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Neuroscience

एकाधिक सीएनएस का प्रयोग शासित प्रदेशों में कुशल जीन डिलीवरी Utero में Electroporation

Published: June 23, 2011 doi: 10.3791/2957

Summary

Utero electroporation में एक spatially और विकासशील केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) में अस्थायी नियंत्रित तरीके में तेजी से जीन डिलीवरी के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम utero electroporation प्रोटोकॉल है कि कई telencephalon diencephalon, और रेटिना सहित भ्रूण सीएनएस डोमेन, में अभिव्यक्ति constructs देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एक उच्च अनुकूलनीय वर्णन.

Protocol

1. स्थापित

  1. सेट अप शल्य चिकित्सा क्षेत्र के रूप में छवि में दिखाया गया है. 1 ए, ए '. सेट अप के मुख्य घटक एक Eppendorf Femtojet microinjector, सुई धारक, Leica steromicroscope, फाइबर ऑप्टिक प्रकाश व्यवस्था, ECM 830 इलेक्ट्रोड के साथ स्क्वायर वेव electroporation सिस्टम, हीटिंग पैड और isoflurane चतनाशून्य करनेवाली औषधि के लिए एक vaporizer के साथ Narishige micromanipulator शामिल हैं.
  2. एक Bransonic अल्ट्रासोनिक शल्य चिकित्सा उपकरण sonicating के लिए Metriclean2 कम foaming समाधान का उपयोग क्लीनर के साथ सभी उपकरणों को साफ. Autoclaving द्वारा उपकरण जीवाणुरहित. निष्फल उपकरण तो Germex में रखा जाता है.
  3. गर्म बाँझ खारा और बाँझ lactated घंटी के समाधान के साथ सीरिंज तैयार करें.

2. बेहोशी

  1. एक छोटी सी (12cm x 20cm) संवेदनाहारी कक्ष के अंदर प्लेस जानवर. एक vaporizer का प्रयोग, 1L/min (छवि 1 ए, ए ') में 5% isoflurane संवेदनाहारी और ऑक्सीजन देने. विशेष रूप से, यह महत्वपूर्ण है isoflurane निकास एक सफाई प्रणाली का उपयोग कर इकट्ठा.
  2. चैम्बर जब श्वास गहरी हो जाता है और नियमित रूप से पशु निकालें. पैर की अंगुली बन्द रखो और आँख झपकी पलटा परीक्षण करने के लिए पूर्ण संज्ञाहरण सुनिश्चित किया जाता है.
  3. अपनी पीठ पर एक हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) के शीर्ष पर गर्भवती माउस रखें. हीटिंग पैड पहले 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा निष्फल है, और है तो एक निष्फल, lintless धुंध पैड के साथ शामिल है. एक श्वासयंत्र ट्यूब और मुखौटा isoflurane सर्जरी के दौरान (2.25%) देने तंत्र का उपयोग करें.
  4. गर्दन के डब में त्वचा के नीचे (0.1mg/kg शरीर के वजन) subcutaneously buprenorphine इंजेक्षन.
  5. गहरी और नियमित रूप से साँस लेने के लिए सर्जरी के दौरान पशु मॉनिटर. पशु दम तोड़ देना, नहीं shallowly या तेजी से साँस लेने चाहिए. उथला, तेजी से साँस लेने में प्रकाश संज्ञाहरण का एक संकेत हो सकता है, और isoflurane के प्रवाह में वृद्धि की जानी चाहिए. यदि पशु हांफी करने के लिए शुरू होता है, isoflurane के प्रवाह को कम. एक सांस की गिरफ्तारी के मामले में, isoflurane बंद की बारी है, और ऑक्सीजन का प्रवाह बढ़ाने के जब तक कि जानवर ठीक. एक कम एकाग्रता में isoflurane पुनरारंभ करें.

3. सर्जरी के लिए तैयार पशु

  1. टेप जानवर के हीटिंग पैड forelimbs और एक तर्क प्रतिक्रिया के लिए फिर से कुंद संदंश के साथ हिंद पैर pinching द्वारा जाँच.
  2. एक बाँझ कपास इत्तला दे दी झाड़ू का प्रयोग, पेट पर लोमनाशक क्रीम (यानी, नायर) की एक मोटी परत फैल गया. फर्म स्ट्रोक में, यह सुनिश्चित underfur पूरी तरह से लेपित है. तीन मिनट की एक औसत के लिए छोड़ दो, बालों को हटाने के लिए एक बाँझ साफ झाड़ू के साथ रहकर जाँच. बाँझ पानी के साथ एक बाँझ धुंध पैड गीले और पेट पोंछ जब तक सभी निशान को चला रहे हैं. Chlorhexidine (यानी, Stanhexidine) त्वचा क्लीनर और अधिक पानी के साथ दोहराएँ. पेट साफ, बाँझ धुंध के साथ सूखी.
  3. (यानी, Stanhexidine) chlorhexidine अधिक बाँझ पानी से पीछा के साथ चीरा साइट जीवाणुरहित. पेट साफ, बाँझ धुंध के साथ सूखी. यह 70% इथेनॉल और एक ताजा, निष्फल कपास झाड़ू का उपयोग कर कदम दोहराएँ.
  4. बीच में एक छेद है, जिसके माध्यम से सर्जरी के दौरान गर्भाशय सींग खींच लिया जाएगा के साथ पेट पर एक बाँझ धुंध पैड रखें.

4. चीरा और गर्भाशय हार्न्स के एक्सपोजर

  1. गर्भाशय सींग को बेनकाब करने के लिए, पहले midline पर त्वचा के नीचे बेहोश लाइन के रूप में linea अल्बा का पता लगाने. संदंश का प्रयोग, त्वचा और पेट की दीवार से दूर खींचने के लिए और त्वचा कैंची (लंबाई में लगभग 1 सेमी) के साथ मध्य पेट नीचे से एक छोटा सा, सीधे चीरा कटौती.
  2. घुमावदार संदंश और कैंची का प्रयोग, peritoneum के साथ इस प्रक्रिया को दोहराने.
  3. चीरा पर एक छोटे से खड़ी भट्ठा के साथ बाँझ धुंध प्लेस और गरम बाँझ खारा के साथ गीला हो जाना.
  4. चीरा में संदंश स्लाइड और गर्भाशय का पता लगाने. जबकि गर्भाशय सींग हटाने संदंश के साथ खुला चीरा पकड़ो.
  5. ध्यान से पहले और दूसरे दिखाई भ्रूण के बीच गर्भाशय समझ और धुंध पर भ्रूण खींच. गर्भाशय सींग का दोनों पक्षों निकालें, बाँझ धुंध पर रखने और भ्रूण की संख्या गिनती, किसी भी resorptions या "अस्वस्थ" भ्रूण (जैसे छोटे शरीर के आकार) टिप्पण. नमक के साथ गर्भाशय सींग गीले और ध्यान से पेट में गर्भाशय के आधे से लौटने.

5. डीएनए के ventricles में इंजेक्शन

  1. सर्जिकल सुइयों Sutter ज्वलंत micropipette capillaries के साथ borosilicate micropipettes का उपयोग खींचने के साथ तैयार कर रहे हैं (कार्यक्रम: गर्मी = 750, = 30 खींचो, वेळ = 90, समय = 150). एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, सुई टिप धीरे से एक 45 डिग्री के कोण पर बंद मुंडा.
  2. सुई को लोड करने के लिए, पाश्चर pipettes एक लौ के तहत एक संकीर्ण व्यास को खींच रहे हैं. एक मुँह टुकड़ा लोड हो रहा है विंदुक से जुड़ा हुआ है ~ 10 μl 3mg/ml डीएनए endotoxin मुक्त के 0.01% मिथाइल हरे रंग के साथ मिश्रित (ध्यान दें: मिथाइल हरे रंग डीएनए इंजेक्शन visualized किया जा करने की अनुमति देता है) आकर्षित. भरा सुई तो एक micromanipulator स्टैंड पर मुहिम शुरू की है और Femtojet सुई लगानेवाला से जुड़ी है.
  3. अंडाशय के लिए निकटतम भ्रूण के साथ शुरू, परिपत्र संदंशधीरे decidua भीतर भ्रूण बारी इतना है कि यह तैनात है "चेहरे के आगे", इंजेक्शन दुम दिशा में एक व्याख्यान चबूतरे वाला में घटित करने के लिए अनुमति के लिए उपयोग किया जाता है. रोशनी के लिए एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत भ्रूण मस्तिष्क, जो व्याख्यान चबूतरे वाला क्षेत्रों में बड़े पार्श्व ventricles (छवि 1B, बी ') द्वारा flanked है midline कल्पना में मदद करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  4. भ्रूण परिपत्र संदंश का उपयोग स्थिति में आयोजित किया जाता है. सुई गर्भाशय ऊपर तैनात है इतना है कि मस्तिष्क में प्रवेश के कोण लगभग 45 डिग्री है. Micromanipulator, और एक त्वरित और स्थिर गति का प्रयोग, सुई टिप गर्भाशय की दीवार के माध्यम से और भ्रूण के पार्श्व वेंट्रिकल में डाला जाता है. इंजेक्शन पार्श्व ventricles, 3 वेंट्रिकल या subretinal अंतरिक्ष telencephalon diencephalon, और रेटिना, क्रमशः लक्ष्य की ओर निर्देशित कर रहे हैं. ध्यान दें कि भ्रूण मस्तिष्क vesicles ऐसी है कि पार्श्व ventricles में इंजेक्शन डीएनए 3 Rd वेंट्रिकल में बहेगा जल्दी भ्रूण चरणों में खुले हैं.
  5. पैर पेडल प्रेस endotoxin मुक्त (1-3 μL) डीएनए का उपयोग कर एक Eppendorf Femtojet microinjector इंजेक्षन. एक सफल इंजेक्शन भ्रूण मस्तिष्क ventricles भर मिथाइल हरे रंग के प्रसार के द्वारा आसानी से कल्पना की है. सुई फिर धीरे धीरे वापस ऊपर ड्राइंग टूटना से बचने के द्वारा हटा दिया है.

6. Electroporation

  1. इंजेक्शन भ्रूण गर्भाशय के भीतर (अभी भी) बाँझ धुंध overlying माँ के पेट और गरम नमक के साथ अच्छी तरह से गीला पर रखा गया है. कृपया ध्यान दें ** खारा की झिल्ली सतह के अलावा एक बिजली के वर्तमान के कुशल मार्ग की अनुमति आवश्यक है.
  2. GenePaddle इलेक्ट्रोड के लिए डीएनए के इंजेक्शन के बाद गर्भाशय पकड़ के लिए उपयोग किया जाता है. 40-50V और 50 एमएस के पांच वर्ग बिजली दालों प्रति सेकंड एक ECM8300 BTX electroporation प्रणाली (छवि 1C, सी ') का उपयोग कर एक नाड़ी की दर पर दिया जाता है.
  3. सुरक्षात्मक गीला धुंध के साथ कवर इंजेक्शन / electroporated भ्रूण और अगले भ्रूण करने के लिए जारी रखने के.
  4. सभी वांछित भ्रूण के इंजेक्शन / electroporation की समाप्ति पर, ध्यान से गर्भाशय सींग पेट (छवि 1D) में वापस धक्का.
  5. सावधानी अन्य गर्भाशय सींग हटाने और अंडाशय के लिए निकटतम भ्रूण के साथ फिर से शुरू.

7. सिवनी और Stapling

  1. एक बार सभी भ्रूण वापस गर्भाशय के अंदर, उदर गुहा ~ 2-3 मिलीलीटर गर्म खारा को जोड़ने.
  2. घाव बंद करने के लिए, पेट पर धुंध हटाने और peritoneum के पक्ष की पहचान के द्वारा शुरू करते हैं. पेरिटोनियम suturing काला लट रेशम लाइन का उपयोग शुरू करो. यह इस प्रक्रिया के लिए absorbable सीवन का उपयोग के रूप में यह आमतौर पर कमजोर और शल्य चिकित्सा के बाद खून बह रहा है और संक्रमण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं सिफारिश नहीं है. उरोस्थि को निकटतम peritoneum पर लाइन एंकर और दूर लंगर से सिलाई करने के लिए आगे बढ़ना. सभी sutures के तंग कर रहे हैं, और कोई अंतर्निहित अंगों या त्वचा अनजाने peritoneum में सिलना किया गया है कि सुनिश्चित करें. शेष सीवन लाइन क्लिप और त्यागें.
  3. खींचो त्वचा संदंश के साथ सीवन लाइन पर बंद हुआ. 9 पलटा मिमी ™ त्वचा बंद स्टेपल का प्रयोग, घाव पर त्वचा क्लिप, देखभाल सीवन लाइन के नीचे प्रधान के लिए नहीं ले जा, या त्वचा भी कसकर खींच. पसंदीदा विधि के लिए त्वचा पकड़ ऊपर और संदंश के साथ शरीर से दूर है, और प्रधान उपकरण के साथ एक 90 डिग्री के कोण पर में आ रहा है. जारी रखें जब तक घाव बंद है (लगभग तीन स्टेपल). एकबार समाप्त सुनिश्चित करने के लिए, स्टेपल धीरे सीवन उपकरण (छवि 1D) के साथ एक साथ दबाने से तंग हैं.

8. शल्य चिकित्सा के बाद केयर

  1. संवेदनाहारी वसूली की निगरानी, ​​उसके पेट पर महिला की बारी है और बंद isoflurane बारी. श्वास तंत्र के अंदर है जानवर के चेहरे को ध्यान में रखते हुए, ऑक्सीजन बारी संज्ञाहरण से वसूली में मदद करने के लिए 3%. पशु हीटिंग हाइपोथर्मिया को रोकने के पैड के शीर्ष पर एक साफ सूखी धुंध पैड पर रखा जाना चाहिए.
  2. जबकि पशु शराबी है, 2 एमएल घंटी समाधान subcutaneously इंजेक्षन जानवर की गर्दन की त्वचा के नीचे.
  3. ऑक्सीजन का प्रवाह के तहत कई मिनट और वार्मिंग धुंध पैड के लिए पशु जगाना जानवर को पकड़े हुए क्रम में जारी रखें. जानवर से आंदोलन के लघु spurts के रूप में यह एक सामान्य श्वास पैटर्न रिटर्न मनाया जाना चाहिए. कई मिनट के लिए निरीक्षण जब तक सचेत और जागते जानवर लगता है.
  4. Gentamicin स्प्रे के साथ महिला के पेट स्प्रे और एक बाँझ धुंध पैड में पशु लपेटो.
  5. Autoclaved बिस्तर और गत्ता आवास के साथ एक बाँझ पिंजरे में जानवर स्थानांतरण.
  6. पानी की बोतलें पूरी तरह साफ होना चाहिए निष्फल और बाँझ पानी से भरा है. पानी की 500 के लिए एमएल sulfamethazine एंटीबायोटिक (25% शेयर) की 2 एमएल जोड़ने.
  7. 0.05 मिलीग्राम / किग्रा buprenorphine subcutaneously सुबह सर्जरी के बाद प्रशासन.
  8. पहले 24 घंटे के बाद सर्जरी के लिए बारीकी से महिला मॉनिटर. अगर पशुओं की तुलना में अब 24 घंटे रखा जाता है, महिलाओं को नए ster करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं2 दिन इले पिंजरों.

9. प्रतिनिधि परिणाम

Neocortex

neocortex सीएनएस है कि दृश्य और ज्ञानेन्द्रिय प्रसंस्करण और उच्च संज्ञानात्मक कार्य के लिए जिम्मेदार है के क्षेत्र है. यह glutamatergic प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और GABAergic interneurons कि पृष्ठीय और उदर telencephalon से प्राप्त कर रहे हैं, क्रमशः शामिल है. Neocortical विकास में विभिन्न जीनों की भूमिका का पता करने के लिए, हम या तो misexpress utero electroporation में उपयोग या पृष्ठीय या ventral telencephalon 1,3,4 में विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति (यानी, shRNA constructs के प्रयोग के माध्यम से) ब्लॉक. भ्रूण telencephalon में जीन misexpress करने के लिए, हम एक bicistronic अभिव्यक्ति वेक्टर (pCIG2) का उपयोग, सीएमवी - βactin प्रमोटर - बढ़ाने और एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट IRES () बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त (EGFP pCIG2 में) कैसेट, ट्रांसफ़ेक्ट की अनुमति कोशिकाओं epifluorescence (छवि 2A सी) द्वारा पता लगाया जा करने के लिए. हम इस तकनीक का इस्तेमाल telencephalon में अभिव्यक्ति constructs E11.5 से E15.5 (दिखाया डेटा E12.5 है; चित्र 2) परिचय. भ्रूण कई दिनों के बाद electroporation विकसित करने के लिए अनुमति देता है, हम भेदभाव और GFP लेबल progenitors के प्रवास को ट्रैक करने में सक्षम हैं. भेदभाव आय के रूप में, 3 दिन के बाद electroporation GFP + कोशिकाओं को अलग और निलय (VZ) क्षेत्र, subventricular क्षेत्र (svz) और मध्यवर्ती क्षेत्र (iz) के बाहर और cortical प्लेट (cp, अंजीर 2C) में विस्थापित. बेसल progenitors (यानी, Tbr2, यदि E12.5 दिमाग पर electroporated 24 घंटे के बाद का विश्लेषण कर रहे हैं, हम सह शिखर progenitors के मार्कर के साथ लेबलिंग (. अंजीर 2A यानी, Pax6) द्वारा पूर्वज परिपक्वता और neuronal प्रवास में पहले की घटनाओं की निगरानी कर सकते हैं; . अंजीर) 2B और postmitotic neocortical न्यूरॉन्स (यानी, Tbr1;. अंजीर 2C).

Diencephalon

hypothalamus और CNS कार्यों के endocrine और autonomic तंत्रिका प्रणाली के बीच एक प्रवेश द्वार के रूप में उदर आधार पर झूठ. विकास के दौरान, कई नाभिक है कि परिपक्व hypothalamus एक आम पूर्वज क्षेत्र से अलग है कि उदर सबसे भ्रूण diencephalon के क्षेत्र लाइनों. वर्तमान में, आणविक मार्ग है कि पूर्वपुस्र्ष सेल प्रसार, neuronal भेदभाव और hypothalamic नाभिक गठन को विनियमित खराब समझ रहे हैं. हम utero E12 embryos.We के 3 Rd निलय में डीएनए इंजेक्शन लगाने के द्वारा भ्रूण diencephalon रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति लक्ष्य electroporation में इस्तेमाल किया तो E14 में न्यूरॉन्स फर्क में GFP का वितरण पीछा किया. इस पद्धति के साथ, हम सफलतापूर्वक thalamus, पूर्व thalamus और hypothalamus (छवि 3A) GFP अभिव्यक्ति लक्षित. राज्याभिषेक वर्गों के विश्लेषण से पता चलता है कि हम सफलतापूर्वक पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को लक्षित GFP अभिव्यक्ति है कि लाइन 3 Rd निलय और न्यूरॉन्स के निलय क्षेत्र (3B छवि) पोशिश क्षेत्र में बाहर विस्थापित करने के लिए नाभिक फार्म

रेटिना

आंख की रेटिना तंत्रिका परत, बिजली के मस्तिष्क को प्रेषित आवेगों में प्रकाश photons को बदलने के लिए जिम्मेदार है. यह एक भ्रूण diencephalon के outpocketing के रूप में विकसित, और इसलिए, न्यूरल ट्यूब से निकाली गई है. तंत्रिका रेटिना एक शिखर पूर्वज कम्पार्टमेंट है कि subretinal अंतरिक्ष, एक गुहा है कि सिर mesenchyme से आँख अलग करने के लिए आसन्न झूठ से विकसित करता है. रेटिना progenitors डीएनए constructs का लक्ष्य निर्धारण इसलिए आवश्यक है कि इंजेक्शन के एक छोटे से लक्ष्य क्षेत्र में बना रहे हैं. Micromanipulators का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक भ्रूण में E13.5 से E15.5 करने के लिए इस छोटे से क्षेत्र (; चित्र 4. दिखाया mCherry संवाददाता के साथ E15.5 pCIC electroporations है) लक्ष्य में कामयाब रहे हैं. यदि electroporated retinae 24 घंटा बाद अभिकर्मक जांच कर रहे हैं, हम पालन कि सबसे mCherry + कोशिकाओं बाहरी परत neuroblast (onbl), जहां विभाजित progenitors स्थित हैं और रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत में नहीं (GCL, इनसेट छवि) में स्थित हैं , जहां postmitotic कोशिकाओं स्थानीयकरण.

चित्रा 1
चित्रा 1. Utero electroporation सेट अप और पद्धति में परिचय (ए) सेट अप शल्य चिकित्सा के प्रमुख घटक एक Eppendorf Femtojet microinjector (1), सुई धारक (2) के साथ Narishige micromanipulator, Leica steromicroscope (3), फाइबर ऑप्टिक रोशनी में शामिल हैं (4) प्रणाली, इलेक्ट्रोड (5) और हीटिंग पैड (6) के साथ ECM 830 स्क्वायर वेव electroporation सिस्टम. (ए ') पशु anesthetized है isoflurane चतनाशून्य करनेवाली औषधि के लिए एक vaporizer का उपयोग. (बी, बी ') संक्षेप में, संज्ञाहरण के बाद, गर्भाशय सींग उजागर कर रहे हैं और तेजी से हरे रंग के साथ मिश्रित डीएनए भ्रूण मस्तिष्क vesicles में अंतःक्षिप्त है. एक सफल इंजेक्शन तेजी से हरे रंग (बी) के ट्रैकिंग द्वारा कल्पना की है. (सी, सी ') के बाद डीएनए सफलतापूर्वक अंतःक्षिप्त है, चप्पू इलेक्ट्रोड गर्भाशय की स्थिति के दोनों ओर पर रखा जाता हैभ्रूण oning इतना है कि डीएनए पसंद के मस्तिष्क क्षेत्र में सकारात्मक ध्रुव की ओर खींच लिया जाएगा. (डी, डी ') सभी वांछित भ्रूण इंजेक्ट कर रहे हैं एक बार, गर्भाशय पेट (डी) में वापस धकेल दिया है, peritoneum sutured है, और त्वचा (D stapled है'). गर्भवती महिला तब ठीक करने के लिए अनुमति दी गई है और electroporated पिल्ले वांछित समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक E13.5 पृष्ठीय pCIG2 साथ E12.5 पर electroporated telencephalon के माध्यम से राज्याभिषेक अनुभाग के पृष्ठीय telencephalic electroporation की प्रतिनिधि उदाहरण (एसी). photomicrograph. Electroporated GFP + कोशिकाओं शिखर progenitors की मार्करों के अपने अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं (Pax6 +, लाल, ए), बेसल progenitors (Tbr2 +, लाल, बी) और postmitotic न्यूरॉन्स (Tbr1 +, लाल, सी). cp, cortical थाली, svz, subventricular क्षेत्र, VZ, निलय क्षेत्र.

चित्रा 3
चित्रा 3. Diencephalic electroporation के प्रतिनिधि उदाहरण (ए) एक E14 है कि pCIG2 के साथ किया गया है E12 पर electroporated मस्तिष्क के एक उदर दृश्य . GFP epifluorescence thalamus में दिखाई देता है, पूर्व thalamus और hypothalamus, 3 Rd निलय भर microinjected pCIG2 के प्रसार प्लाज्मिड प्रदर्शन. (बी) electroporated मस्तिष्क के माध्यम से राज्याभिषेक अनुभाग के photomicrograph GFP के प्रवास को दर्शाता है + कोशिकाओं निलय और पोशिश क्षेत्र है, जहां hypothalamic नाभिक फार्म जाएगा में क्षेत्र के बाहर. 3V, तीसरे वेंट्रिकल, टी, thalamus, हरियाणा, hypothalamus, mz, पोशिश क्षेत्र, टेलीफोन, telencephalon; Prêt, prethalamus, VZ, निलय क्षेत्र.

चित्रा 4
चित्रा 4. रेटिना electroporation की प्रतिनिधि उदाहरण E15.5 पर एक E16.5 pCIC साथ electroporated आँख बाहरी neuroblast परत में mCherry + कोशिकाओं के संचय दिखाने के माध्यम से कोरोनल अनुभाग और Brn3b + नहीं नाड़ीग्रन्थि सेल परत में रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं. इनसेट बॉक्स्ड क्षेत्र के उच्च बढ़ाई छवि है. GCL, रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परत, ले, लेंस, onbl, बाहरी neuroblast परत, फिर, रेटिना.

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Discussion

Utero में electroporation विकास प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, रिपोर्टर जीन का GFP, mCherry या alkaline फॉस्फेट के रूप में अभिकर्मक वंश अनुरेखण और neuronal प्रवास प्रयोगों का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, Cre recombinase transiently चुनिंदा एक spatially और / या अस्थायी नियंत्रित तरीके में एक floxed एलील को खत्म करने व्यक्त किया जा सकता. इसके अलावा, shRNA या पछाड़ना लक्ष्य जीन समारोह के लिए प्रमुख नकारात्मक constructs electroporated किया जा सकता है है. अंत में, लक्षित या दोनों जंगली प्रकार और / या आनुवंशिक उत्परिवर्ती माउस लाइनों में महत्वपूर्ण जीनों के misexpression overexpression सेल भाग्य का निर्णय का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख के उच्च throughput महत्वपूर्ण है क्योंकि यह कारकों के कई संयोजनों की एक बहुत ही कम समय में परीक्षण के लिए अनुमति देता है. सतर्कता का एक नोट है कि इस प्रक्रिया कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति में कारण परिवर्तन करता है कि लाइन सुई प्रविष्टि साइट (यानी, चोट प्रतिक्रिया घाव में upregulated जीन, के रूप में हमें और 13 अन्य के द्वारा मनाया गया). यह इस प्रकार घाव साइट के बाहर electroporated कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने की सिफारिश की है. इसके अलावा, भ्रूण जीवित रहने की दर कम कर रहे हैं जब पहली बार इस तकनीक सीखने, लेकिन जल्दी अभ्यास के साथ> 95% वृद्धि करने के लिए. तिथि करने के लिए, हम सफलतापूर्वक utero electroporation प्रौद्योगिकियों में इस्तेमाल किया है 4 telencephalon में proneural bHLH प्रतिलेखन कारकों द्वारा विनियमित जीन की पहचान . हम भी telencephalic सीआईएस नियामक 3 तत्वों के विश्लेषण के लिए इस तकनीक का उपयोग पुष्टि की है .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों utero सीएस प्रयोगशाला में electroporation प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में स्थापित करने में उनकी प्रारंभिक काम के लिए ईवा Hadzimova, पियरे मटर और क्रिस्टोफर Kovach धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम एक कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR) अनुदान (44,094 एमओपी) और / CIHR फाउंडेशन लड़ (FFB) दृष्टिहीनता सीएस और एक अलबर्टा बच्चों के अस्पताल रिसर्च फाउंडेशन अनुदान के लिए टीम अनुदान (00933-000) द्रमुक उभरते द्वारा वित्त पोषित किया गया था. आरडी एक CIHR कनाडा आशा है कि छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया, आर सी एक FFB छात्रावस्था द्वारा समर्थित है और एलएमएल जेनेटिक्स में CIHR प्रशिक्षण अनुदान और बाल विकास द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fine scissors Surgical Tools Fine Science Tools 14078-10
Iris scissors, curved Surgical Tools Fine Science Tools 14061-10
Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder Surgical Tools Fine Science Tools 12002-12
Ring forceps, 9mm Surgical Tools Fine Science Tools 11103-09
Eye dressing Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11051-10
Dumont #7 DMX Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11271-30
Dumont #5 DMX Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11251-30
Tissue forcep-Adson Surgical Tools Fine Science Tools 11027-12
Reflex Clip Applier Surgical Tools World Precision Instruments, Inc. 500343
Perforated Spoon, 15 mm diameter Surgical Tools Fine Science Tools 10370-18
Autoclip Remover Surgical Tools Mikron 427637
Silk Black Braided Suture Surgical Tools Ethicon Inc. K871
Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips Surgical Tools World Precision Instruments, Inc. 500346
ECM 830 Square Wave Electroporation System Instruments VWR international 58018-004
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode Instruments Protech International, Inc. CUY650P5
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode Instruments Protech International, Inc. CUY650P7
Eppendorf Femtojet Microinjector Instruments VWR international CA62111-488
Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector Instruments VWR international CAACCESS (misc.)
Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH Instruments VWR international CA33995-534CPN-952-118
Sutter P97 Micropipet Puller Instruments Sutter Instrument Co. P-97
Micropipettes -– Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length Instruments Sutter Instrument Co. BF100-78-10
3-Axis Coarse Manipulator Instruments Carl Zeiss, Inc. M-152
Magnetic Holding Device for micromanipulator Instruments World Precision Instruments, Inc. M1
Steel Base Plate for micromanipulator Instruments World Precision Instruments, Inc. 5052
Micropipette Holder Instruments World Precision Instruments, Inc. MPH3
Micropipette Handle Instruments World Precision Instruments, Inc. 5444
Stereomicroscope Instruments Leica Microsystems MZ6
Vaporizer for isoflurane anesthetic Instruments Porter Instruments Company MODEL 100-F
Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools Surgical Reagents Metrex Research Corporation 10-8100
Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing Surgical Reagents Sigma-Aldrich G1264
Germex for sterilizing surgical tools Surgical Reagents Vétoquinol DIN# 00141569
BNP ophthalmic ointment Surgical Reagents Vétoquinol DIN# 00516414
Nair® Surgical Reagents Church & Dwight Co. commercially available
Stanhexidine 4% w/v skin cleaner Surgical Reagents Omega Laboratories Inc. 01938983
Buprenorphine (Temgesic) analgesic Surgical Reagents Merck & Co. 531-535
Sulpha "25" sulphamethazine oral antibiotic Surgical Reagents Professional Veterinary Laboratories DIN# 00308218
Lactated Ringer Solution Surgical Reagents Baxter Internationl Inc. DIN# 0061085
Saline -– 0.9% sodium chloride Surgical Reagents B. Braun Medical DIN# 01924303
Inhalation Anesthetic -– Isoflurane USP Surgical Reagents Pharmaceutical Partners of Canada DIN# 02237518
Fast Green FCF Surgical Reagents Sigma-Aldrich F7252

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References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 52 utero electroporation में भ्रूण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र telencephalon diencephalon रेटिना जीन डिलीवरी माउस लाभ के समारोह नुकसान के समारोह
एकाधिक सीएनएस का प्रयोग शासित प्रदेशों में कुशल जीन डिलीवरी<em> Utero में</em> Electroporation
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Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R.,More

Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).

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