स्पष्ट है (p1 और p2 p0 शुरू जनसंख्या की तुलना में), जहां 2 लॉग द्वारा इलाज वायरस titers ड्रॉप. धीरे - धीरे, titers सामान्य स्तर (अनुपचारित) के लिए लौटने. कोई महत्वपूर्ण मतभेद बीतने के इलाज के लिए 5 उत्परिवर्तजन तुलना में इलाज आबादी में मनाया जाता है, सुझाव है कि प्रतिरोधी वेरिएंट चयनित किया गया है. वास्तव में, जनसंख्या का सर्वसम्मति अनुक्रमण वायरस ribavirin के उपचार के दौर से गुजर आबादी में अद्वितीय परिवर्तन की पहचान की.

चित्रा 3
चित्रा 3. व्यापक प्रतिरोध की पुष्टि करने के लिए अलग संरचना के उत्परिवर्तजन आरएनए यहाँ दिखाया गया, Coxsackie वायरस B3 के उच्च विश्वस्तता A372V संस्करण है कि शुरू में धारा 3 में वर्णित स्क्रीन में पृथक किया गया एक संक्रामक क्लोन से उत्पन्न किया गया और सांद्रता के विभिन्न रिश्तेदार संवेदनशीलता के लिए परीक्षण अलग शाही सेना उत्परिवर्तजन (ribavirin, 5 fluorouracil, 5 azacytidine). HELA कोशिकाओं ribavirin का संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया और 0.01 के MOI में जंगली प्रकार Coxsackie वायरस B3 से संक्रमित है. 48 घंटे के बाद संक्रमण, संतान वायरस काटा था और titers 50 TCID द्वारा निर्धारित किया गया है . यहाँ दिखाया गया जंगली प्रकार (ठोस लाइनों) और A372V वेरियंट उत्परिवर्तजन एकाग्रता की एक समारोह के रूप में (धराशायी लाइनों) के titers है. A372V लगातार सभी परीक्षण की शर्तों के तहत जंगली प्रकार की तुलना में उच्च titers.

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिकृति दरों और निष्ठा वेरिएंट एक कदम वायरस उत्पादन का विकास कैनेटीक्स निर्धारण करते हैं. HELA कोशिकाओं MOI = 10 पर या तो जंगली प्रकार (ठोस लाइन), उच्च विश्वस्तता वेरियंट A372V (लंबे डैश) या प्रतिकृति कमी Cx64 संस्करण (कम से संक्रमित थे ) डैश Coxsackie वायरस B3 की. समय बिंदुओं पर संकेत, वायरस संतान फ्रीज पिघलना द्वारा कोशिकाओं और supernatants से काटा गया था और 50 TCID द्वारा titered. A372V की निष्ठा वृद्धि टिशू कल्चर में एक नमूदार प्रतिकृति दोष के साथ मेल नहीं है. संस्करण Cx64 प्रतिकृति कैनेटीक्स में एक महत्वपूर्ण देरी प्रस्तुत करता है और अधिकतम titers कि 1000 गुना जंगली प्रकार के वायरस की तुलना में कम कर रहे हैं पहुँचता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. TopoTA प्रत्येक वायरस आबादी से क्लोन दृश्यों के संरेखण धारा 7, क्लोन उत्पाद RT-पीसीआर से प्राप्त प्रत्येक अनुक्रम में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग संभवतः एक एकल, वायरस की कुल आबादी के भीतर अद्वितीय जीनोम से निकलती है और इस तरह, अद्वितीय म्यूटेशनों ले जाएगा. आंकड़ा एक विशिष्ट संरेखण से पता चलता है, गरीब गुणवत्ता दृश्यों और SNPs के दृश्य की सफाई के बाद. किसी जनसंख्या के भीतर कुल SNPs (यह आंकड़ा 10) गिना रहे हैं, और प्रत्येक क्लोन पर दिखने SNPs की संख्या का उल्लेख कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, एक बार से रेखांकित क्लोन, 2 अद्वितीय म्यूटेशनों हैं जबकि 8 अन्य क्लोन एक एकल, अद्वितीय उत्परिवर्तन होते हैं. इस डेटा तालिका 1 संकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह आंकड़ा एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. वायरस आबादी के उत्परिवर्तन आवृत्तियों की आसान व्याख्या के लिए ग्राफिक प्रतिनिधित्व, संख्यात्मक अनुक्रम और सांख्यिकीय विश्लेषण से प्राप्त डेटा के या तो एक चार्ट, या हिस्टोग्राम (यहाँ दिखाया गया है) के रूप में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है. A372V वायरस जंगली प्रकार की तुलना में कम म्यूटेशनों उत्पन्न करता है और एक काफी कम उत्परिवर्तन आवृत्ति (* पी <0.01) प्रस्तुत करता है. Cx64 संस्करण, कि titers करने के लिए प्रतिकृति जंगली प्रकार, दबाव की तुलना में 1000 गुना कमएक ही उत्परिवर्तन (एनएस, महत्वपूर्ण नहीं) आवृत्ति संकेत प्रतिकृति गति और निष्ठा जरूरी नहीं जुड़े हुए हैं कि पिता. एक ही चिकनगुनिया वायरस जनसंख्या (CHIKV) वायरस शेयर कि क्या इसी तरह उत्परिवर्तन आवृत्तियों को देता है, या एक 10 5 गुना कमजोर पड़ने, शाही सेना निकासी के लिए प्रयोग किया जाता है.

उत्परिवर्तन सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सारांश वितरण.

नोट: प्रत्येक क्लोन के लिए, यह आवश्यक है कि एक ही जीनोमिक क्षेत्र (और अनुक्रम की लंबाई) कवर किया जाता है. इस मामले में, क्लोन प्रति 859 nucleotides. यह सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. दूसरी ओर, रैंक राशि सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया परीक्षण नमूना आकार एक ही किया जा करने की आवश्यकता नहीं, शोधकर्ता के लिए नमूने का आकार भिन्न की जनसंख्या की तुलना करने के लिए स्वतंत्र है. इसलिए, जंगली प्रकार के 142 क्लोन A372V 84 के क्लोन करने के लिए तुलना की जा सकती है.

N म्यूटेशनों के साथ # क्लोन जंगली प्रकार A372V
7 म्यूटेशनों 0 0
6 म्यूटेशनों 0 0
5 म्यूटेशनों 0 0
4 म्यूटेशनों 0 0
3 म्यूटेशनों 1 0
2 परिवर्तन 6 2
1 म्यूटेशनों 40 14
0 म्यूटेशनों 95 68
कुल म्यूटेशनों 55 18
कुल क्लोनों अनुक्रम 142 84
कुल nucleotides के अनुक्रम १२१९७८ 72,156
Mutations/10 4 nt 4.51 2.49

तालिका 1. उत्परिवर्तन सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए वितरण सारांश नोट: प्रत्येक क्लोन के लिए, यह आवश्यक है कि एक ही जीनोमिक क्षेत्र (और अनुक्रम की लंबाई) कवर किया जाता है . इस मामले में, क्लोन प्रति 859 nucleotides. यह सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. दूसरी ओर, रैंक राशि सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया परीक्षण नमूना आकार एक ही किया जा करने की आवश्यकता नहीं, शोधकर्ता के लिए नमूने का आकार भिन्न की जनसंख्या की तुलना करने के लिए स्वतंत्र है. इसलिए, जंगली प्रकार के 142 क्लोन A372V 84 के क्लोन करने के लिए तुलना की जा सकती है.

Discussion

सेल लाइन की च्वाइस. आरएनए उत्परिवर्तजन आधार के रूप में analogs की प्रभावकारिता उनके अलग सेल प्रकार 11 से रिश्तेदार तेज के साथ संबद्ध है. यदि सेल लाइन है कि सामान्य रूप से वायरस पारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है तेज या बहुत संवेदनशील (उच्च सेल विषाक्तता) उत्परिवर्तजन दुर्दम्य साबित होता है, यह दूसरे सेल लाइन है कि इन आवश्यकताओं को पूरा करती है और अभी भी है वायरल प्रतिकृति अनुमोदक का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. एक बार उत्परिवर्तजन प्रतिरोध संस्करण अलग है, लक्षण वर्णन के शेष मूल पसंदीदा सेल लाइन में किया जा सकता है. हमारे अनुभव में, HELA कोशिकाओं आसानी से उत्परिवर्तजन ले; BHK कोशिकाओं को 10 गुना उच्च सांद्रता और वेरो कोशिकाओं की आवश्यकता है उत्परिवर्तजन तेज करने के लिए आग रोक रहे हैं.

उत्परिवर्तजन. च्वाइस उत्परिवर्तजन उपचार, सफलता की संभावना के द्वारा सत्य के प्रति निष्ठा वेरिएंट अलग करने की कोशिश कर रहा अगर उत्परिवर्तजन के एक से अधिक प्रकार प्रयोग किया जाता है बढ़ जाती है. बेस अलग संरचना है कि ग़लती से प्रतिकृति के दौरान जीनोम में शामिल कर रहे हैं के अनुरूप उत्परिवर्तजन बाद प्रतिकृति चक्र में परिवर्तन की एक विशिष्ट सबसेट में परिणाम मुख्य रूप से प्रेरित करेगा: ribavirin उपचार GtoA और CtoU संक्रमण म्यूटेशनों 12 एहसान, 5 azacytidine एक समान पूर्वाग्रह के साथ, CtoG और GtoC transversions 13 के अलावा, 5 fluorouracil preferentially AtoG और UtoC 14 बदलाव लाती है. वैकल्पिक रूप से, 2 मिलीग्राम + या 2 करोड़ के उच्च सांद्रता + मध्यम करने के लिए पूरक किया जा सकता है 12 से ऊपर वर्णित पूर्वाग्रह के बिना आरएनए वायरस के समग्र उत्परिवर्तन आवृत्ति में वृद्धि . 'वायरस codon दृश्यों पर निर्भर करता है, और codon निष्ठा संस्करण उत्पन्न करने के लिए आवश्यक परिवर्तन, इन शर्तों के कुछ दूसरों पर इस प्रकार के उद्भव के पक्ष में होगा. उच्च विश्वस्तता पोलियोवायरस G64S और Coxsackie वायरस A372V के लिए, ribavirin उपचार सबसे आसानी से वेरिएंट के लिए चुना क्योंकि codon साइट पर आवश्यक AtoG संक्रमण मुख्य रूप से इस ribavirin के द्वारा उत्पन्न परिवर्तन करने के लिए corresponded.

MOI बनाम जनसंख्या आकार विषाणु विज्ञान, टिशू कल्चर संक्रमण के लिए प्रोटोकॉल संक्रमण की बहुलता (MOI) विशेष ध्यान देना, दोषपूर्ण हस्तक्षेप कणों (कम MOI) के संचय से बचने के लिए या वायरस के बीच पुनर्संयोजन को बढ़ावा देने के (उच्च MOI) के लिए, उदाहरण. Passaging धारावाहिक से अधिक उद्भव की घटनाओं के लिए चयन करने के लिए, यह भी वायरस जनसंख्या के आकार पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. चूंकि प्रतिरोधी उत्परिवर्ती शुरू में कम आवृत्ति पर मौजूद है, यह सबसे अच्छा है एक मार्ग से अगले (10 -10 5 6 वायरस, उदाहरण के लिए) के रूप में बड़ी आबादी के रूप में संभव आकार करने के लिए प्रत्येक पारित होने पर इन उभरते वेरिएंट खोने से बचने के हस्तांतरण. अच्छी तरह से या कुप्पी के आकार (संक्रमित कोशिकाओं की संख्या) स्केलिंग MOI में वृद्धि को कम मदद मिल सकती है अगर यह चिंता का विषय है. दूसरी ओर, प्रयोगों में जो एक वायरस के उत्परिवर्तजन के लिए संवेदनशीलता का परीक्षण किया जा रहा है के लिए, कम MOI संक्रमण क्रम में प्रतिकृति प्रयोग में होने वाली चक्र की संख्या बढ़ाने के लिए और mutagenized जीनोम के बचाव से बचने के माध्यम से उच्च फिटनेस जीनोम द्वारा किया जाता है सह - संक्रमित कोशिकाओं में complementation. यह महत्वपूर्ण है के बाद संतान जीनोम पर प्रतिकृति के पहले दौर के दौरान उत्पन्न परिवर्तन तुरंत पता नहीं होगा. इन mutagenized RNAs के अधिकांश अभी भी virion में पैक किया जाएगा. यह संक्रमण के अगले दौर में है कि घातक म्यूटेशनों इन जीनोम में मौजूद एक गर्भपात प्रतिकृति चक्र में परिणाम है, और वायरस टिटर में कमी. यह परिवर्तन के संचय के कई दौर के लिए अनुमति देने के लिए घातक mutagenesis का एक महत्वपूर्ण प्रभाव से पहले मनाया जाता है लिए आवश्यक हो सकता है. अंत में, अगर उत्परिवर्तजन की उपस्थिति में पारित होने के श्रृंखला पर, वायरस titers को लुप्त होने तक गिरावट जारी है, तो धीरे - धीरे उत्परिवर्तजन (एक बहुत कम एकाग्रता से शुरू) की मात्रा बढ़ाने में शोधकर्ता वायरस passaging की कोशिश करनी चाहिए.

अलगाव की पीढ़ी और आरएनए आबादी उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी से शाही सेना उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी क्लोन. आरएनए उत्परिवर्तजन प्रत्येक जीनोम एकाधिक यादृच्छिक म्यूटेशनों परिचय है, लेकिन प्रतिरोध के लिए चयन केवल समृद्ध (और आम सहमति अनुक्रम को हल करने के लिए ) प्रतिरोध उत्परिवर्तन. इस उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए, हम अनुक्रम उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी (जनसंख्या जनसंख्या का सर्वसम्मति) व्यक्तिगत वायरस नहीं है. इसलिए, अनुक्रम में एकल, यादृच्छिक म्यूटेशनों उत्परिवर्तजन द्वारा बनाई गई नहीं पता चला रहे हैं, केवल परिवर्तन है कि चयन निम्नलिखित सर्वसम्मति परिवर्तन में परिणाम पाए जाते हैं. हमारे अनुभव में हम केवल एक या दो ऐसे आम सहमति अनुक्रम परिवर्तन की पहचान. एक बार उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी आबादी प्राप्त है और प्रतिरोध उत्परिवर्तन की पहचान की है, यह आवश्यक है इस प्रकार की एक अधिक शुद्ध शेयर उत्पन्न है. ऊपर, हम एक पट्टिका शुद्धि की प्रक्रिया का वर्णन. वैकल्पिक रूप से, अगर ब्याज की वायरस आसानी से पहचाना सजीले टुकड़े का उत्पादन नहीं करता, वांछित संस्करण purif हो सकता हैकमजोर पड़ने सीमित द्वारा आइईडी. इस दृष्टिकोण अनिवार्य है TCID 50 96 अच्छी तरह प्रारूप, जहां वायरस शेयर पतला है कि इस तरह के कुओं की कम से कम 50% संक्रमित हैं. इस कमजोर पड़ने का प्रयोग, ऊपर के रूप में एक ही दृष्टिकोण, 10 व्यक्ति वेरिएंट के लिए अलग और उनके दृश्यों की पुष्टि में ले लिया है. के रूप में उल्लेख किया है, सबसे अच्छा मामलों में, वायरस तनाव का एक संक्रामक सीडीएनए क्लोन उपलब्ध है. संस्करण के अलगाव के इस प्रकार होना आवश्यक नहीं होता. हमारे अनुभव में, निष्ठा वेरिएंट एकल एमिनो एसिड प्रतिस्थापन के परिणाम हैं और इस तरह सरल, Quikchange (Agilent) के रूप में commercialized mutagenesis के किट का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता. एक माध्यमिक विकल्प के लिए एक निकट से संबंधित तनाव का एक सीडीएनए क्लोन का उपयोग करने के लिए है. हालांकि, अगर एक संबंधित तनाव का प्रयोग किया जाता है, हम दृढ़ता से सुझाव है कि दोनों इस दृष्टिकोण और वायरस अलगाव (जैसे पट्टिका शुद्धि) का उपयोग कर, क्योंकि हमने पाया है कि दो निकट से संबंधित वायरस पर एक ही निष्ठा फेरबदल उत्परिवर्तन जरूरी एक ही प्रभाव नहीं पड़ेगा.

फिडेलिटी और प्रतिकृति आरएनए उत्परिवर्तजन प्रतिरोधी वेरिएंट के चयन विकास विशेषताओं की है कि उनके जंगली प्रकार 4,12,15 समकक्षों के समान हैं के साथ दोनों उच्च और निम्न निष्ठा वेरिएंट के अलगाव में हुई है. वर्तमान में, पोलीमरेज़ गतिविधि दरों और निष्ठा के बीच की कड़ी को पूरी तरह समझ नहीं है. इन विट्रो में जैव रासायनिक शुद्ध आरएनए पोलीमरेज़ का उपयोग अध्ययन से पता चला है कि उच्च विश्वस्तता वेरिएंट धीमी प्रसंस्करण दर है, जबकि कम विश्वस्तता वेरिएंट तेजी 1-3,12 प्रसंस्करण करते हैं. टिशू कल्चर में इन मतभेदों को आम तौर पर स्पष्ट नहीं कर रहे हैं कि संसाधनों की उपलब्धता, बजाय आंतरिक पोलीमरेज़ गतिविधि कैनेटीक्स सुझाव, दर - कदम सीमित है. यदि निष्ठा संस्करण कैनेटीक्स उल्लेखनीय है कि जंगली प्रकार से अलग नहीं कर रहे हैं के साथ replicates, तो सीधे उनके उत्परिवर्तन आवृत्तियों की एक तुलना बनाया जा सकता है. यदि प्रतिकृति कैनेटीक्स में एक बहुत महत्वपूर्ण परिवर्तन मौजूद है, तो डेटा के लिए उदाहरण के लिए गतिज, वायरस है कि प्रतिकृति चक्र का एक ही नंबर आया है तुलना द्वारा मतभेद के लिए खाते के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. हमारे अनुभव में, हालांकि एक कदम विकास कैनेटीक्स में कोई महत्वपूर्ण मतभेद जंगली प्रकार और उच्च विश्वस्तता वेरिएंट के बीच मनाया गया, हम ने कहा कि उच्च विश्वस्तता वेरिएंट लगातार उच्च जंगली प्रकार की तुलना में (1 लॉग भीतर) टिटर लेकिन वे थोड़ा कम शाही सेना बनाने (के भीतर परिमाण के उसी क्रम), आगे सुझाव है कि जीनोम वे उत्पादन कम परिवर्तन होते हैं और इस प्रकार हैं, और अधिक संक्रामक.

नमूना तैयारी और अनुक्रमण इन प्रोटोकॉल में सभी चरणों के लिए, यह जरूरी है कि उच्च विश्वस्तता, प्रूफ रीडिंग एंजाइमों पीसीआर और RT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं करने के लिए अतिरिक्त परिवर्तन शुरू सीमा हैं क्योंकि वे biologically प्रासंगिक परिवर्तन से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. यह महत्वपूर्ण है कि वायरस की तुलना में आबादी उसी स्थिति (बीतने के इतिहास, टिशू कल्चर मध्यम, तापमान, शाही सेना निष्कर्षण विधि, RT-पीसीआर प्रोटोकॉल, आदि) में तैयार किया गया है यह भी महत्वपूर्ण है सुनिश्चित करें कि सामग्री पर्याप्त शुरू किया गया था शाही सेना जैसे निष्कर्षण कि एक मजबूत बैंड RT-पीसीआर द्वारा उत्पन्न होता है से प्राप्त की है. शाही सेना के नमूने के एक 1 / 100 मन्दन भी एक detectable बैंड RT-पीसीआर देना चाहिए, यह दर्शाता है कि नमूना शाही सेना अणु की पर्याप्त संख्या के प्रतिनिधित्व पूर्वाग्रह से बचने के (बार - बार एक ही जीनोम amplifying) शामिल हैं. के बाद से उत्परिवर्तन आवृत्ति एक वितरण है, एक उम्मीद करेंगे कि समान मूल्यों जनसंख्या के आकार की परवाह किए बिना प्राप्त हो जाएगा aforementioned पूर्वाग्रह होने वाली नहीं है प्रदान की. चित्रा 6 से पता चलता है के रूप में, एक 10 एक वायरस शेयर के कमजोर पड़ने 5 गुना है कि माता - पिता की स्टॉक से काफी अलग नहीं है एक परिवर्तन आवृत्ति देता है.

TopoTA क्लोनिंग के लिए इष्टतम स्थितियों तक पाए जाते हैं, नीले / सफेद स्क्रीनिंग के बाद अनुक्रमण पहले कॉलोनी पीसीआर द्वारा आवेषण की उपस्थिति की पुष्टि. Mutational शोर (RT-पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा शुरू परिवर्तन) के लिए एक नियंत्रण के रूप में, इन विट्रो लिखित वायरस के जीनोम को इसी शाही सेना में एक प्लाज्मिड असर ही वायरल अनुक्रम और / या क्लोन और अनुक्रम RT-पीसीआर के उत्पादों की एक पीसीआर उत्पाद क्लोन (हो बारे में पता है कि इन विट्रो प्रतिलेखन एंजाइमों में अलग अलग त्रुटि दर है और अपनी प्रक्रिया में वास्तविक पृष्ठभूमि त्रुटि के रूप में उपयोगी जानकारी नहीं दे सकता है). कुछ वायरस दृश्यों बैक्टीरिया को विषाक्त किया जा सकता है, तो यह उत्परिवर्तन आवृत्ति के लिए अनुक्रम हो वायरल जीनोम के क्षेत्र पर निर्णय लेने से पहले यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. TopoTA द्वारा प्राप्त दृश्यों के विश्लेषण में, ध्यान दें कि प्रत्येक क्लोन केवल एक डालने / अनुक्रम शामिल करना चाहिए. यदि एक डबल चोटी मनाया है, एक मिश्रित आबादी का सुझाव है, यह संभव है कि दो पड़ोसी बैक्टीरियल कालोनियों चयन किया गया था. यह भी संभव है, हालांकि अत्यधिक संभावना नहीं बैक्टीरियल प्रतिकृति में कम उत्परिवर्तन आवृत्तियों दिया, कि उत्परिवर्तन प्लाज्मिड के प्रवर्धन के दौरान जीवाणु संस्कृति में पेश किया गया था. पट्टिका पी मेंआबादी urified, एक डबल चोटी अतिव्यापी सजीले टुकड़े, या एक वायरस है कि एक नया उत्परिवर्तन प्राप्त है या पट्टिका विकास के दौरान एक उत्परिवर्तन लौटना प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. लगातार हो और पर फैसला किया जाए या इन म्यूटेशनों की गिनती करने के लिए गिनती नहीं है.

अंत में, ध्यान में रखना है कि उत्परिवर्तन यहां इस्तेमाल किया आवृत्तियों सापेक्ष मान रहे हैं. वे वायरस एक ही शर्त के तहत हो आबादी की तुलना में केवल मान्य है, और एक ही क्षेत्र से अधिक अनुक्रम रहे हैं! वे उत्परिवर्तन की दर, या एक पूरे के रूप में जीनोम के उत्परिवर्तन आवृत्ति के निरपेक्ष मान के रूप में नहीं लिया जाना चाहिए. हालांकि, जब स्थिति को नियंत्रित कर रहे हैं, वे उत्परिवर्तन वितरण और आवृत्ति में मतभेद की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मात्रात्मक तुलना अनुमति नहीं देते.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम चिकित्सा और स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान से पेरिस के सिटी, फ्रांस के राष्ट्रीय ANR-09-JCJC-+०,११८-1 अनुदान, और ईआरसी शुरू अनुदान RNAvirusPopDivNVax कोई परियोजना से धन के द्वारा समर्थित किया गया. 242719.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ribavirin Sigma-Aldrich R9644-10MG
5-fluorouracil Sigma-Aldrich F6627-1G
5-azacytidine Sigma-Aldrich A2385-100MG
MgCl2 Sigma-Aldrich M1028-100ML
MnCl2 Sigma-Aldrich M1787
Trypan blue Sigma-Aldrich T8154-20ML
TopoTA cloning kit Invitrogen 10351021
Quikchange mutagenesis kit Agilent Technologies 200516 If a cDNA infectious clone is available
96-well miniprep kit Macherey-Nagel 740625
Lasergene, Sequencher DNASTAR www.dnastar.com www.genecodes.com Or other alignment software

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References

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फिडेलिटी और वायरस वायरस उत्परिवर्तन आवृत्ति के शाही सेना के विशेषता के वेरिएंट के अलगाव
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Beaucourt, S., Bordería, A. V., Coffey, L. L., Gnädig, N. F., Sanz-Ramos, M., Beeharry, Y., Vignuzzi, M. Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency. J. Vis. Exp. (52), e2953, doi:10.3791/2953 (2011).More

Beaucourt, S., Bordería, A. V., Coffey, L. L., Gnädig, N. F., Sanz-Ramos, M., Beeharry, Y., Vignuzzi, M. Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency. J. Vis. Exp. (52), e2953, doi:10.3791/2953 (2011).

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