Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

doi: 10.3791/2957 Published: June 23, 2011

Summary

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Abstract

La capacità di manipolare l'espressione genica è la pietra angolare della moderna embriologia giorno sperimentale, che porta alla spiegazione di molteplici vie di sviluppo. Diverse tecnologie potenti e ben consolidata transgenici sono a disposizione per manipolare i livelli di espressione genica nel topo, consentendo la generazione di entrambi perdita e guadagno di funzione dei modelli. Tuttavia, la generazione di topo transgenici è sia costoso e richiede tempo. Metodi alternativi di manipolazione genetica sono stati quindi ampiamente ricercato. In utero elettroporazione è un metodo di consegna del gene in embrioni di topo 1,2 vivere che abbiamo adattato con successo 3,4. È in gran parte sulla base del successo nel campo delle tecnologie di elettroporazione ovo che sono comunemente utilizzati in pulcino 5. In breve, il DNA è iniettato nei ventricoli aperto di sviluppo del cervello e l'applicazione di una corrente elettrica provoca la formazione di pori transienti nelle membrane cellulari, permettendo l'assorbimento del DNA nelle cellule. Nelle nostre mani, gli embrioni possono essere efficacemente elettroporate fin dal giorno embrionale (E) 11,5, mentre l'orientamento dei giovani embrioni richiederebbe un eco-guidata protocollo microiniezione, come descritto in precedenza 6. Al contrario, E15.5 è l'ultima tappa si può facilmente electroporate, a causa della insorgenza di differenziazione dell'osso parietale e frontale, che ostacola microiniezione nel cervello. Al contrario, la retina è accessibile fino alla fine di embriogenesi. Gli embrioni possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento durante il periodo embrionale o postnatale precoce. L'iniezione di un costrutto giornalista facilita l'identificazione delle cellule transfettate.

Ad oggi, l'elettroporazione in utero è stata più utilizzata per l'analisi dello sviluppo neocorticale 1,2,3,4. Studi più recenti hanno preso di mira la retina embrionale 7,8,9 e 10,11,12 talamo. Qui vi presentiamo una versione modificata del protocollo di elettroporazione in utero, che può essere facilmente adattato a bersaglio diversi domini del sistema nervoso embrionale. Noi dimostrare che utilizzando questa tecnica, si può avere come bersaglio l'embrionale telencefalo, diencefalo e della retina. Risultati rappresentativi sono presentati, in primo luogo che mostra l'uso di questa tecnica per introdurre costrutti espressione del DNA nei ventricoli laterali, che ci permette di monitorare la maturazione progenitrici, la differenziazione e la migrazione nel telencefalo embrionale. Mostriamo anche che questa tecnica può essere usata per bersaglio del DNA per i territori circostanti diencefalo il 3 ° ventricolo, consentendo le rotte migratorie di differenziarsi in neuroni dei nuclei diencefalo da monitorare. Infine, abbiamo dimostrato che l'uso di micromanipolatori ci permette di introdurre con precisione i costrutti del DNA in aree bersaglio piccolo, incluso lo spazio sottoretinico, che ci permette di analizzare gli effetti della manipolazione dell'espressione genica per lo sviluppo della retina.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Set-up

  1. Set-up dell'area chirurgica come mostrato in fig. 1A, A '. I componenti chiave del set-up includono un Eppendorf FemtoJet microinjector, micromanipolatore Narishige con porta aghi, steromicroscope Leica, sistema di illuminazione a fibre ottiche, Piazza del sistema ECM 830 Elettroporazione onda con gli elettrodi, piastra elettrica e un vaporizzatore per isoflurano anestetico.
  2. Pulire gli attrezzi con un pulitore ad ultrasuoni BRANSONIC utilizzando Metriclean2 soluzione a bassa formazione di schiuma per sonicating strumenti chirurgici. Sterilizzare gli strumenti in autoclave. Strumenti sterilizzati sono poi tenuti in Germex.
  3. Preparare le siringhe con caldi soluzione fisiologica sterile e sterile Ringer lattato soluzione.

2. Anestesia

  1. Animale svolge all'interno di un piccolo (12cm x 20cm) anestetico da camera. Utilizzando un vaporizzatore, consegnare il 5% anestetico isoflurano e ossigeno a 1L/min (fig. 1 A, A '). In particolare, è importante raccogliere scarico isoflurano utilizzando un sistema di evacuazione fumi.
  2. Rimuovere animale dalla camera quando il respiro diventa profondo e regolare. Pizzicare le dita dei piedi e test di riflessi batter d'occhio sono utilizzate per garantire l'anestesia totale.
  3. Posizionare il mouse incinta sul dorso sopra una piastra elettrica (37 ° C). La piastra elettrica è prima sterilizzato strofinando con etanolo al 70%, e viene poi coperto con un sterilizzato, garza lintless. Utilizzare un tubo respiratore e apparecchi maschera per fornire isoflurano (2,25%) durante l'intervento chirurgico.
  4. Iniettare buprenorfina (peso corporeo 0.1mg/kg) per via sottocutanea sotto la pelle alla nuca.
  5. Monitor animali in tutta la chirurgia per la respirazione profonda e regolare. L'animale non deve respiro, respirare superficialmente o rapidamente. Poco profondo, la respirazione veloce può essere un segno di luce anestesia, e il flusso di isoflurano dovrebbe essere aumentato. Se l'animale comincia a boccheggiare, ridurre il flusso di isoflurano. Nel caso di un arresto respiratorio, spegnere isoflurano, e aumentare il flusso di ossigeno fino animale recupera. Riavviare isoflurano ad una concentrazione inferiore.

3. Preparazione degli animali per la chirurgia

  1. Nastro zampe anteriori di animali per il termoforo e controllare di nuovo per una risposta ritrattazione da pizzicare il piede posteriore con pinza contundente.
  2. Usando un tampone di cotone sterile a punta, si sviluppa uno spesso strato di crema depilatoria (cioè, Nair) sul ventre. A colpi di azienda, assicurare il sottopelo è completamente rivestita. Lasciare agire per una media di tre minuti, controllando in modo intermittente con un tampone sterile pulito per la depilazione. Bagnate un tampone di garza sterile con acqua sterile e asciugare l'addome fino a quando tutte le tracce sono scomparse. Ripetere con clorexidina (cioè Stanhexidine) pelle più pulita e più acqua. Asciugare l'addome con garza pulita e sterile.
  3. Sterilizzare sito di incisione con clorexidina (cioè Stanhexidine), seguito da più acqua sterile. Asciugare l'addome con garza pulita e sterile. Ripetere questo passaggio utilizzando etanolo al 70% e un fresco, tampone di cotone sterilizzati.
  4. Posizionare un tampone di garza sterile sopra l'addome con una fessura nel mezzo attraverso il quale le corna uterine sarà tirato durante l'intervento.

4. Incisione ed esposizione di corni uterini

  1. Per esporre le corna uterine, in primo luogo individuare la linea alba come la linea debole sotto la pelle sulla linea mediana. Utilizzando pinze, tirare la pelle dalla parete addominale e tagliate una piccola incisione direttamente dalla metà verso il basso addome con le forbici pelle (circa 1 cm di lunghezza).
  2. Uso di pinze e forbici curve, ripetere il processo con il peritoneo.
  3. Luogo garza sterile con una piccola fessura verticale sopra incisione e smorzare riscaldato con soluzione salina sterile.
  4. Far scorrere pinze in incisione e individuare l'utero. Tenere incisione aperta con una pinza e rimuovere le corna uterine.
  5. Afferrare l'utero tra gli embrioni prima e la seconda visibile ed estrarre gli embrioni sulla garza. Rimuovere entrambi i lati delle corna uterine, ponendo sulla garza sterile e contare il numero di embrioni, notando alcun riassorbimento o "non sani" (ad esempio dimensioni del corpo più piccolo) embrioni. Bagnare le corna uterine con soluzione salina e con cura la metà di ritorno dell'utero nell'addome.

5. L'iniezione di DNA in ventricoli

  1. Aghi chirurgici sono preparati con un estrattore Sutter Flaming Micropipetta usando micropipette borosilicato con capillari (Programma: calore = 750, Pull = 30, Vel = 90, Tempo = 150). Utilizzando una lama bisturi sterile, la punta dell'ago è leggermente rasato con un angolo di 45 gradi.
  2. Per caricare l'ago, pipette Pasteur sono tirati ad un diametro stretto sotto una fiamma. Un pezzo bocca è collegata alla pipetta carico di elaborare ~ 10 ml di 3mg/ml privo di endotossine DNA mescolato con 0,01% metil verde (nota: metil colorante verde consente iniezioni di DNA da visualizzare). L'ago viene poi riempito montato su un supporto micromanipolatore e attaccato all'iniettore FemtoJet.
  3. Partendo con l'embrione più vicino al ovaio, circolare forcipevengono utilizzati per trasformare delicatamente l'embrione all'interno della decidua in modo che sia posizionato "faccia avanti", permettendo iniezioni a verificarsi in un rostrale alla direzione caudale. Una fonte di illuminazione a fibre ottiche per l'illuminazione è usato per aiutare a visualizzare la linea mediana del cervello embrionale, che viene affiancata dalla grande ventricoli laterali nelle regioni rostrale (Fig. 1B, B ').
  4. L'embrione viene tenuto in posizione mediante pinze circolare. L'ago è posizionato sopra l'utero in modo che l'angolo di entrata nel cervello è di circa 45 gradi. Utilizzando il micromanipolatore, e un movimento veloce e costante, la punta dell'ago viene inserito attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale dell'embrione. Le iniezioni sono diretti verso i ventricoli laterali, terzo ventricolo o spazio sottoretinico di indirizzare la, diencefalo e telencefalo retina, rispettivamente. Si noti che le vescicole cerebrali embrionali sono aperte primi stadi embrionali tale che il DNA iniettato nei ventricoli laterali fluirà nel ventricolo 3 °.
  5. Premere il pedale per iniettare privo di endotossine DNA (1-3 mL) con un Eppendorf FemtoJet microinjector. Un'iniezione di successo è facilmente visualizzabile attraverso la diffusione del colorante verde metile in tutto i ventricoli del cervello embrionale. L'ago viene poi lentamente rimosso da redazione il backup per evitare la rottura.

6. Elettroporazione

  1. L'embrione iniettato (ancora all'interno dell'utero) è posto sulla garza sterile sovrastante sull'addome della madre e bagnate abbondantemente con soluzione salina riscaldata. ** Si prega di notare l'aggiunta di soluzione fisiologica alla superficie della membrana è essenziale per consentire il passaggio efficiente di una corrente elettrica.
  2. GenePaddle elettrodi vengono utilizzati per afferrare l'utero dopo l'iniezione del DNA. Cinque impulsi elettrici piazza di 40-50V e 50 ms sono consegnati al ritmo di un impulso al secondo utilizzando un sistema di elettroporazione BTX ECM8300 (Fig. 1C, C ').
  3. Coprire l'embrione iniettato / elettroporate con protezione garza umida e continuare per l'embrione successiva.
  4. Al termine della iniezione / elettroporazione di tutti gli embrioni desiderati, spingere con attenzione le corna uterine nuovamente dentro l'addome (Fig. 1D).
  5. Rimuovere con attenzione l'altro corno uterino e ricominciare con l'embrione più vicino al dell'ovaio.

7. Sutura e pinzatura

  1. Una volta che tutti gli embrioni sono tornati dentro l'utero, aggiungere alla cavità addominale ~ 2-3 ml di soluzione salina calda.
  2. Per chiudere la ferita, iniziare rimuovendo il velo sul ventre e identificare i lati del peritoneo. Iniziare la sutura del peritoneo con linea nera di seta intrecciata. Non è raccomandato l'uso di fili riassorbibili per questa procedura in quanto è generalmente più debole e può portare a sanguinamento post-operatorio e infezioni. Ancorare la linea sul peritoneo più vicina allo sterno e procedere al punto di distanza dal ancoraggio. Assicurarsi che tutte le suture sono stretti, e che non gli organi sottostanti o pelle è stata inavvertitamente cucito nel peritoneo. Agganciare la linea di sutura rimanente e scartare.
  3. Tirare la pelle chiuso oltre la linea di sutura con una pinza. Reflex con 9 millimetri ™ pelle chiusura a punti metallici, clip la pelle sopra la ferita, facendo attenzione a non graffetta sottostante linea di sutura, o per tirare la pelle troppo stretto. Il metodo preferito è quello di tenere la pelle in alto e lontano dal corpo con una pinza, e sono disponibili in un angolo di 90 gradi con lo strumento di base. Continuare fino ferita è chiuso (circa tre punti). Una volta finito, garantire graffette sono stretti premendo delicatamente con lo strumento di sutura (Fig. 1D ').

8. Post-chirurgica Cura

  1. Per monitorare il recupero anestetico, girare femminile sullo stomaco e spegnere isoflurano. Mantenere volto dell'animale all'interno del respiratore, trasformare l'ossigeno fino al 3% per contribuire alla ripresa dall'anestesia. L'animale deve essere collocato su un blocco pulita garza sulla parte superiore della piastra elettrica per prevenire l'ipotermia.
  2. Mentre l'animale è groggy, iniettare 2 ml di Ringer soluzione per via sottocutanea sotto la pelle del collo dell'animale.
  3. Continuare a tenere l'animale in condizioni di flusso di ossigeno per alcuni minuti e garze riscaldamento al fine di risvegliare l'animale. Verificarsi brevi spruzzi di movimento da l'animale deve essere osservato come si ritorna a un modello di respirazione normale. Osservare per alcuni minuti fino a quando animale sembra cosciente e sveglio.
  4. Spray addome della femmina con gentamicina spray e avvolgere l'animale in una garza sterile.
  5. Trasferire l'animale in una gabbia sterile con biancheria da letto in autoclave e custodia di cartone.
  6. Bottiglie d'acqua devono essere accuratamente puliti, sterilizzati e riempita con acqua sterile. A 500 ml di acqua aggiungere 2 ml di antibiotico sulfamethazine (25% azioni).
  7. Somministrare 0,05 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina la chirurgia mattino seguente.
  8. Monitorare da vicino la femmina per le prime 24 ore post-operatorie. Se gli animali vengono tenuti più di 24 ore, le femmine vengono spostati ster nuovogabbie ile il giorno 2.

9. Rappresentante Risultati

Neocorteccia

La neocorteccia è la regione del sistema nervoso centrale che è responsabile per l'elaborazione visiva e senso-motori e più alto funzionamento cognitivo. E 'composto da neuroni di proiezione glutammatergica e interneuroni GABAergici che derivano dal telencefalo dorsale e ventrale, rispettivamente. Per affrontare i ruoli dei diversi geni nello sviluppo neocorticale, usiamo elettroporazione in utero a uno misexpress o bloccare l'espressione (ad esempio, attraverso l'uso di costrutti shRNA) di geni diversi nella dorsale o ventrale telencefalo 1,3,4. Per misexpress geni nel telencefalo embrionale, usiamo un vettore di espressione bicistronic (pCIG2), contenente un CMV βactin promotore-enhancer e un sito interno ingresso ribosoma (IRES) con capacità di proteina fluorescente verde (EGFP; in pCIG2) cassetta, permettendo transfettate cellule per essere rilevato da epifluorescenza (Fig. 2A-C). Abbiamo utilizzato questa tecnologia per introdurre i costrutti di espressione nel telencefalo da E11.5 a E15.5 (dati riportati sono a E12.5;. Fig. 2). Consentendo di sviluppare embrioni diversi giorni post-elettroporazione, siamo in grado di monitorare la differenziazione e la migrazione di GFP-etichettata progenitori. Come procede la differenziazione, 3 giorni dopo l'elettroporazione GFP + cellule si differenziano e migrano dalla zona ventricolare (VZ), zona subventricolare (SVZ) e la zona intermedia (iz) e nella piastra corticale (cp;. Fig. 2C). Se il cervello elettroporate a E12.5 vengono analizzati dopo 24 ore, siamo in grado di monitorare eventi precedenti nella maturazione progenitrici e migrazione neuronale dal co-etichettatura con i marcatori dei progenitori apicale (cioè, Pax6;. Fig. 2A), progenitori basale (cioè, Tbr2; . Fig. 2B) e postmitotic neuroni neocorticale (cioè, Tbr1;. Fig. 2C).

Diencefalo

L'ipotalamo è alla base ventrale del sistema nervoso centrale e funge da gateway tra il sistema endocrino e sistema nervoso autonomo. Durante lo sviluppo, i nuclei multipli che compongono l'ipotalamo maturo differenziano da una zona progenitore comune che riveste la regione più ventrale del diencefalo embrionale. Attualmente, le vie molecolari che regolano la proliferazione delle cellule progenitrici, la differenziazione neuronale e la formazione dei nuclei ipotalamici sono poco conosciuti. Abbiamo usato elettroporazione in utero ad obiettivo di espressione genica giornalista al diencefalo embrionale, iniettando il DNA nel 3 ° ventricolo di E12 embryos.We poi seguito la distribuzione di GFP nel differenziare in neuroni E14. Con questa metodologia, abbiamo mirato con successo espressione GFP al talamo, pre-talamo e ipotalamo (Fig. 3A). Analisi di sezioni coronali rivela che siamo riusciti a mirati espressione GFP alle cellule progenitrici che rivestono la zona ventricolare del 3 ° ventricolo e neuroni che migrano verso la zona di mantello per formare nuclei (Fig. 3B)

Retina

La retina è lo strato neurale dell'occhio, responsabile della conversione fotoni di luce in impulsi elettrici trasmessi al cervello. Si sviluppa come un outpocketing del diencefalo embrionale, e quindi, è derivato dal tubo neurale. La retina neurale si sviluppa da un compartimento progenitore apicale che si trova adiacente allo spazio sottoretinico, una cavità che separa l'occhio dal mesenchima testa. Targeting costrutti di DNA per cellule progenitrici della retina richiede pertanto che le iniezioni sono fatte in una piccola area di destinazione. Utilizzando micromanipolatori, siamo riusciti a bersaglio con successo questa piccola area in embrioni a E13.5 E15.5 (indicato è E15.5 electroporations di PCIC con la giornalista mCherry; Fig. 4).. Se elettroporate retina vengono esaminati 24 ore post-trasfezione, si osserva che la maggior parte delle cellule + mCherry si trovano nello strato esterno neuroblasti (onbl), dove si trovano progenitori divisione, e non nello strato delle cellule gangliari della retina (GCL; immagine nel riquadro), dove le cellule postmitotic localizzare.

Figura 1
Figura 1. Introduzione al elettroporazione utero set-up e metodologia. (A) I componenti chiave del set-up chirurgico includono un Eppendorf FemtoJet microinjector (1), micromanipolatore Narishige con porta aghi (2), steromicroscope Leica (3), illuminazione a fibre ottiche sistema (4), 830 ECM Onda quadra sistema di elettroporazione con elettrodi (5) e piastra elettrica (6). (A ') L'animale viene anestetizzato con un vaporizzatore per isoflurano anestetico. (B, B ') In breve, dopo l'anestesia, le corna uterine sono esposti e DNA mescolato con verde veloce è iniettato nel cervello vescicole embrionali. Un'iniezione di successo viene visualizzato tenendo traccia del digiuno colorante verde (B '). (C, C ') Dopo che il DNA è iniettato con successo, gli elettrodi pagaia sono posti ai lati dell'utero, positioning l'embrione in modo che il DNA sarà tirato verso il polo positivo nella regione del cervello di scelta. (D, D ') Una volta che tutti gli embrioni desiderati vengono iniettate, l'utero è spinto indietro nell'addome (D), il peritoneo viene suturata, e la pelle è cucito con punti metallici (D'). La femmina incinta è poi permesso di recuperare e elettroporate i cuccioli vengono raccolti presso i punti di tempo desiderato.

Figura 2
Figura 2. Esempio rappresentativo di dorsale elettroporazione telencefaliche. (AC) Micrografia di una sezione coronale attraverso un telencefalo dorsale E13.5 elettroporate a E12.5 con pCIG2. Elettroporate cellule GFP + vengono analizzati per la loro espressione di marcatori di cellule progenitrici apicale (Pax6 +, rosso, A), progenitori basale (Tbr2 +, rosso, B) e neuroni postmitotic (Tbr1 +, rosso, C). cp, corticale piastra; SVZ, zona subventricolare, vz; zona ventricolare.

Figura 3
Figura 3. Esempio rappresentativo di elettroporazione diencefalo. (A) Una vista ventrale di un cervello E14 che è stato elettroporate a E12 con pCIG2. GFP epifluorescenza è visibile nel talamo, pre-talamo e ipotalamo, a dimostrazione della diffusione del pCIG2 microiniettati plasmide in tutto il 3 ° ventricolo. (B) Micrografia della sezione coronale del cervello attraverso elettroporate, dimostrando la migrazione di cellule GFP + fuori dalla zona ventricolare e nella zona del mantello, in cui nuclei ipotalamici formeranno. 3V, terzo ventricolo; T, talamo, Hy, l'ipotalamo, mz, mantello zona; Tel, telencefalo; Pret, prethalamus; vz, zona ventricolare.

Figura 4
Figura 4. Esempio rappresentativo di elettroporazione della retina. Sezione coronale attraverso un occhio E16.5 elettroporate con PCIC a E15.5 che mostra l'accumulo di cellule mCherry + neuroblasti dello strato esterno e non in Brn3b + cellule gangliari della retina nello strato delle cellule gangliari. L'inserto è un'immagine più alto ingrandimento della zona in scatola. GCL, strato delle cellule gangliari della retina, le, lente; onbl, neuroblasti strato esterno; re, retina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In utero elettroporazione può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di processi di sviluppo. Per esempio, la trasfezione di geni reporter come GFP, mCherry o della fosfatasi alcalina può essere utilizzato per condurre esperimenti di lineage tracing e migrazione neuronale. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere transitoriamente espresso per eliminare selettivamente un allele floxed in un spazialmente e / o temporalmente modo controllato. Inoltre, shRNA o dominante costruisce negativo può essere elettroporate per la funzione del gene bersaglio knockdown. Infine, l'iperespressione o misexpression mirata di geni chiave sia nel tipo selvatico e / o linee di topi geneticamente mutante può essere utilizzato per studiare le decisioni destino cellulare. L'elevato throughput di questo test è fondamentale in quanto consente per la sperimentazione di combinazioni di fattori che in un tempo molto breve. Una nota di cautela è che questa procedura non causa cambiamenti nell'espressione genica nelle cellule che rivestono il sito di entrata dell'ago (ad esempio, lesioni geni della risposta sovraregolati nella ferita, come osservato da noi e altri 13). E 'quindi consigliato di concentrarsi sulle cellule elettroporate al di fuori del sito ferita. Inoltre, i tassi di sopravvivenza dell 'embrione sono bassi al momento della prima imparare questa tecnica, ma salire velocemente fino a> 95% con la pratica. Fino ad oggi, abbiamo utilizzato con successo nel campo delle tecnologie elettroporazione utero per identificare i geni regolati da fattori di trascrizione proneural bHLH nel telencefalo 4. Abbiamo anche convalidato l'uso di questa tecnica per l'analisi dei telencefaliche cis-elementi normativi 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach per il loro lavoro iniziale per stabilire nella tecnologia di elettroporazione utero in laboratorio CS. Questo lavoro è stato finanziato da una Canadian Institute of Health Research (CIHR) sovvenzioni (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging squadra di Grant (00933-000) per CS e bambini Alberta Hospital Research Foundation Grant a DMK. RD è stato sostenuto da una borsa di studio CIHR Speranza Canada, RC è supportato da un Studentship FFB e LML è stato sostenuto da una borsa di formazione CIHR in Genetica e sviluppo del bambino.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fine scissors Surgical Tools Fine Science Tools 14078-10
Iris scissors, curved Surgical Tools Fine Science Tools 14061-10
Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder Surgical Tools Fine Science Tools 12002-12
Ring forceps, 9mm Surgical Tools Fine Science Tools 11103-09
Eye dressing Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11051-10
Dumont #7 DMX Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11271-30
Dumont #5 DMX Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11251-30
Tissue forcep-Adson Surgical Tools Fine Science Tools 11027-12
Reflex Clip Applier Surgical Tools World Precision Instruments, Inc. 500343
Perforated Spoon, 15 mm diameter Surgical Tools Fine Science Tools 10370-18
Autoclip Remover Surgical Tools Mikron 427637
Silk Black Braided Suture Surgical Tools Ethicon Inc. K871
Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips Surgical Tools World Precision Instruments, Inc. 500346
ECM 830 Square Wave Electroporation System Instruments VWR international 58018-004
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode Instruments Protech International, Inc. CUY650P5
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode Instruments Protech International, Inc. CUY650P7
Eppendorf Femtojet Microinjector Instruments VWR international CA62111-488
Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector Instruments VWR international CAACCESS (misc.)
Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH Instruments VWR international CA33995-534CPN-952-118
Sutter P97 Micropipet Puller Instruments Sutter Instrument Co. P-97
Micropipettes -– Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length Instruments Sutter Instrument Co. BF100-78-10
3-Axis Coarse Manipulator Instruments Carl Zeiss, Inc. M-152
Magnetic Holding Device for micromanipulator Instruments World Precision Instruments, Inc. M1
Steel Base Plate for micromanipulator Instruments World Precision Instruments, Inc. 5052
Micropipette Holder Instruments World Precision Instruments, Inc. MPH3
Micropipette Handle Instruments World Precision Instruments, Inc. 5444
Stereomicroscope Instruments Leica Microsystems MZ6
Vaporizer for isoflurane anesthetic Instruments Porter Instruments Company MODEL 100-F
Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools Surgical Reagents Metrex Research Corporation 10-8100
Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing Surgical Reagents Sigma-Aldrich G1264
Germex for sterilizing surgical tools Surgical Reagents Vétoquinol DIN# 00141569
BNP ophthalmic ointment Surgical Reagents Vétoquinol DIN# 00516414
Nair® Surgical Reagents Church & Dwight Co. commercially available
Stanhexidine 4% w/v skin cleaner Surgical Reagents Omega Laboratories Inc. 01938983
Buprenorphine (Temgesic) analgesic Surgical Reagents Merck & Co. 531-535
Sulpha "25" sulphamethazine oral antibiotic Surgical Reagents Professional Veterinary Laboratories DIN# 00308218
Lactated Ringer Solution Surgical Reagents Baxter Internationl Inc. DIN# 0061085
Saline -– 0.9% sodium chloride Surgical Reagents B. Braun Medical DIN# 01924303
Inhalation Anesthetic -– Isoflurane USP Surgical Reagents Pharmaceutical Partners of Canada DIN# 02237518
Fast Green FCF Surgical Reagents Sigma-Aldrich F7252

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  2. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  3. Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. 1273-1286 (2007).
  4. Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
  5. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  6. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
  8. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (2009).
  9. Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
  10. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  11. Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  12. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
  13. Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo<em> In Utero</em> Elettroporazione
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).More

Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter