Summary
In dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn om te isoleren en te karakteriseren RNA polymerase trouw varianten van RNA-virussen en hoe je mutatiefrequentie gegevens gebruiken om trouw veranderingen in weefselkweek te bevestigen.
Abstract
RNA-virussen gebruik van RNA-afhankelijke RNA polymerase van hun genoom repliceren. De intrinsiek hoge foutenmarge van deze enzymen is een grote bijdrage aan het genereren van extreme diversiteit die de bevolking virus aanpassing en evolutie mogelijk maakt. Steeds meer bewijs toont aan dat de intrinsieke fout tarieven, en de daaruit voortvloeiende mutatie frequenties, van de RNA-virussen kan worden gemoduleerd door subtiele aminozuur veranderingen in het virale polymerase. Hoewel de biochemische testen bestaan voor sommige virale RNA-polymerasen die kwantitatieve meting van oprichting trouw mogelijk te maken, hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het meten mutatie frequenties van RNA-virussen die heeft bewezen te worden zo nauwkeurig als biochemische aanpak in het identificeren van trouw veranderen mutaties. De aanpak maakt gebruik van conventionele virologische en sequencing technieken die kunnen worden uitgevoerd in de meeste biologische laboratoria. Gebaseerd op onze ervaring met een aantal verschillende virussen, hebben we de belangrijkste stappen die moeten worden geoptimaliseerd om de kans op het isoleren van trouw varianten en het genereren van gegevens van statistische significantie te verhogen. De isolatie en karakterisering van trouw te veranderen mutaties kunnen nieuwe inzichten in polymerase structuur en functie 1-3. Bovendien kunnen deze trouw varianten handige tools zijn in het karakteriseren van de mechanismen van het virus aanpassing en evolutie 4-7.
Protocol
1. Bepaal het bereik van de mutagene stof concentraties die is minimaal giftig voor cellen
Het doel van deze oefening is om te bepalen welk bereik van de mutagene stof concentraties kan worden gebruikt tijdens een infectie zonder overdrijving cel toxiciteit. In wezen, wil je aan de voorwaarden die nodig zal zijn voor het virus infectie te reproduceren. Voor de meeste virussen, infecties duren tussen de 2 en 7 dagen. Bereid je genoeg platen om de meetoplossing bij elke dag. Indien niet-hechtende cellen worden gebruikt, dienovereenkomstig aan te passen het protocol.
- Op de dag voor het experiment, zaad 7 x 10 5 HeLa cellen / putje in een 6-wells plaat die het bereiken van een sub-samenvloeiend (75%) monolayer de dag van het experiment. Elk putje van de plaat zal worden behandeld met een andere concentratie van de mutagene stof, waardoor een reeks van zes concentraties.
- Op de dag van het experiment, voor te bereiden mutagen verdunningen in weefselkweek medium. Voor HeLa-cellen, gebruik dan een bereik van 0 tot 1000 pm voor base-analogen (ribavirine, 5-fluorouracil, 5-azacytidine), 0 tot 50 mm voor MgCl 2, en 0 tot 5 mm voor MnCl 2.
- Zuig het medium van de putten en te vervangen door 2 ml mutageen-aangevuld medium en terug te keren naar incubator.
- Om de 24 uur, gebruik maken van een plaat van cellen levensvatbaarheid van de cellen te controleren. Dit kan worden bereikt door het uitvoeren van trypan blauwe vlekken of met behulp van fluorescentie gecommercialiseerd / luminescentie assays (bijv. Promega's CellTiter-Glo ® Luminescent levensvatbaarheid van de cellen Assay).
- Voor trypan blauw uitsluiting kleuring, los cellen van een plaat (die werden behandeld met verschillende concentraties van de mutagene stof) en voorzichtig pellet cellen door centrifugeren.
- Gooi supernatant en resuspendeer cellen in PBS (serum kan interfereren met kleuring).
- Meng 1 deel celsuspensie in PBS met een volume van 0,4% trypan blauw, incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- In een hemacytometer, tel de levensvatbare (ongekleurd) en niet-levensvatbare (blauw gekleurde) cellen. Bereken het percentage van de levensvatbare cellen voor elke concentratie van de mutagene stof, met inbegrip van de onbehandelde controle. We vinden dat de omstandigheden die resulteren in minder dan 50% celdood door de infectie eindpunt (wanneer de maximale titers worden bereikt) zijn ideaal voor de isolatie van de mutagene stof weerstand.
2. Bepaal de optimale niet-toxische mutageen concentratie die matig vermindert virus titers (ongeveer 0.5 tot 2 log reductie)
Deze oefening dient om de concentratie van de mutagene stof die een sterke selectieve druk zal uitoefenen zonder over-mutagenizing de bevolking. Voor RNA mutagenen, vinden we dat dit overeenkomt met 10.5-2 logs vermindering van de virus titer. Bij deze concentraties, is elke genoom gemuteerd in ten minste een of twee posities. De mutagene stof kan steun in de generatie van de weerstand mutatie, die vervolgens zal worden geselecteerd op passage. Als er te veel mutaties worden geïntroduceerd (bij zeer hoge concentraties mutageen), zal de mutanten met de weerstand mutatie zelf ook dodelijk gemutageniseerd, belemmeren hun isolement.
- Seed platen met cellen met behulp van dezelfde voorwaarden als voor stap 1
- Op de dag van het experiment, voor te bereiden mutagen verdunningen in weefselkweek medium. Gebruik hetzelfde bereik van de concentraties vastgesteld zoals hierboven beschreven, maar exclusief concentraties die resulteerde in meer dan 50% celdood. Bereid je genoeg middellange tot twee maal te dekken elk putje (4 ml per putje), waardoor een voorbehandeling van cellen voor de infectie, met iedere concentratie van de mutagene stof.
- Zuig het medium en voorbehandelen cellen met mutageen door het incuberen in mutageen-aangevuld medium voor 2 uur. Voor de meeste celtypen, dit is ruim de tijd voor de opname van de mutagene stof.
- Verwijder de medium en infecteren met een virus bij een lage multipliciteit van infectie MOI (0.1 of 0.01) in een minimale volume (200 ul voor 6-well platen). Incubeer 15-60 minuten te laten virus cellen kan infecteren. Rock de plaat regelmatig om ervoor te zorgen dat het inoculum de cel monolaag dekt.
- Aspireren de geïnoculeerde virus en was tweemaal met 2 ml PBS om zo veel van het inoculum als mogelijk te verwijderen.
- Voeg medium met de juiste concentraties van de mutagene stof aan elk putje en incubeer cellen voor het equivalent van 3-6 replicatie cycli.
- Oogst virus uit elk putje en bepalen het antivirale effect op virus titer. Dit kan gedaan worden door standaard plaque assay of beperkende verdunning (TCID 50). Let op: Kwantificering van het virus door de technieken die maatregel alleen RNA synthese niet geschikt is, omdat de mutagene effecten kunnen niet worden gedetecteerd. Gemutageniseerde genomen met dodelijke mutaties kunnen nog steeds worden gedetecteerd door qRT-PCR bijvoorbeeld, maar zou niet worden waargenomen in virus levensvatbaarheid assays.
- Van de berekende titers, identificeren van de concentratie van de mutagene stof dat virus titers vermindert (in vergelijking met de onbehandelde controle infectie) door 10.5-2 logs dat is ook niet erg giftig voor cellen (idealiter minder dan 50% toxiciteit).
3. Isolatie en identificatiecatie van de mutagene stof resistente varianten
Voer grote populatie grootte van passages in de optimale mutageen concentratie hierboven omschreven en controleer virus titers over de passage serie. Als een controle, passage virus in groeimedium zonder enige mutageen. Als een ander besturingselement om het potentieel ontstaan van defecte storende deeltjes (DI) monitor, uit te voeren verse infecties in afwezigheid van de mutagene stof bij elke passage stap (unpassaged controle).
- Op de dag voor infectie, zaad 25 cm 2 flessen met 1,5 x 10 6 HeLa cellen (andere fles maten kunnen worden gebruikt) om sub-confluerende monolagen het verkrijgen van de volgende dag.
- Op de dag van de infectie, voorbehandelen cellen voor 2 uur met medium dat de optimale concentratie van elke mutagene, bepaald in hoofdstuk 2.
- Verwijder de medium en cellen infecteren met een minimaal volume bij een MOI van een of van de grootste MOI, die niet leidt tot gebrekkige storende (DI) deeltjesvorming voor het virus wordt onderzocht.
- Na 30-60 minuten van de infectie, zuigen inoculum en was twee keer met PBS, en voeg dan vers medium aangevuld met mutageen op de juiste concentraties.
- Incubeer de periode bepaald in de punten 1 en 2 die overeenkomt met een maximale virustiter in deze voorwaarden. Oogst het nageslacht virus.
- Titer virus bij elke passage en herhaal de drie voorgaande stappen.
- Tijdens de eerste paar passages, dient virus titers van de mutagene stof behandelde monsters dienovereenkomstig dalen, in vergelijking met het oorspronkelijke virus titer en de controle (onbehandeld en unpassaged) virus titers. Als virus titers van de mutagene stof gepasseerd monsters terug klim naar hetzelfde niveau als de onbehandelde controle, de bevolking bevat waarschijnlijk een mutageen resistente variant. Tot 20 of 30 passages kan worden verlangd, hoewel we geïsoleerde meeste van onze trouw varianten tussen de 5 en 15 passages.
- Zodra virus titers voor een bepaalde passage serie dezelfde orde van grootte te bereiken als de onbehandelde controle titers, uittreksel RNA van alle monsters, met inbegrip van de onbehandelde controle van dezelfde passage nummer. RNA-extractie kits of TRIzol extractie kan worden gebruikt.
- Uitvoeren van RT-PCR met behulp van primers die de polymerase of replicase genen van het virus van belang te versterken. In een tweede stap moet het hele genoom (minstens codering regio's) in volgorde worden weergegeven om te onderzoeken of weerstand fenotypes kaart om andere virus genen ook. Dit is vooral belangrijk voor de basis analoge mutagene stoffen, zoals ribavirine, die andere aspecten van het virus en de celfunctie beïnvloedt. In dit geval is de variant kan resistent zijn tegen een van die andere antivirale activiteiten en zal niet een trouw variant.
- Zuiveren de RT-PCR-producten met behulp van een PCR zuivering kit en volgorde om de mutageen-resistente populatie consensus sequentie te verkrijgen. Onder andere achtergrond controles voor sequencing fout (zie Discussie).
- Met behulp van een sequence alignment software en het virus consensus sequentie als een referentie, uitlijnen van de sequenties. Identificeer de nieuwe puntmutaties, met bijzondere aandacht voor iemand die uitsluitend in het mutageen behandelde populatie op de passage waarin virus titers te bereiken een normaal niveau. Als deze mutatie is niet aanwezig in eerdere passages en niet in onbehandelde controles uit dezelfde passage nummer (met vermelding van aanpassing aan de celcultuur passage), dan is deze mutatie is waarschijnlijk verantwoordelijk, althans ten dele, voor mutageen weerstand. Vertrouw niet op basis van zogenaamde sequence (de tekst-versie van sequentie) en alignment software alleen. Controleer de chromatogrammen voor de minderheid pieken die mogelijk zijn gemist door de uitlijning software. Een mutant die 20-30% van de totale bevolking nog steeds te zien zijn als een piek, maar te klein te worden geïdentificeerd als een 'N' door standaard sequentie-analyse.
4. Zodra een mutatie is vastgesteld, isoleren of het genereren van de variant en bevestig de weerstand fenotype aan verschillende RNA mutagene agentia
Vervolgens wordt de variant de presentatie van de geïdentificeerde mutatie geïsoleerd op de link naar de weerstand fenotype te bevestigen. Het is essentieel dat de mutatie verdacht van het veranderen van trouw wordt bestudeerd in een genetisch schone achtergrond (dat wil zeggen, niet presenteert extra mutaties elders in het genoom). In de beste situatie, een besmettelijke cDNA-kloon bestaat die het mogelijk maken het genereren van een voorraad van de mutagene-resistente variant door plaatsgerichte mutagenese op een schoon genetische achtergrond. In dit geval, deel 4 is niet nodig. Echter, als een cDNA-kloon is niet beschikbaar is, kan isolatie worden gedaan door plaque zuivering van het virus, zoals hieronder beschreven. Meer dan een ronde van plaque zuivering kan nodig zijn om de variant te isoleren op een schone, genetische achtergrond.
- Isolatie van de resistente mutant mutageen door plaque assay.
- Het isoleren van de geïdentificeerde mutant, het uitvoeren van een standaard plaque assay onder agarose (0,5 tot 1% finale gew / vol) overlay in 6-wells platen. Bereid seriële verdunningen van het virus, op basis van de voorraad titers, om dilutions dat zal produceren tussen de 10 en 50 goed gescheiden plaques.
- Bij de plaques zijn duidelijk zichtbaar (meestal 2 tot 5 dagen na infectie, afhankelijk van het virus), de locatie van de plaques op de platen merk en het gebruik van een p200 pipet met filter tip, voorzichtig dompelen de tip via de agarose overlay zorg ervoor dat u verjagen en verschuiving van de overlay-positie (dat zou leiden tot kruisbesmetting van individuele plaques).
- Til de tip uit de overlay en overdracht van de agarose plug die in de tip om een eppendorf met 250 ul medium en vortex. Maak je geen zorgen als de tip die is verwijderd, bevat geen agarose, voor vele RNA-virussen, een gemiddelde plaquette voor vele RNA-virussen bevat 10 5 virussen en een voldoende hoeveelheid zal eenvoudig worden overgebracht door het aanraken van de tip naar het oppervlak van de plaque.
- Pick-up tot 10 plaques per mutageen behandeling. Afhankelijk van de chromatogrammen van sequencing dat de genoemde mutatie, ongeveer schatten welk percentage van de bevolking bevat de gewenste mutatie. Het doel is om drie of vier plaquettes te isoleren met de mutatie. Sommige van deze mutanten zal ook extra, ongewenste mutaties, die later zullen worden geïdentificeerd door sequentiebepaling.
- Extract van de RNA van deze monsters (maar bewaar de helft van het monster aan een grotere voorraad van het virus te maken), en het uitvoeren van RT-PCR's dat de volgorde van het hele genoom mogelijk wordt. Gemiddeld zal RNA-virussen bevatten tot twee mutatie verschillen met betrekking tot de consensus sequentie, dus volgorde 3 of 4 plaque gezuiverd virussen op een tijd om het te isoleren met daarin de gewenste mutatie zonder extra mutaties te identificeren.
- Eenmaal geïdentificeerd, maken een grotere voorraad van dit virus voor alle downstream studies, met behulp van de plaque gezuiverd monster hierboven verkregen tot een grotere fles van cellen, bijvoorbeeld 8x10 6 HeLa cellen in een T75 fles infecteren ..
- Bevestig de mutageen gevoeligheid / weerstand verleend door de geïdentificeerde mutatie.
- Met behulp van de geïsoleerde of nieuw gegenereerde kloon, en een wild-type virus controle bereid onder dezelfde omstandigheden, herhaalt de experimenten in hoofdstuk 2 met behulp van een volledig assortiment van de mutagene stof concentraties, of de concentratie waarbij de weerstand mutatie werd gegenereerd.
- Gebruik verschillende RNA mutagene omstandigheden (ribavirine, 5-fluorouracil, 5-azacytidine, verhoogd Mg 2 +, Mn 2 +). Als de polymerase-variant is resistent tegen meer dan een soort van de mutagene stof, dan is de kans groter dat deze variant is high-fidelity. Als alternatief, is het mogelijk dat een weerstand mutatie is specifiek voor een enkele mutagene conditie, vooral omdat sommige van deze verbindingen invloed op RNA-virussen via een aantal mechanismen 8.
5. Controleer replicatie tarieven
Sinds trouw-veranderende mutaties meestal kaart om de polymerase, is het mogelijk dat dezelfde polymerase mutatie significant zal veranderen replicatie kinetiek en het is belangrijk om vast te stellen overeenkomsten en verschillen in replicatie, dat zal het mogelijk een betere vergelijking van de verschillen in de mutatie frequentie uitgevoerd hieronder. Om dit te doen, te onderzoeken replicatie door ten minste twee gratis benaderingen - een die virus productie en een andere die RNA synthese onderzoekt onderzoekt.
- Een stap virus groeikinetiek
- Op de dag voor het experiment, zaad 6-well platen als nodig is, een plaat per tijdstip worden getest. Overweeg het gebruik van drievoud putten voor elke mutant en het wild type virus.
- Op de dag van het experiment, verwijder het medium en infecteren putten met elk virus bij een MOI van 10 om te garanderen dat elke cel tegelijk is geïnfecteerd. Incubeer 30-60 minuten bij 37 ° C.
- Rock platen elke 10 minuten om uitdrogen te voorkomen van de cel monolaag. Verwijder het virus en was tweemaal met 2 ml PBS. Het is belangrijk om zoveel mogelijk te verwijderen van het inoculum mogelijk te maken. Vervangen met groeimedium.
- Na de infectie op tijd = 0, de oogst van het virus van een plaat. Keer terug platen incubator en de oogst van de virussen op regelmatige tijdstippen dat een replicatie-cyclus (bv. voor 3u, 5u, 7h, 9u, 12u, 24u) span.
- Titer virus, geoogst op elk tijdstip (bijv. plaque assay, TCID50, FFU test), en de grafiek de groeicurven van titer versus tijd.
- Kinetiek van RNA-synthese
De kinetiek van RNA synthese kan worden gecontroleerd met behulp van een van de benaderingen hieronder aangegeven. Indien mogelijk, moeten dezelfde monsters gebruikt om een stap groeikinetiek te bepalen worden gebruikt om de RNA-niveau te meten.- qRT-PCR. Deze procedure geeft zeer kwantitatieve metingen van replicatie over een groot bereik, van een paar exemplaren van het genoom tot> 10 10, afhankelijk van de gevoeligheid van de test. Ontwerp primers en probes die een klein fragment (<200 bp) van een sterk geconserveerd genomisch gebied te dekken. Northern blot-analyse. Hoewel minder dan de kwantitatieve qRT-PCR, deze techniek laat een visuele bevestiging dat de replicatie resulteert in een full-length genomen en dat er geen significante beëindiging van de keten ontstaat als een gevolg van de polymerase mutatie.
- Expressie van een reportergen. Als een cDNA-kloon uiten van een reporter-gen (bijv. luciferase) beschikbaar is, dan kan dit worden gebruikt als een surrogaat voor replicatie capaciteit te onderzoeken. Toch moet het recombinante virus niet worden gebruikt voor andere toepassingen (zoals bepaling van de mutatie frequentie), omdat de selectieve druk die op dit virus zal niet hetzelfde zijn, in het bijzonder omdat deze virussen de neiging hebben om de ingebrachte reporter-gen te verwijderen.
6. Meten mutatie frequenties
Dit is een cruciale stap in de bevestiging dat de geïdentificeerde polymerase mutatie weerstand verlenen aan mutageen verandert replicatie trouw. Het is belangrijk op te merken dat de mutatie frequenties hier gemeten geen mutatie tarieven. Voor het bepalen van tarieven, een zeer zorgvuldige meting van de replicatie kinetiek (hoeveelheid RNA gesynthetiseerd en de lengte van replicatie cyclus) moet worden verwerkt inch meten mutatie frequenties echter, zolang passage geschiedenis en replicatie kinetiek worden bewaakt, levert reproduceerbare, kwantitatieve maatregelen van de replicatie trouw. Mutatie frequenties kan worden bepaald in de levensvatbare virus bevolking (plaque klonen of beperkte verdunning) of in de totale bevolking virus (virus voorraad of supernatant). Om vast te stellen mutatie frequenties, bereiden virusvoorraden uit een latere passage (bijv. passage 2 of daarbuiten). Het is belangrijk dat het virus bevolking heeft de tijd om de genetische diversiteit uit te breiden dichter bij een mutatie-selectie evenwicht had.
- Mutatie frequenties van levensvatbare viruspopulatie
Deze aanpak, hoewel meer bewerkelijke, geeft informatie over het aantal mutaties aanwezig zijn op de gemiddelde genoom dat replicatie competentie behoudt. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat een voorkeur voor hogere fitness varianten zal plaatsvinden en een lagere fitness, leefbare varianten die niet gemakkelijk tandplak, bijvoorbeeld, mag niet worden gedetecteerd. Als zodanig, het maakt ook een betere maatregelen van synoniem (dS) en niet-synoniem (DN) nucleotidesubstituties dat kan worden gebruikt om te onderzoeken of de positieve selectie optreedt op de bevolking. Echter, omdat er minder mutaties zullen worden gekwantificeerd, zal een groter aantal sequenties nodig zijn voor statistische analyse. Deze techniek is gebaseerd op isolatie van de individuele virussen door een plaque zuivering of beperkende verdunning, zoals hierboven beschreven. Als uitgangspunt, raden wij aan de isolatie van 48 individuele "klonen" van in het wild type virus en het mutageen-resistente variant. Elke klonale bevolking geïsoleerd op deze manier wordt verwacht dat zij, ongeacht mutatie de oprichter genoom gepresenteerd. De hoeveelheid RNA aanwezig is in de geïsoleerde plaque of het beperken van verdunning en is over het algemeen voldoende voor de amplificatie door RT-PCR. Indien nodig kan een korte amplificatie (minder dan een replicatie-cyclus) van een minimum aantal cellen (bijv. 24 putjes plaat formaat) worden gebruikt om meer RNA te krijgen, maar minimum versterking moeten worden uitgevoerd om de accumulatie van nieuwe mutaties te voorkomen. Merk op dat elke kloon en de bevolking moeten worden vergeleken moet hetzelfde aantal van de replicatie cycli ondergaan.- Isoleer 24-48 virus klonen door plaque zuivering of beperkende verdunning.
- Uittreksel RNA uit de geïsoleerde populaties klonale
- RT-PCR versterken een fragment ter dekking van maximaal 3kb voor elk monster. Het is het beste ter dekking van de structurele eiwit regio, die de neiging heeft te tolereren meer levensvatbare mutaties dan meer geconserveerde gebieden van niet-structurele genen.
- Zuiveren de PCR-producten, volgorde en het uitvoeren van mutatie-analyse (hoofdstuk 7).
- Mutatie frequenties van totale viruspopulatie
Hoewel het een voordeel van deze tweede methode is dat zelfs een laag fitness-varianten zullen worden opgenomen in de volgorde, waardoor een breder beeld van het spectrum van mutaties. Kan het echter niet ideaal voor fylogenetische analyses die levensvatbaar virus populaties (bijv. dN / dS waarden) en identificatie van de meest relevante mutaties te nemen, omdat dodelijke veranderingen (veranderde RNA structuur, stopcodons, dramatische aminozuur veranderingen) niet geheel kunnen worden geïdentificeerd en zou worden bewaard in de analyse. Toch is deze techniek maakt de onderzoeker om de meest statistisch significante gegevens te verkrijgen van wijziging van trouw te bevestigen wanneer er sprake is van een gebrek aan een in vitro biochemische assay. Deze techniek is gebaseerd op RT-PCR-amplificatie van het totaal virion RNA, met inbegrip genomen met een lage-fitness of dodelijke mutaties die niet zal produceren plaques. De mutatie frequentie verkregen door deze methode kan worden 10-maal hoger dan bij plaque of beperkende verdunning klonen.- Uittreksel RNA van de totale bevolking virion
- RT-PCR versterkerfy een 800-1200 nucleotide regio in een deel van de genomische coderende sequentie waarvan bekend is dat mutaties tolereren en genetische variantie (bv. structurele eiwitten) hebben. Grotere fragmenten zal niet snel in te voegen in kloneringsvectoren zoals TopoTA en zal produceren onvoldoende aantallen transformanten. Hoewel de kleinere fragmenten zijn zelfs beter, kan de dekking van de genoom sequentie te weinig om statistische significantie te verkrijgen. Een fragment van ten minste 800 bp vergunningen volgorde dekking met twee primers en is een goed compromis tussen het maximaliseren van volgorde dekking en het minimaliseren van sequencing kosten. We vinden dat tussen de 70 en 100 sequenties die een 800 nucleotide regio reproduceerbaar de veranderde trouw van de varianten hebben we onderzocht in het lab bevestigt. Merk op dat andere vector / het klonen van methoden kunnen worden gebruikt met gelijke efficiëntie.
- Zuiveren de RT-PCR-product met behulp van een commerciële kit of door standaard DNA-extractie / neerslag.
- Als de RT-PCR enzymen die u gebruikt niet produceren A overhangen, het uitvoeren van een 10 minuten uitbreiding door de toevoeging van 1 uM ATP en Taq polymerase
- TopoTA kloon volgens de instructies van de fabrikant
- Voor elk virus de bevolking moeten worden bestudeerd, selecteer 96 kolonies, geïdentificeerd als een positief invoegen door blauw / wit screening op XGal gecoate platen. In eerste instantie, test op de aanwezigheid van inzetstukken voor elk verschillend genoom regio wordt gekloond, om de geldigheid van blauw / wit screening te bevestigen door plasmide grootte van screening op agarose gels of single-kolonie PCR. Met behulp van het fragment grootte en de hierboven vermelde voorwaarden, bereiken we 90% positieven
- Groeien elke kolonie in vloeibare bouillon een nacht in 1 ml LB-medium in 96 goed bacteriecultuur platen
- De volgende dag voor te bereiden minipreps in 96-well formaat.
- Volgorde elk bord met voldoende primers (de primers gebruikt voor de RT-PCR bijvoorbeeld, of TopoTA M13 primers) om een maximale dekking van de gekloonde segment te verkrijgen. Voer mutatie analyse (hoofdstuk 7).
7. Sequentie-analyse
Voer reeks analyses met behulp van een referentie of consensus sequentie voor elke populatie en geschikte onderlinge aanpassing software. Wij raden Lasergene of Sequencher die gemakkelijk kunnen SNPs te identificeren met betrekking tot de consensus.
- Lijn de sequenties met behulp van geschikte software (bijv. Lasergene of Sequencher).
- Gooi slechte kwaliteit sequenties (slechte basis te bellen, te veel 'N's of te kort in de lengte). Identificeer de nucleotide gamma dat wordt gedekt door alle sequenties. Aangezien de verschillende regio's van het genoom zal meer of minder tolereren mutaties, voor vergelijkingsdoeleinden is het essentieel dat dezelfde regio volledig is gedekt voor elke volgorde kloon behouden voor analyse. Dus, als er meerdere opeenvolging reacties worden uitgevoerd per kloon, en een reeks niet voor een bepaalde kloon, gooi de kloon (alle sequenties) uit de analyse.
- Herkennen en tellen van de SNPs die verschillen van de referentie-stam.
- Bereken de mutatie frequentie door het totaal aantal SNPs geïdentificeerd door het totale aantal nucleotiden gesequenced (aantal klonen x lengte van de regio volgorde). Presenteren van dit aantal als gemiddeld aantal mutaties per 10K nt volgorde maakt het nummer nog gebruiksvriendelijker dan het verlaten van het als per nucleotide. Bijvoorbeeld, voor het wild-type bevolking in tabel 1, 55 mutations/121, 978 in totaal nucleotiden X 10.000 = 4,51 mutaties per 10.000 nucleotiden gesequenced.
- Als dezelfde SNP verschijnt op een groot aantal klonen, het heden twee waarden die inclusief of exclusief deze herhaalde mutaties. Het algemeen, voor een virus populatie die uit een homogene ouder (door plaque zuivering of van een besmettelijke kloon) en gepasseerd slechts een paar keer in celkweek, heeft positieve selectie niet oefende de effecten genoeg zijn om de accumulatie van dezelfde SNP en de mutatie veroorzaken frequentie gemeten waarden op deze manier beter de fout frequentie van de polymerase reflecteren met minimale effecten van positieve of zuiveren van selectie.
- Bepaal de mutatie distributie. Maak een ranglijst van het aantal klonen in elke populatie dat de huidige 0, 1, 2, 3, etc. .. mutaties in de regio gesequenced.
- Bereken virale populatie diversiteit door paarsgewijze afstand vergelijking. Van de gereinigde en met de hand bewerkt sequenties bereiden een afstemming met de referentie-regio. Er zijn verschillende afstemming programma's beschikbaar: ClustalW / X ( http://www.clustal.org/ ), spier ( http://www.drive5.com/muscle/ ), EbioX voor Mac-gebruikers ( http://www. ebioinformatics.org / ebiox / ), enz. Zorg ervoor dat al uw sequenties zijn van dezelfde lengte, gewas indien nodig. Het wordt aanbevolen dat de start van de sequenties is een codering codon van posterior analyse te vergemakkelijken. Wij stellen voor het houden van alle optimalisaties in FASTA-formaat, die gemakkelijk wordt gelezen door de meeste software beschikbaar is.
- Waarden voor synoniem (dS) en niet-synoniem (DN) binnen de bevolking kan gemakkelijk worden verkregen. Vinden we de MEGA software (http://www.megasoftware.net/) handig en gebruiksvriendelijk voor dit soort analyse.
- Voor het verkrijgen van selectie richting geven we twee mogelijkheden, hoewel ze zijn niet de enigen die mogelijk te maken. 1) Vraag de verhouding tussen DN en dS. Waarden hoger dan een gemiddelde positieve selectie. Waarden lager dan 1 betekent zuiveren selectie. 2) Gebruik de Datamonkey webserver ( http://www.datamonkey.org/ ). Upload je optimalisaties in FASTA formaat en analyseren ze met de SLAC module. Dit geeft je een schatting van dN / dS.
- Uitvoeren van statistische analyses. Afhankelijk van de hoeveelheid data en het aantal sequenties, kan een verscheidenheid van tests worden gebruikt. Sommige studies hebben vertrouwd op chi kwadraat test van het totale aantal mutaties ten opzichte van het totale aantal nucleotiden consensus waar alle klonen zijn 9 gecombineerd. Andere studies hebben uitgevoerd exacte toets van Fisher, berekend op het aantal sequenties presenteren mutaties ten opzichte van het aantal sequenties zonder mutaties 10. Als er genoeg mutatie data wordt gegenereerd, raden wij aan het uitvoeren van een gerangschikt bedrag test zoals Mann Whitney U. Om dit te doen, rang van het aantal klonen in elk virus populatie van het aantal mutaties die aanwezig zijn op elke RNA-sequentie bepaald. De Mann Whitney zal dan testen voor verschillen in de mutatie verdeling van de populaties. Om deze reden, raden we sequencing ten minste 800 basenparen, om de kans op het vinden van klonen met meerdere mutaties te verhogen. Deze test is robuust, maar vereist een grotere steekproeven. Aan de andere kant is het niet dezelfde steekproefomvang voor de twee populaties worden vergeleken vereisen (bij voorbeeld, de monsters uit tabel 1 zijn n 1 = 148 en n 2 = 84).
8. Representatieve resultaten:
De dosis-afhankelijke effect van de mutagene stof concentratie op levensvatbaarheid van de cellen en virus levensvatbaarheid is weergegeven in figuur 1. In dit voorbeeld, vonden we dat virus passage in 100 uM AZC werd verminderd virustiter door de gerichte 10.5-2 log, maar HeLa levensvatbaarheid van de cellen was niet negatief beïnvloed gedurende de twee dagen die nodig zijn voor een virusinfectie. Deze pilot experiment heeft geleid tot de keuze van de 100 uM AZC concentratie voor seriële passage van het virus, te selecteren op mutageen weerstand. Figuur 2 illustreert de eerste daling van de titer, gevolgd door de opkomst van een mutageen weerstand fenotype. Tijdens de eerste paar passages in mutageen, zo dodelijk mutaties accumuleren, een significante daling van de virus titers optreedt. Geleidelijk aan, een mutageen-resistente variant ontstaat een de opkomst valt samen met een terugkeer naar virus titers niet anders dan onbehandelde controles. In dit stadium, een groot percentage van het virus bevolking presenteert de weerstand mutatie. Sequencing van dit virus populatie onthult het aminozuur wijziging (en) verantwoordelijk. Eenmaal geïdentificeerd, en geïsoleerd of nieuw gegenereerd, kan de mutagene-resistente virus minder gevoelig is dan wild-type om verschillende RNA mutagene agentia (basis analogen van andere structuur, bijvoorbeeld). Figuur 3 toont een RNA-mutageen resistent Coxsackie virus B3 dat titers hoger dan wild-type in de aanwezigheid van ribavirine, 5-fluorouracil, en 5-azacytidine en hoge MgCl 2 en MnCl 2. Een brede weerstand tegen RNA mutagene stoffen is een sterke indicator van een verhoogde replicatie trouw. Controleren of replicatie kinetiek van de trouw-variant is vergelijkbaar met wild type virus zal helpen in vergelijking van mutatie-frequenties. Figuur 4 toont het een stap-groeikinetiek van een high-fidelity variant in vergelijking met wild type. Als replicatie tarieven en de definitieve titers zijn niet gelijk, dan stappen moeten worden genomen om het virus populaties van dezelfde grootte, die zijn onderworpen aan dezelfde aantal ronden van replicatie te vergelijken. De link tussen RNA synthese snelheid en replicatie trouw is niet goed gekarakteriseerd, met name in vivo. Bij een lager percentage kan replicatie leiden tot een lagere mutatie frequentie (hogere fidelity), hoewel dit niet een absolute regel, zoals weergegeven in figuur 4. Met de bovenstaande parameters vastgesteld, kan de mutatie frequenties van de trouw variant en wild type populaties worden vergeleken met de genetische bevestiging van de veranderde replicatie trouw te verkrijgen. Figuur 5 toont een reeks uitlijning van een wild-type en high-fidelity variant, met punt mutaties geïdentificeerd. De mutaties zijn geteld, gerangschikt volgens aantal mutaties per kloon (tabel 1), en voorgesteld als een gemiddelde mutatie frequentie per bevolking, per 10.000 nucleotiden volgorde, Figuur 6.
Figuur 1. Het bepalen van de optimale omstandigheden te selecteren voor RNA-mutageen weerstand:. Behoud van een hoge levensvatbaarheid van de cel met een matige (1-2 inloggen daling van de virus titer) HeLa cellen werden behandeld met aangegeven concentraties van ribavirine en geïnfecteerd met wild type Coxsackie virus B3 bij een MOI van 0,01. 48 uur na infectie, was het nageslacht virus geoogst en titers werden bepaald door TCID 50. Het percentage van cellen overleven de behandeling op 48 uur, bepaald door trypan blauw kleuring, wordt aangegeven onder de x-as. De resultaten tonen aan dat de concentraties van 100 en 200 uM virus titers te verminderen met 1-2 log, zonder dat dit invloed levensvatbaarheid van de cellen.
Figuur 2. Seriële passage in de aanwezigheid van matige concentraties van RNA mutagenen selecteert voor mutageen resistente populaties. In deze figuur, Chikungunya-virus werd gepasseerd in HeLa cellen in de aanwezigheid van 50 uM ribavirine (grijze balken). Controle passages werden uitgevoerd in afwezigheid van ribavirine (zwarte balken). Na elke passage werd virus nageslacht gekwantificeerd door klassieke plaque assay op de BHK cellen. Het mutageen effect is duidelijk tijdens de eerste passages (P1 en P2 in vergelijking met p0 vanaf de bevolking) waarbij het behandelde virus titers langs 2 log. Geleidelijk titers terug te keren naar normale (onbehandeld) niveaus. Geen significante verschillen worden waargenomen in passage 5 mutagene stof behandeld populaties ten opzichte van onbehandeld, wat suggereert dat resistente varianten zijn geselecteerd. Inderdaad, consensus sequencing van de bevolking unieke mutaties geïdentificeerd in de virus populatie ondergaat ribavirine behandeling.
Figuur 3. Bevestiging van een brede weerstand tegen mutagene stoffen van andere structuur RNA. Hier wordt getoond, was de high fidelity A372V variant van Coxsackie virus B3 die aanvankelijk werd geïsoleerd in het scherm beschreven in hoofdstuk 3 gegenereerd op basis van een besmettelijke kloon en getest voor de relatieve gevoeligheid van verschillende concentraties van verschillende RNA mutagenen (ribavirine, 5-fluorouracil, 5-azacytidine). HeLa cellen werden behandeld met aangegeven concentraties van ribavirine en geïnfecteerd met wild type Coxsackie virus B3 bij een MOI van 0,01. 48 uur na infectie, was het nageslacht virus geoogst en titers werden bepaald door TCID 50. Hier worden de titers van de wild-type (vaste lijnen) en A372V variant (stippellijnen) als een functie van de mutagene stof concentratie. A372V titers consequent hoger dan de wild-type onder alle geteste condities.
Figuur 4. Replicatie tarieven en trouw varianten. Om de een-stap groeikinetiek van het virus de productie te bepalen, werden HeLa cellen geïnfecteerd bij MOI = 10 met een wild-type (vaste lijn), high fidelity variant A372V (lange streepjes) of replicatie deficiënt variant Cx64 (kort streepjes) van de Coxsackie virus B3. Op de tijdstippen aangegeven, virus nageslacht werd geoogst van de cellen en de supernatanten door vries-dooi en getitreerd door TCID 50. De trouw toename van A372V niet samenvalt met een waarneembare replicatie defect in weefselkweek. De variant Cx64 presenteert een significante vertraging in de replicatie kinetiek en bereikt maximale titers die 1000-voudig lager dan wild-type virus.
Figuur 5. Uitlijning van TopoTA gekloonde sequenties uit elk virus populatie. Met de aanpak zoals beschreven in hoofdstuk 7, elke sequentie verkregen uit gekloonde RT-PCR-product afkomstig is vermoedelijk uit een enkele, unieke genoom binnen de totale bevolking virus en zou dus, dragen een unieke mutaties. De figuur toont een typische uitlijning, na opruimen van slechte kwaliteit sequenties en visualisatie van SNPs. De totale SNPs (10 in deze figuur) binnen een populatie worden geteld, en het aantal SNPs die op elke kloon worden genoteerd. Bijvoorbeeld, de kloon onderstreept door een bar, bevat twee unieke mutaties terwijl acht andere klonen bevatten een enkele, unieke mutatie. Deze gegevens worden gebruikt om een tabel samen te stellen. Om een grotere versie van deze figuur kunt u hier klikken .
Figuur 6. Grafische weergave van de mutatie frequentie van het virus de bevolking. Voor gemakkelijker interpreteren, kan de numerieke gegevens van volgorde en statistische analyses worden weergegeven als een grafiek of histogram (hier afgebeeld). A372V virus genereert minder mutaties dan wild-type en geeft een significant lagere mutatie frequentie (*, p <0,01). De Cx64 variant, die gerepliceerd naar titers 1000-voudig lager dan wild-type, drukouders dezelfde mutatie frequentie (ns, niet significant) dat aangeeft dat replicatie snelheid en trouw zijn niet per definitie met elkaar verbonden. Dezelfde Chikungunya virus (CHIKV) bevolking geeft soortgelijke mutatie frequentie of het virus voorraad, of een 10 5-voudige verdunning, wordt gebruikt voor de RNA-extractie.
Mutatie distributie samenvatting voor statistische analyse.
Opmerking: Voor elke kloon, is het essentieel dat dezelfde genomische regio (en de lengte van de sequentie) is gedekt. In dit geval, 859 nucleotiden per kloon. Dit is essentieel voor statistische analyses. Aan de andere kant, rang som tests die worden gebruikt voor statistische analyse niet nodig is de steekproefomvang gelijk te zijn, de onderzoeker is vrij om de bevolking van verschillende steekproefgrootte te vergelijken. Derhalve kan de 142 klonen van wild-type worden vergeleken met de 84 klonen van A372V.
| # Klonen met n mutaties | wild-type | A372V |
| 7 mutaties | 0 | 0 |
| 6 mutaties | 0 | 0 |
| 5 mutaties | 0 | 0 |
| 4 mutaties | 0 | 0 |
| 3 mutaties | 1 | 0 |
| Twee mutaties | 6 | 2 |
| 1 mutaties | 40 | 14 |
| 0 mutaties | 95 | 68 |
| Totaal aantal mutaties | 55 | 18 |
| Totaal klonen volgorde | 142 | 84 |
| Totaal nucleotiden volgorde | 121.978 | 72.156 |
| Mutations/10 4 nt | 4.51 | 2.49 |
Tabel 1. . Mutatie distributie-samenvatting voor statistische analyses Opmerking: Voor elke kloon, is het essentieel dat dezelfde genomische regio (en de lengte van de sequentie) is gedekt. In dit geval, 859 nucleotiden per kloon. Dit is essentieel voor statistische analyses. Aan de andere kant, rang som tests die worden gebruikt voor statistische analyse niet nodig is de steekproefomvang gelijk te zijn, de onderzoeker is vrij om de bevolking van verschillende steekproefgrootte te vergelijken. Derhalve kan de 142 klonen van wild-type worden vergeleken met de 84 klonen van A372V.
Discussion
Keuze van cellijn. De werkzaamheid van de basis-analogen als RNA mutagene correleert met hun relatieve opname door verschillende celtypes 11. Als de cel lijn die normaal gesproken wordt gebruikt voor het virus passage blijkt te zijn ongevoelig voor de opname of te gevoelig is (hoge cel toxiciteit) mutageen, kan het nodig zijn naar een andere cel lijn die aan deze eisen voldoet en is nog steeds tolerant om virale replicatie gebruiken. Zodra de weerstand mutageen variant is geïsoleerd, kan de rest van de karakterisering worden uitgevoerd in de oorspronkelijke, bij voorkeur cellijn. In onze ervaring, HeLa cellen gemakkelijk nemen mutageen; BHK cellen nodig hebben tot en met 10-voudig hogere concentraties en Vero-cellen ongevoelig mutageen opname.
Keuze van de mutagene stof. In een poging om trouw varianten isoleren door mutageen behandeling, de kans op succes neemt toe als er meer dan een type van de mutagene stof wordt gebruikt. Base analoge mutagene stoffen van andere structuur, die ten onrechte zijn opgenomen in het genoom tijdens de replicatie zal vooral leiden resulteren in een specifieke subset van de mutaties in de volgende replicatie cycli: ribavirine behandeling gunsten GtoA en CtoU overgang mutaties 12, 5-azacytidine heeft een soortgelijke vooringenomenheid, met de toevoeging van CtoG en GtoC transversies 13, 5-fluorouracil bij voorkeur induceert AtoG en UTOC overgangen 14. Als alternatief, hogere concentraties van Mg 2 + of Mn 2 + kan worden aangevuld tot het medium om de totale mutatie frequentie van RNA-virussen te verhogen zonder de bias hierboven beschreven 12. Afhankelijk van codon van het virus 'sequenties, en het codon veranderingen die nodig zijn om een trouw variant te genereren, een aantal van deze voorwaarden zal de opkomst van deze variant ten opzichte van andere gunst. Voor de grotere natuurgetrouwheid poliovirus G64S en Coxsackie virus A372V, ribavirine behandeling het gemakkelijkst geselecteerd voor de varianten omdat de vereiste AtoG overgang op de codon locatie overeen met de mutaties voornamelijk gegenereerd door deze ribavirine.
MOI vs grootte van de populatie. In virologie, protocollen voor weefselkweek infectie bijzondere aandacht besteden aan de veelheid van infectie (MOI), om de accumulatie van defecte storende deeltjes (low MOI) te vermijden of om recombinatie te bevorderen tussen virussen (hoog MOI), voor voorbeeld van. Te selecteren voor de opkomst events via seriële passage, is het ook belangrijk om te overwegen virus grootte van de populatie. Omdat de resistente mutant er aanvankelijk sprake is van lage frequentie, is het best om een zo groot bevolkingsomvang mogelijke transfer van een doorgang naar de volgende (10 5 -10 6 virussen, bijv.) om te voorkomen dat deze nieuwe varianten bij elke passage. Het opschalen van de grootte van goed of kolf (aantal geïnfecteerde cellen) kan helpen om de toename van de MOI een minimum te beperken als dit van belang. Aan de andere kant, voor experimenten waarbij de gevoeligheid van een virus om mutageen wordt getest, is laag MOI infectie uitgevoerd om het aantal van replicatie cycli die zich in het experiment te vergroten en de redding van gemutageniseerd genomen te voorkomen door een hogere fitness genomen door complementatie in co-geïnfecteerde cellen. Dit is belangrijk omdat de mutaties gegenereerd op nakomelingen genomen tijdens de eerste ronde van de replicatie niet onmiddellijk worden opgespoord. De meeste van deze gemutageniseerde RNA's worden nog steeds verpakt in virion. Het is in de volgende ronde van de infectie die dodelijke mutaties aanwezig zijn in deze genomen zal resulteren in een afgebroken replicatie cyclus, en vermindering van de virus titer. Het kan nodig zijn om voor de verschillende rondes van de accumulatie van mutaties voor een significant effect van dodelijke mutagenese wordt waargenomen. Ten slotte, als over de passage-serie in de aanwezigheid van de mutagene stof, het virus titers blijven dalen tot uitsterven, dan is de onderzoeker moet proberen passage virus in steeds grotere hoeveelheden van de mutagene stof (uitgaande van een zeer lage concentratie).
Isolatie en generatie van de RNA-mutageen resistente kloon van de RNA mutageen-resistente populatie. RNA mutagene stoffen te introduceren meerdere willekeurige mutaties aan elke genoom, maar selectie op weerstand zal alleen maar verrijken (en vast tot consensus sequentie), de weerstand mutatie. Het identificeren van deze mutatie, hebben we de volgorde van de mutagene resistente populatie (consensus van de bevolking) en niet van individuele virussen. Vandaar dat de single, willekeurige mutaties die door de mutageen niet gedetecteerd in de volgorde, alleen de mutaties die resulteren in consensus veranderingen na selectie worden gevonden. In onze ervaring hebben we slechts melding gemaakt van een of twee van dergelijke consensus sequentie veranderingen. Zodra de mutageen resistente bevolking wordt verkregen en de weerstand mutatie is geïdentificeerd, is het noodzakelijk om het genereren van een meer pure voorraad van deze variant. Hierboven beschreven we een plaque zuivering procedure. Anderzijds, als het virus van belang niet gemakkelijk te identificeren plaques leidt, kunnen de gewenste variant worden PurifIED door beperkende verdunning. Deze aanpak is in wezen een TCID 50 in 96-well formaat, waar het virus voorraad is verdund zodanig dat minder dan 50% van de putten zijn besmet. Met behulp van deze verdunning is dezelfde aanpak als hierboven genomen, in het isoleren van maximaal 10 individuele varianten en bevestigen van hun sequenties. Zoals gezegd, in het beste geval, een aanstekelijke cDNA-kloon van de virusstam beschikbaar is. Isolatie van de variant zou dus niet nodig. In onze ervaring, trouw varianten zijn het resultaat van enkele aminozuursubstituties en kan dus worden gegenereerd met behulp van eenvoudige, gecommercialiseerd mutagenese kits, zoals Quikchange (Agilent). Een tweede optie is het gebruik van een cDNA-kloon van een nauw verwante stam. Echter, als een verwante stam wordt gebruikt, raden we u aan zowel deze aanpak en virusisolatie (bijv. plaque zuivering), omdat we hebben vastgesteld dat dezelfde trouw te veranderen mutatie op twee nauw verwante virussen niet noodzakelijk hetzelfde effect hebben.
Fidelity en replicatie. Selectie van RNA mutageen resistente varianten hebben geleid tot de isolatie van zowel de hogere en lagere trouw varianten met groei-eigenschappen die vergelijkbaar zijn met hun wild type tegenhangers 4,12,15. Op dit moment is de schakel tussen polymerase-activiteit tarieven en trouw niet volledig begrepen. In vitro biochemische met gebruikmaking van gezuiverd RNA-polymerase hebben aangetoond dat een hogere betrouwbaarheid varianten tragere verwerking tarieven zijn, terwijl lagere trouw varianten hebben de neiging om een snellere verwerking 1-3,12 hebben. In weefselkweek, deze verschillen zijn meestal niet evident, wat suggereert dat de beschikbaarheid van middelen, in plaats van intrinsieke polymerase activiteit kinetiek, is de snelheidsbeperkende stap. Als de trouw variant repliceert met een kinetiek die niet significant verschillend van wild-type, dan is een vergelijking van hun mutatie frequenties kunnen direct worden gemaakt. Als een zeer belangrijke verandering in de kinetiek replicatie bestaat, dan is de gegevens moeten worden genormaliseerd om rekening te houden kinetische verschillen, bijvoorbeeld door het vergelijken van virussen die zijn onderworpen aan dezelfde aantal replicatie cycli. In onze ervaring, hoewel geen significante verschillen in de een-staps groeikinetiek waargenomen tussen wild-type en de high-fidelity varianten, zagen we dat hogere betrouwbaarheid varianten consequent titer hoger (binnen een log) in vergelijking met wild-type, maar ze maken iets minder RNA (binnen dezelfde orde van grootte), verder wat suggereert dat de genomen ze produceren minder mutaties bevatten en zijn dus, meer aanstekelijk.
Monstervoorbereiding en sequencing. Voor alle stappen in deze protocollen, is het noodzakelijk dat high-fidelity, proof-reading enzymen worden gebruikt voor PCR en RT-PCR te beperken tot invoering van aanvullende mutaties, omdat zij niet kunnen worden onderscheiden van biologisch relevante mutaties. Het is van cruciaal belang dat het virus de bevolking te vergelijken zijn opgesteld in dezelfde omstandigheden (passage geschiedenis, weefselkweek medium, temperatuur, RNA-extractie methode, RT-PCR-protocollen, etc.) Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat er voldoende uitgangsmateriaal was verkregen uit de RNA-extractie zodanig dat een sterke band wordt gegenereerd door RT-PCR. A 1 / 100 verdunning van het RNA-monster moet geven ook een detecteerbaar RT-PCR band, wat aangeeft dat de steekproef voldoende van RNA-moleculen om de vertegenwoordiging partijdigheid te vermijden (het versterken van de zelfde genoom herhaaldelijk) bevat. Omdat mutatie frequentie is een distributie, zou men verwachten dat vergelijkbare waarden, ongeacht de grootte van de populatie worden verkregen, op voorwaarde dat de hiervoor genoemde vooroordeel niet plaatsvindt. Zoals figuur 6 laat zien, een 10 5-voudige verdunning van een virus voorraad geeft een mutatie frequentie die niet significant verschillend van het ouderlijk voorraad.
Tot de optimale omstandigheden voor TopoTA klonen worden gevonden, bevestigen de aanwezigheid van inserts na blauw / wit screening, door de kolonie PCR voor sequencing. Als een controle voor mutatie-ruis (mutaties geïntroduceerd door RT-PCR en sequencing), kloon een PCR-product van een plasmide met dezelfde virale sequentie en / of klonen en sequentie RT-PCR-producten van in-vitro getranscribeerde RNA die overeenkomt met virus genoom (be ervan bewust dat verschillende in vitro transcriptie enzymen hebben verschillende fouten en nuttige informatie niet te geven over de werkelijke achtergrond fout in uw procedure). Sommige virus sequenties giftig kunnen zijn voor bacteriën, dus is het belangrijk om dit te verifiëren alvorens te beslissen over de regio van virale genoom worden gesequenced voor mutatie frequentie. Bij de analyse van sequenties die zijn verkregen door TopoTA, er rekening mee dat elke kloon alleen een insert / sequentie bevatten. Als er een dubbele piek wordt waargenomen, hetgeen duidt op een gemengde bevolking, is het mogelijk dat twee naburige kolonies werden geselecteerd. Het is ook mogelijk, hoewel zeer onwaarschijnlijk, gezien de lage frequenties mutatie in bacteriële replicatie, dat de mutatie werd geïntroduceerd tijdens de versterking van het plasmide in de bacteriële cultuur. In plaque purified populaties, kan een dubbele piek vertegenwoordigen overlappende plaques, of een virus dat is het verwerven van een nieuwe mutatie of een terugkeer van een mutatie tijdens de plaque ontwikkeling. Wees consistent en beslissen over het al dan tellen of tellen niet mee deze mutaties.
Tot slot, houd er rekening mee dat de mutatie frequenties hier gebruikt zijn relatieve waarden. Ze zijn alleen geldig in het vergelijken van virus populaties gegroeid onder dezelfde voorwaarde, en gesequenced over dezelfde regio! Zij moeten niet worden beschouwd als absolute waarden van de mutatie snelheid, of de mutatie frequentie van het genoom als geheel. Echter, wanneer de omstandigheden onder controle zijn, hebben ze mogelijk reproduceerbaar, kwantitatieve vergelijkingen van de verschillen in de mutatie distributie en frequentie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de financiering van de Medical and Health Research subsidie van de stad Parijs, de Franse Nationale subsidie ANR-09-JCJC-0118-1 en de ERC Starting Grant RNAvirusPopDivNVax Project nee. 242719.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ribavirin | Sigma-Aldrich | R9644-10MG | |
| 5-fluorouracil | Sigma-Aldrich | F6627-1G | |
| 5-azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385-100MG | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | M1787 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| TopoTA cloning kit | Invitrogen | 10351021 | |
| Quikchange mutagenesis kit | Agilent Technologies | 200516 | If a cDNA infectious clone is available |
| 96-well miniprep kit | Macherey-Nagel | 740625 | |
| Lasergene, Sequencher | DNASTAR | www.dnastar.com www.genecodes.com | Or other alignment software |
References
- Arias, A. Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin. J Virol. 82, 12346-12355 (2008).
- Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase. J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).
- Korneeva, V. S., Cameron, C. E. Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket. J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).
- Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).
- Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice. PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).
- Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature. 439, 344-348 (2006).
- Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity. Nat Med. 14, 154-161 (2008).
- Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis. J Mol Med. 80, 86-95 (2002).
- Coffey, L. L., Vignuzzi, M. Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures. J Virol. 85, 1025-1035 (2011).
- Ciota, A. T. Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus. J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).
- Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance. J Virol. 83, 4538-4547 (2009).
- Levi, L. I. Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds. PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).
- Sierra, S., Dávila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity. J Virol. 74, 8316-8323 (2000).
- Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Virology. 308, 37-47 (2003).
- Sierra, M. Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe. J Virol. 81, 2012-2024 (2007).
