Summary
ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.
Abstract
היכולת לתפעל ביטוי גנים היא אבן הפינה של אמבריולוגיה מודרני יום הניסוי, מוביל להבהרת מסלולים התפתחותיים מרובים. מספר טכנולוגיות מהונדס עוצמה מבוססת היטב זמינים כדי לתפעל ביטוי גנים רמות עכבר, המאפשר לדור של אובדן ושניהם לזכות-of-פונקציה מודלים. אולם, את הדור של העכבר transgenics הוא גם יקר וגם גוזל זמן. שיטות חלופיות של מניפולציה גנטי ולכן כבר ביקשו נרחב. ברחם electroporation היא שיטה של משלוח הגן לתוך 1,2 העכבר עוברים לחיות כי יש לנו להתאים בהצלחה 3,4. היא מבוססת במידה רבה על ההצלחה של בטכנולוגיות electroporation אובו זה משמשים בדרך כלל חומוס 5. בקצרה, ה-DNA מוזרק לתוך החדרים הפתוחים של המוח המתפתח ואת היישום של זרם חשמלי גורם להיווצרות נקבוביות חולף בתוך קרום התא, דבר שמאפשר את ספיגת של דנ"א לתוך התא. בידיים שלנו, עוברים ניתן electroporated ביעילות כבר ביום עובריים (E) 11.5, בעוד המיקוד של עוברים צעירים ידרוש אולטרסאונד מונחה פרוטוקול microinjection, כפי שתואר לעיל 6. לעומת זאת, E15.5 הוא השלב האחרון אנחנו יכולים בקלות electroporate, עקב תחילת הקודקודית והבחנה העצם הפרונטלית, אשר פוגעת microinjection לתוך המוח. לעומת זאת, הרשתית נגיש עד סוף embryogenesis. עוברים ניתן לאסוף בכל נקודת זמן במהלך התקופה העוברית או אחרי לידה מוקדמת. הזרקת לבנות כתב מקלה על הזיהוי של תאים transfected.
עד כה, ב electroporation ברחם כבר בשימוש נרחב ביותר לניתוח ופיתוח neocortical 1,2,3,4. מחקרים מאוחרים יותר ממוקדים על הרשתית 7,8,9 עובריים התלמוס 10,11,12. כאן, אנו מציגים שונה בפרוטוקול electroporation ברחם כי ניתן להתאים בקלות למקד תחומים שונים של מערכת העצבים העוברית. אנו מספקים ראיות לכך על ידי שימוש בטכניקה זו, אנחנו יכולים למקד את telencephalon עובריים, diencephalon ואת הרשתית. תוצאות נציג מוצגים, הראשון מראה את השימוש בטכניקה זו כדי להציג את בונה ביטוי ה-DNA לתוך החדרים לרוחב, מה שמאפשר לנו לעקוב אחר ההבשלה אבי, בידול הגירה telencephalon העוברית. כמו כן, אנו מראים כי טכניקה זו יכולה לשמש יעד DNA לשטחים diencephalic סביב החדר 3 rd, המאפשר את נתיבי הנדידה של הבחנה נוירונים לתוך הגרעינים diencephalic להיות במעקב. לבסוף, אנו מראים כי השימוש micromanipulators מאפשר לנו להציג במדויק את ה-DNA בונה לאזורים יעד קטן, כולל שטח subretinal, ומאפשר לנו לנתח את ההשפעות של מניפולציות ביטוי גנים על התפתחות הרשתית.
Protocol
1. הקמה
- הגדרת אזור כירורגית כפי שמוצג באיור. 1 א ', א'. רכיבי מפתח של הגדרת לכלול Femtojet Eppendorf microinjector, micromanipulator Narishige עם בעל מחט, steromicroscope לייקה, מערכת סיבים אופטיים תאורה, ECM 830 Wave כיכר electroporation מערכת עם אלקטרודות, כרית חימום ו מאדה עבור הרדמה isoflurane.
- יש לנקות את כל הכלים עם שואב Ultrasonic Bransonic באמצעות Metriclean2 פתרון הקצפה נמוכה עבור sonicating כלים כירורגיים. לעקר כלים ידי מעוקר. כלי מעוקר נשמרים אז Germex.
- הכן מזרקים סטריליים עם מלח חמים סטרילי פתרון Lactated רינגר.
2. הרדמה
- מקום חיה בתוך קטן (12cm x 20 ס"מ) הרדמה קאמרית. שימוש מאדה, לספק הרדמה isoflurane 5% חמצן 1L/min (איור 1 א ', א'). יש לציין, חשוב לאסוף למצות isoflurane באמצעות מערכת הדחה.
- הסר חיה מן החדר כאשר הנשימה הופכת להיות עמוקה וסדירה. צובט הבוהן כהרף עין בדיקות רפלקס משמשים כדי להבטיח הרדמה מלאה.
- המקום העכבר בהריון על גבו על גבי כרית חימום (37 מעלות צלזיוס). כרית חימום מעוקר לראשונה על ידי מנגב עם אתנול 70%, והוא מכוסה אז עם כרית, מעוקרים גזה lintless. השתמש צינור ההנשמה ומכשירים מסכה לספק isoflurane (2.25%) במהלך הניתוח.
- הזרק עצירות (משקל הגוף 0.1mg/kg) תת עורי מתחת לעור בבית בעורף.
- צג בעל חיים ברחבי ניתוח נשימה עמוקה קבוע. חיים לא צריך התנשמות, נשום עמוק או במהירות. נשימה שטחית, מהירה עשוי להיות סימן של אור הרדמה, ואת זרימת isoflurane צריכה להיות מוגברת. אם החיה מתחילה להשתנק, להפחית את זרימת isoflurane. במקרה של דום נשימה, לכבות isoflurane, ולהגביר את זרימת החמצן עד חיה משחזרת. הפעל מחדש isoflurane בריכוז נמוך.
3. בעלי חיים כהכנה לניתוח
- Tape forelimbs של חיה לרפד את החימום לבדוק שוב בתגובה הכחשה על ידי צובט את הרגל האחורית עם מלקחיים בוטה.
- באמצעות ספוגית כותנה שקצהו סטרילי, להפיץ שכבה עבה של קרם מקריח (כלומר, Nair) על הבטן. ב שבץ המשרד, להבטיח את underfur מצופה לחלוטין. השאר על ממוצע של שלוש דקות, בודקים לסירוגין עם ספוגית נקייה סטרילית להסרת שיער. רטוב תחבושת סטרילית עם מים סטריליים ולנגב את הבטן עד שכל העקבות נעלמו. חזור עם chlorhexidine (כלומר, Stanhexidine) עור נקי יותר מים. יבש את הבטן עם גזה נקי סטרילי.
- לעקר אתר חתך עם chlorhexidine (כלומר, Stanhexidine) ואחריו מים סטריליים יותר. יבש את הבטן עם גזה נקי סטרילי. חזור על שלב זה באמצעות אתנול 70% ו ספוגית טרי, כותנה מעוקרים.
- הנח תחבושת סטרילית על הבטן עם חריץ באמצע שדרכם הקרניים הרחם ימשך במהלך הניתוח.
4. החתך חשיפה של קרני הרחם
- כדי לחשוף את קרני הרחם, תחילה לאתר את linea alba כקו חלש מתחת לעור על קו האמצע. בעזרת מלקחיים, למשוך את העור מהקיר בטן לחתוך חתך קטן, ישר מאמצע הבטן כלפי מטה במספריים העור (כ 1 ס"מ אורך).
- בעזרת מלקחיים ומספריים מעוקל, לחזור על התהליך עם הצפק.
- המקום גזה סטרילי עם חריץ אנכי קטן על החתך ו לצנן עם מלח סטרילית חימם.
- Slide מלקחיים לתוך החתך ולאתר את הרחם. החזק חתך פתוח עם מלקחיים תוך הסרת קרניים הרחם.
- בזהירות לתפוס את הרחם בין עוברים לעין הראשונה והשנייה למשוך את העוברים על גבי גזה. הסר את שני הצדדים של קרניים הרחם, הצבת על גבי גזה סטרילית לספור את מספר העוברים, וציין כל resorptions או "לא בריא" (למשל גודל גוף קטן יותר) עוברים. רטוב בקרנות הרחם עם מלח בזהירות להחזיר מחצית הרחם לתוך הבטן.
5. הזרקה של ה-DNA לתוך החדרים
- מחטים כירורגי מוכנים עם פולר Flaming micropipette סאטר באמצעות micropipettes בורוסיליקט עם נימים (תוכנית: חום = 750, משוך = 30, לוול ךיב = 90, זמן = 150). באמצעות להב אזמל סטרילי, קצה מחט הוא גילח בעדינות בזווית של 45 מעלות.
- כדי לטעון את המחט, טפטפות פסטר נמשכים עד קוטר צר תחת אש. חתיכת פה מחוברת פיפטה הטעינה להכין ~ 10 μl של ה-DNA רעלן פנימי ללא 3mg/ml מעורבב עם 0.01% מתיל ירוק (הערה: מתיל ירוק צבע מאפשר זריקות DNA להיות דמיינו). המחט מלא מותקן אז על דוכן micromanipulator ו מצורף מזרק Femtojet.
- החל העובר הקרובים השחלה, מלקחיים מעגליתמשמשים כדי להפוך בעדינות את העובר בתוך decidua כך שהוא ממוקם "עם הפנים קדימה", המאפשר זריקות להתרחש מקורי לכיוון הזנב. מקור סיבים אופטיים אור לתאורה משמש כדי לסייע לדמיין את קו האמצע של המוח העוברי, אשר מוקף החדרים לרוחב גדול באזורים מקורי (איור 1 ב ', ב').
- העובר הוא החזיק בעמדה באמצעות מלקחיים מעגלית. המחט ממוקם מעל הרחם כך את זווית הכניסה לתוך המוח הוא כ 45 מעלות. שימוש micromanipulator, לבין תנועה מהירה ויציבה, קצה המחט מוחדרת דרך דופן הרחם לתוך החדר הלטרלי של העובר. זריקות מכוונים לרוחב החדרים, החדר 3 או רווח subretinal ליעד, telencephalon diencephalon ואת הרשתית, בהתאמה. שים לב שלפוחית המוח העוברי פתוחים בשלבים עובריים מוקדם כזה DNA שהוחדר לתוך החדרים לרוחב יזרמו אל החדר 3 rd.
- לחצו על הדוושה ברגל כדי להזריק רעלן פנימי ללא ה-DNA (1-3 μL) באמצעות Femtojet Eppendorf microinjector. זריקה מוצלחת היא דמיינו בקלות באמצעות הפצת לצבוע מתיל ירוק בכל החדרים במוח העוברי. המחט ואז הסיר לאט על ידי ציור לגבות כדי למנוע שבירה.
6. Electroporation
- העובר מוזרק (עדיין בתוך הרחם) מושם על גזה סטרילי שמעל בטנה של האם ורטוב ביסודיות עם מלוחים התחמם. שים לב ** תוספת של מלח על פני השטח קרום חיוני לאפשר מעבר יעיל של זרם חשמלי.
- אלקטרודות GenePaddle משמשים אחיזה הרחם בעקבות הזריקה של ה-DNA. חמש פולסים חשמליים רבועים של 40-50V ו 50 ms מועברות בקצב של הדופק אחד לשנייה באמצעות מערכת ECM8300 BTX electroporation (איור 1C, C ").
- מכסים את העובר מוזרק / electroporated עם גזה רטוב מגן להמשיך העובר הבא.
- עם השלמת הזריקה / electroporation של כל העוברים הרצוי, בזהירות לדחוף את קרני הרחם בחזרה לתוך הבטן (1D איור).
- הסר בזהירות את קרן הרחם אחרים ולהתחיל שוב עם העובר הקרובים השחלה.
7. תפר ועל הידוק
- לאחר עוברים כל חזרה בתוך הרחם, להוסיף חלל הבטן ~ 2-3 מ"ל סליין חם.
- כדי לסגור את הפצע, להתחיל על ידי הסרת גזה על הבטן וזיהוי הצדדים של הצפק. בגין תפירת הצפק באמצעות קו משי שחור קלוע. לא מומלץ להשתמש תפר נספג עבור הליך זה כפי שהוא בדרך כלל חלש יותר ועלול להוביל דימום לאחר ניתוח וזיהומים. עוגן על קו הצפק הקרובים עצם החזה ולהמשיך לתפור ממנו העוגן. ודאו כי כל התפרים הדוקים, וכי אין איברים הבסיסית או העור כבר תפור בשוגג אל תוך הצפק. קליפ קו תפר הנותרים וזורקים.
- משוך העור נסגר מעל קו תפר עם מלקחיים. באמצעות 9 מ"מ רפלקס ™ סגירת העור סיכות, קליפ עור על הפצע, נזהרת שלא להדק את קו תפר מתחת, או למשוך את העור חזק מדי. השיטה המועדפת היא להחזיק את העור למעלה מהגוף עם מלקחיים, ולבוא בזווית של 90 מעלות עם כלי עיקרי. המשך עד הפצע סגור (כשלושה סיכות). פעם סיים, להבטיח סיכות צמודים על ידי לחיצה בעדינות יחד עם הכלי תפר (1D איור ').
8. לאחר טיפול כירורגי
- כדי לפקח על התאוששות הרדמה, להפוך נשים על בטנה להפוך isoflurane משם. שמירה על פניו של בעל חיים בתוך מנגנון הנשימה, פונים חמצן עד 3% כדי לסייע ההתאוששות מן ההרדמה. בעלי חיים יש להציב על משטח גזה נקי ויבש על גבי כרית חימום כדי למנוע היפותרמיה.
- בעוד החיה הוא מטושטש, להזריק 2 פתרון מ"ל רינגר תת עורי מתחת לעור הצוואר של החיה.
- המשך החזקת בעלי חיים תחת זרימת חמצן במשך מספר דקות ו גזה כריות חימום על מנת לעורר את החיה. בפרצים קצרים של תנועה מן החי צריך להיות כפי שנצפה הוא חוזר לאותו דפוס נשימה תקין. שימו לב כמה דקות עד חיה נראה מודע ער.
- תרסיס הבטן של הנקבה עם גנטמיצין ספריי לעטוף את החיה פד גזה סטרילי.
- מעבירים את החיה לכלוב סטרילי עם מצעים autoclaved ודיור קרטון.
- בקבוקי מים יש לנקות ביסודיות, מעוקרים ומלא מים סטריליים. עד 500 מ"ל מים להוסיף 2 מ"ל של אנטיביוטיקה sulfamethazine (25% מניות).
- ניהול 0.05 מ"ג / ק"ג עצירות תת עורי את הניתוח הבא בבוקר.
- צג הנשי מקרוב במשך 24 השעות הראשונות שלאחר הניתוח. אם בעלי החיים מוחזקים יותר מ 24 שעות, נקבות מועברים ster חדשאיל כלובים ביום 2.
9. נציג תוצאות
הניאוקורטקס
הניאוקורטקס הוא אזור של מערכת העצבים המרכזית האחראית חזותית הסנסורית עיבוד התפקוד הקוגניטיבי גבוה יותר. היא מורכבת של נוירונים הקרנת glutamatergic ו interneurons GABAergic המופקים telencephalon הגבי ו הגחון, בהתאמה. כדי להתמודד עם התפקידים של גנים שונים בהתפתחות neocortical, אנו משתמשים electroporation ברחם כדי misexpress או לחסום את הביטוי (כלומר, באמצעות בונה shRNA) של גנים שונים telencephalon הגבי או הגחון 1,3,4. כדי misexpress גנים telencephalon העוברי, אנו משתמשים וקטור ביטוי bicistronic (pCIG2), המכיל CMV-βactin האמרגן-משפר ואתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (EGFP; ב pCIG2) קלטת, ומאפשר transfected תאים כדי להתגלות על ידי epifluorescence (איור 2A-C). השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי להציג את בונה ביטוי לתוך telencephalon מן E11.5 כדי E15.5 (הנתונים המוצגים נמצאת E12.5;. איור 2). בכך שהוא מאפשר לפתח עוברים מספר ימים לאחר electroporation, אנו מסוגלים לעקוב אחר בידול והגירה של ה-GFP שכותרתו אבות. במהלך ההתמיינות, 3 ימים לאחר electroporation GFP + תאים להבדיל ולהעביר מתוך אזור חדרית (VZ), אזור subventricular (svz) לבין אזור ביניים (איז) לתוך הצלחת קליפת המוח (CP,. איור 2C). אם המוח electroporated ב E12.5 מנותחים לאחר 24 שעות, אנו יכולים לעקוב אחר המתרחש בתחילת ההתבגרות אבי והגירה העצבית על ידי תיוג משותף עם סמנים של אבות apical (כלומר, Pax6;. איור 2 א), אבות הבסיס (כלומר, Tbr2; . איור 2B) ו נוירונים neocortical postmitotic (כלומר, Tbr1;. איור 2C).
Diencephalon
ההיפותלמוס נמצא בבסיס הגחון של מערכת העצבים המרכזית ואת הפונקציות כשער בין האנדוקרינית ומערכת העצבים האוטונומית. במהלך הפיתוח, גרעינים רבים שמרכיבים את ההיפותלמוס בוגרת להבדיל מאזור אב משותף הקווים באזור הגחון ביותר של diencephalon העוברית. נכון לעכשיו, מסלולים מולקולריים המווסתים תאים ובתאים שגשוג, התמיינות נוירונים והקמת גרעינים ההיפותלמוס הם הבינו היטב. השתמשנו ב electroporation ברחם למקד גן ביטוי הכתב diencephalon העובר על ידי הזרקת DNA לתוך 3 rd החדר של E12 embryos.We אז בעקבות הפצה של ה-GFP להבדיל נוירונים ב E14. בעזרת מתודולוגיה זו, יש לנו ממוקד בהצלחה ביטוי של GFP אל התלמוס, טרום התלמוס וההיפותלמוס (איור 3A). ניתוח סעיפים העטרה מגלה כי יש לנו ביטוי ממוקד בהצלחה GFP כדי ובתאים כי קו חדרית אזור של 3 rd החדר ועל נוירונים נודדים אל אזור המעטפת כדי ליצור גרעינים (איור 3 ב)
רשתית
הרשתית היא שכבה עצבית של העין, האחראית על המרת פוטונים האור לאימפולסים חשמליים המועברים למוח. זה מתפתח outpocketing diencephalon של העובר, ולכן, נגזר הצינור העצבי. הרשתית העצבית מתפתח מתא אב apical שנמצאת בסמוך למרחב subretinal, חלל שמפריד את העין מן mesenchyme את הראש. מיקוד בונה DNA על אבות הרשתית ולכן דורש זריקות עשויים לאזור יעד קטן. שימוש micromanipulators, הצלחנו בהצלחה יעד זה אזור קטן מן העוברים E13.5 כדי E15.5 (המוצג E15.5 electroporations של pCIC עם הכתב mCherry; איור 4).. אם רשתיות electroporated נבחנים 24 שעות שלאחר transfection, אנו צופים כי מרבית התאים + mCherry נמצאים בשכבה החיצונית neuroblast (onbl), שם ממוקמים חלוקת אבות, ולא את השכבה הגנגליון ברשתית תאים (gcl; תמונה הבלעה), היכן למקם תאים postmitotic.
באיור 1. מבוא ב electroporation ברחם הגדרת ומתודולוגיה. (א) רכיבי מפתח של כירורגית הגדרת לכלול Femtojet Eppendorf microinjector (1), micromanipulator Narishige עם בעל מחט (2), steromicroscope לייקה (3), תאורת סיבים אופטיים מערכת (4), ECM 830 Wave כיכר electroporation מערכת עם אלקטרודות (5) ו - כרית חימום (6). (א ') בעל חיים הוא מורדם באמצעות הרדמה מאדה עבור isoflurane. (ב ', ב') בקיצור, אחרי הרדמה, קרניים הרחם נחשפים ו-DNA מעורבב עם ירוק מהיר מוזרק לתוך שלפוחית המוח העוברי. זריקה מוצלחת היא דמיינו על ידי מעקב של צבע ירוק מהיר (ב '). (C, C ') אחרי ה-DNA מוזרק בהצלחה, האלקטרודות ההנעה ממוקמות משני צדי הרחם, positioning את העובר, כך ה-DNA יהיה משך לכיוון הקוטב החיובי לאזור המוח של בחירה. (ד ', ד') לאחר כל עוברי הרצוי מוזרקים, הרחם הוא דחף בחזרה לתוך הבטן (ד), הצפק הוא sutured, ואת העור מהודקים (ד '). הנקבה בהריון מותר אז להתאושש את הגורים electroporated נאספים בנקודות הזמן הרצוי.
איור 2. למשל נציג electroporation telencephalic הגבי. (AC) Photomicrograph קטע העטרה דרך telencephalon E13.5 הגב electroporated ב E12.5 עם pCIG2. Electroporated GFP בתאים + מנותחים לביטוי שלהם סמנים של אבות apical (Pax6 +, אדום), אבות הבזליים (Tbr2 +, אדום, B) נוירונים postmitotic (Tbr1 +, אדום, ג). צלחת cp, קליפת המוח; svz, אזור subventricular, VZ; אזור חדרית.
איור 3. למשל נציג electroporation diencephalic. (א) להציג הגחוני של המוח E14 כי כבר electroporated ב E12 עם pCIG2. GFP epifluorescence גלוי בתלמוס, טרום התלמוס וההיפותלמוס, הוכחת את התפשטות pCIG2 microinjected פלסמיד ברחבי החדר 3 rd. (ב) Photomicrograph סעיף העטרה דרך המוח electroporated, המציג את הנדידה של ה-GFP + תאים מחוץ לאזור חדרי לתוך אזור המעטפת, שם גרעינים ההיפותלמוס יהוו. 3V, החדר השלישי; T, התלמוס; היי, ההיפותלמוס; mz, המעטפת אזור: תל, telencephalon; pret, prethalamus: VZ, אזור חדרית.
איור 4. למשל נציג electroporation הרשתית. סעיף העטרה דרך עין E16.5 electroporated עם pCIC ב E15.5 מראה את הצטברות של תאים mCherry + בשכבה החיצונית neuroblast ולא Brn3b + לתאי הגנגליון ברשתית בשכבת תא גנגליון. הבלעה היא התמונה בהגדלה גבוהה יותר של האזור בארגזים. gcl, הגנגליון ברשתית שכבת התא; le, עדשה: שכבת onbl, neuroblast החיצוני; מחדש, הרשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ברחם electroporation ניתן להשתמש כדי לנתח מגוון רחב של תהליכים התפתחותיים. לדוגמה, transfection של גנים הכתב כגון GFP, mCherry או phosphatase אלקליין ניתן להשתמש כדי לנהל מעקב אחר השושלת וניסויים נדידת נוירונים. לחלופין, Cre recombinase ניתן לבטא transiently סלקטיבי לחסל אלל floxed ב מרחבית, ו / או temporally שבשליטת בצורה. יתר על כן, shRNA או בונה שלילי דומיננטי ניתן electroporated לתפקד היעד מציאה גן. לבסוף, overexpression ממוקד או misexpression של גנים מפתח סוג שני בר ו / או קווי עכבר מוטציה גנטית יכולה לשמש ללמוד גורל החלטות התא. תפוקה גבוהה של assay זו היא קריטית שכן היא מאפשרת לבדיקות של שילובים רבים של גורמים בתוך זמן קצר מאוד. הערה אחת של זהירות היא כי הליך זה אינו גורם לשינויים ביטוי גנים בתאים המרפדים את כניסת המחט האתר (כלומר, פגיעה בתגובה גנים שהוגברו על הפצע, כפי שנצפה על ידינו ואחרים, 13). מומלץ אפוא להתמקד בתאי electroporated מחוץ לאתר הפצע. בנוסף, שיעורי הישרדות נמוכים עובריים כאשר הראשון לומדים את הטכניקה הזאת אבל מהר לעלות עד 95%> עם התרגול. עד כה השתמשנו בהצלחה בטכנולוגיות ברחם electroporation לזהות גנים מוסדר על ידי גורמי תעתוק proneural bHLH ב telencephalon 4. יש לנו תוקף גם את השימוש בטכניקה זו לניתוח cis-הרגולציה אלמנטים telencephalic 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות אווה Hadzimova, פייר Mattar וכריסטופר Kovach לעבודה הראשונית בהקמת בטכנולוגיה electroporation ברחם במעבדה CS. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) מענק (MOP 44,094) ו CIHR / קרן עיוורון לחימה (FFB) מתעוררים צוות גרנט (00933-000) ל CS החולים לילדים של אלברטה Research Foundation מענק DMK. RD נתמכה על ידי מלגה התקווה CIHR קנדה, RC נתמך על ידי מלגת הלימודים FFB ו LML נתמך על ידי מענק הדרכה CIHR בגנטיקה והתפתחות הילד.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine scissors | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Iris scissors, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Surgical Tools | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Ring forceps, 9mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Eye dressing Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Dumont #7 DMX Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont #5 DMX Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Tissue forcep-Adson | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Reflex Clip Applier | Surgical Tools | World Precision Instruments, Inc. | 500343 | |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Surgical Tools | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Autoclip Remover | Surgical Tools | Mikron | 427637 | |
| Silk Black Braided Suture | Surgical Tools | Ethicon Inc. | K871 | |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | Surgical Tools | World Precision Instruments, Inc. | 500346 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | Instruments | VWR international | 58018-004 | |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Instruments | Protech International, Inc. | CUY650P5 | |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Instruments | Protech International, Inc. | CUY650P7 | |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | Instruments | VWR international | CA62111-488 | |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | Instruments | VWR international | CAACCESS (misc.) | |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | Instruments | VWR international | CA33995-534CPN-952-118 | |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Instruments | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipettes -– Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Instruments | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Instruments | Carl Zeiss, Inc. | M-152 | |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | M1 | |
| Steel Base Plate for micromanipulator | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | 5052 | |
| Micropipette Holder | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | MPH3 | |
| Micropipette Handle | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | 5444 | |
| Stereomicroscope | Instruments | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Instruments | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Surgical Reagents | Metrex Research Corporation | 10-8100 | |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Surgical Reagents | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Germex for sterilizing surgical tools | Surgical Reagents | Vétoquinol | DIN# 00141569 | |
| BNP ophthalmic ointment | Surgical Reagents | Vétoquinol | DIN# 00516414 | |
| Nair® | Surgical Reagents | Church & Dwight Co. | commercially available | |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Surgical Reagents | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Surgical Reagents | Merck & Co. | 531-535 | |
| Sulpha "25" sulphamethazine oral antibiotic | Surgical Reagents | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | |
| Lactated Ringer Solution | Surgical Reagents | Baxter Internationl Inc. | DIN# 0061085 | |
| Saline -– 0.9% sodium chloride | Surgical Reagents | B. Braun Medical | DIN# 01924303 | |
| Inhalation Anesthetic -– Isoflurane USP | Surgical Reagents | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN# 02237518 | |
| Fast Green FCF | Surgical Reagents | Sigma-Aldrich | F7252 |
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
- Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
