Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l'aide In Utero L'électroporation

Summary

Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Abstract

La capacité de manipuler l'expression des gènes est la pierre angulaire de la journée embryologie moderne expérimentale, ce qui conduit à l'élucidation des multiples voies de développement. Plusieurs puissants et bien établis technologies transgéniques sont disponibles pour manipuler les niveaux de l'expression des gènes chez la souris, permettant la génération des deux perte et le gain de fonction des modèles. Cependant, la génération de souris transgéniques est à la fois coûteux et fastidieux. D'autres méthodes de manipulation génétique ont donc été largement sollicités. In utero électroporation est une méthode de transfert de gènes dans les embryons de souris ^1,2 que nous avons réussi à adapter ^3,4 vivre. Il est largement basé sur le succès de l'électroporation in ovo dans les technologies qui sont couramment utilisés dans chiches ^5. Brièvement, l'ADN est injecté dans les ventricules du cerveau ouverte développement et l'application d'un courant électrique provoque la formation de pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant l'absorption de l'ADN dans la cellule. Dans nos mains, les embryons peuvent être efficacement électroporées dès le jour embryonnaire (E) 11,5, tandis que le ciblage des jeunes embryons exigerait une guidée par échographie protocole de micro-injection, comme décrit précédemment ^6. Inversement, E15.5 est la dernière étape, nous pouvons facilement électroporation, en raison de l'apparition de la pariétale et la différenciation des os frontal, ce qui entrave la microinjection dans le cerveau. En revanche, la rétine est accessible par la fin de l'embryogenèse. Les embryons peuvent être recueillies à aucun moment pendant toute la période embryonnaire ou postnatale précoce. L'injection d'un journaliste de la construction facilite l'identification des cellules transfectées.

À ce jour, électroporation in utero a été plus largement utilisé pour l'analyse du développement du néocortex ^1,2,3,4. Des études plus récentes ont ciblé la rétine et le thalamus embryonnaire ^{7,8,9 10,11,12.} Ici, nous présentons une modification dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être facilement adaptée pour cibler les différents domaines du système nerveux central embryonnaire. Nous fournir la preuve que en utilisant cette technique, nous pouvons cibler le télencéphale embryonnaire, diencéphale et la rétine. Les résultats représentatifs sont présentés, montrant d'abord l'utilisation de cette technique pour introduire des constructions d'expression d'ADN dans les ventricules latéraux, nous permettant de suivre la maturation progénitrices, la différenciation et la migration dans le télencéphale embryonnaire. Nous montrons également que cette technique peut être utilisée pour cibler l'ADN dans les territoires environnants diencéphalique le ventricule 3 ^ème, permettant les routes migratoires de différencier les neurones en noyaux diencéphalique à surveiller. Enfin, nous montrons que l'utilisation de micromanipulateurs nous permet d'introduire précisément constructions d'ADN dans les zones cibles légères, y compris l'espace sous-rétinien, nous permettant d'analyser les effets de la manipulation de l'expression des gènes sur le développement de la rétine.

Protocol

1. Mise en place

1. Set-up zone chirurgicale, comme indiqué dans la Fig. 1A, A '. Les éléments clés de la mise en place comprennent une Eppendorf FemtoJet microinjecteur, micromanipulateur Narishige avec porte-aiguille, steromicroscope Leica, système d'éclairage à fibres optiques, ECM 830 Système Place électroporation vague avec des électrodes, un coussin chauffant et d'un vaporisateur pour l'isoflurane anesthésique.
2. Nettoyer tous les outils avec un nettoyeur à ultrasons à l'aide Bransonic Metriclean2 solution à faible moussant pour sonication outils chirurgicaux. Stériliser par autoclavage des outils. Outils stérilisés sont ensuite conservés dans Germex.
3. Préparer les seringues avec une solution saline stérile tiède et une solution stérile de Ringer lactate.

2. L'anesthésie

1. Animaux lieu à l'intérieur d'une petite (12cm x 20cm) Chambre d'anesthésie. L'utilisation d'un vaporisateur, de livrer 5% anesthésiant isoflurane et oxygène à 1l/min (Fig. 1A, A '). Notamment, il est important de recueillir l'isoflurane d'échappement à l'aide d'un système de balayage.
2. Retirer les animaux de la chambre où la respiration devient profonde et régulière. Pincer les Pieds et des tests clin d'œil réflexes sont utilisés pour assurer une anesthésie complète.
3. Placez la souris enceintes sur son dos sur le dessus d'un coussin chauffant (37 ° C). Le coussin chauffant est d'abord stérilisés en essuyant avec de l'éthanol à 70%, et est ensuite recouvert d'une stérilisation, tampon de gaze non pelucheux. Utiliser un tube respirateur et un appareil masque pour livrer l'isoflurane (2,25%) pendant la chirurgie.
4. Injecter la buprénorphine (poids corporel 0.1mg/kg) sous-cutanée sous la peau à la nuque.
5. Surveiller les animaux à travers une intervention chirurgicale pour la respiration profonde et régulière. L'animal ne doit pas haleter, respirer superficiellement ou rapidement. Peu profond, une respiration rapide peut être un signe d'une anesthésie légère, et l'écoulement de l'isoflurane doit être augmenté. Si l'animal commence à haleter, réduire le débit de l'isoflurane. Dans le cas d'un arrêt respiratoire, éteignez l'isoflurane, et augmenter le flux d'oxygène jusqu'à animaux récupère. Redémarrez l'isoflurane à une concentration inférieure.

3. Préparation pour la chirurgie des animaux

1. Ruban pattes avant de l'animal à l'coussin chauffant et vérifier à nouveau pour une réponse de rétraction en pinçant l'arrière-pied avec une pince émoussée.
2. L'utilisation d'un coton-tige stérile, étaler une couche épaisse de crème dépilatoire (c.-à-Nair) sur l'abdomen. Dans coups cabinet, d'assurer la bourre est complètement couché. Laissez agir pendant une moyenne de trois minutes, en vérifiant par intermittence avec un écouvillon stérile propre pour l'épilation. Mouillez un tampon de gaze stérile avec de l'eau stérile et essuyer l'abdomen jusqu'à ce que toutes les traces ont disparu. Répétez l'opération avec la chlorhexidine (ie, Stanhexidine) peau plus propre et plus d'eau. Sec l'abdomen avec propreté, de la gaze stérile.
3. Stériliser site d'incision avec un chlorhexidine (ie, Stanhexidine) suivie par plus d'eau stérile. Sec l'abdomen avec propreté, de la gaze stérile. Répétez cette étape en utilisant 70% d'éthanol et d'une fraîcheur, un coton-tige stérile.
4. Placez un tampon de gaze stérile sur l'abdomen avec une fente au milieu à travers lequel les cornes utérines sera tiré lors de la chirurgie.

4. Incision et exposition des cornes utérines

1. Pour exposer les cornes utérines, d'abord localiser la ligne blanche comme la ligne pâle sous la peau à la ligne médiane. En utilisant des pinces, tirez la peau loin de la paroi abdominale et couper une petite incision droite de la baisse milieu de l'abdomen avec des ciseaux la peau (environ 1 cm de longueur).
2. En utilisant des pinces et ciseaux courbes, répétez le processus avec le péritoine.
3. Placer la gaze stérile avec une petite fente verticale sur l'incision et humecter avec une solution saline stérile réchauffé.
4. Faites glisser une pince dans l'incision et de localiser l'utérus. Tenez incision ouverte avec une pince tout en supprimant les cornes utérines.
5. La délicatement l'utérus entre le premier et le deuxième embryons visibles et tirez les embryons sur la gaze. Retirez les deux côtés des cornes utérines, en plaçant sur la gaze stérile et compter le nombre d'embryons, en notant toute résorptions ou "malsain" (par exemple plus petite taille corporelle) des embryons. Mouiller les cornes utérines avec du sérum physiologique et soigneusement le retour de la moitié de l'utérus dans l'abdomen.

5. L'injection d'ADN dans Ventricules

1. Aiguilles chirurgicales sont préparés avec un extracteur Micropipette Sutter Flaming utilisant des micropipettes borosilicate avec capillaires (Programme: chaleur = 750, Pull = 30, Vel = 90, heure = 150). En utilisant une lame scalpel stérile, la pointe de l'aiguille est doucement rasé à un angle de 45 degrés.
2. Pour charger l'aiguille, des pipettes Pasteur sont tirés d'un diamètre étroit sous une flamme. Un embout est attaché à la pipette de chargement de dresser ~ 10 pl de 3mg/ml sans endotoxine ADN mélangé avec 0,01% de vert de méthyle (à noter: le vert de méthyle colorant permet d'injections d'ADN pour être visualisés). L'aiguille remplie est ensuite monté sur un stand micromanipulateur et attaché à l'injecteur FemtoJet.
3. A partir de l'embryon le plus proche de l'ovaire, circulaire pincesont utilisées pour tourner doucement l'embryon au sein de la caduque afin qu'il se positionne en «face avant», permettant des injections de se produire dans un rostre à la direction caudale. Une source de lumière en fibre optique pour l'éclairage est utilisé pour aider à visualiser la ligne médiane du cerveau embryonnaire, qui est flanquée par les ventricules latéraux grande dans les régions rostrales (Fig. 1B, B ').
4. L'embryon est maintenu en position en utilisant une pince circulaire. L'aiguille est positionnée au-dessus de l'utérus afin que l'angle d'entrée dans le cerveau est d'environ 45 degrés. Utilisation du micromanipulateur, et un mouvement rapide et régulier, la pointe de l'aiguille est insérée à travers la paroi de l'utérus et dans le ventricule latéral de l'embryon. Les injections sont dirigés vers les ventricules latéraux, 3ème ventricule ou espace sous-rétinien de cibler le télencéphale, diencéphale et la rétine, respectivement. Notez que les vésicules cérébrales embryonnaires sont ouverts au premiers stades embryonnaires telles que l'ADN injecté dans les ventricules latéraux se jettent dans le ventricule 3 ^ème.
5. Appuyez sur la pédale d'injecter sans endotoxine l'ADN (1-3 uL) en utilisant une Eppendorf FemtoJet microinjecteur. Une injection de succès est facilement visualisée en répandant de l'colorant vert de méthyle à travers les ventricules du cerveau embryonnaire. L'aiguille est ensuite lentement retirée en dessinant remonter à éviter la rupture.

6. L'électroporation

1. L'embryon injecté (toujours dans l'utérus) est placé sur la gaze stérile recouvrant l'abdomen de la mère et de bien mouiller avec du sérum physiologique réchauffé. S'il vous plaît noter ** L'ajout d'une solution saline à la surface de la membrane est essentielle pour permettre le passage efficace d'un courant électrique.
2. Électrodes GenePaddle sont utilisés pour saisir l'utérus après l'injection de l'ADN. Cinq carrés des impulsions électriques de 40-50V et 50 ms sont livrés à un rythme d'une impulsion par seconde grâce à un système ECM8300 électroporation BTX (Fig. 1C, C ').
3. Couvrir l'embryon injecté / électroporation avec gaze humide de protection et de continuer à l'embryon prochaine.
4. À la fin de l'injection / électroporation de tous les embryons désirés, poussez délicatement les cornes utérines dans l'abdomen (Fig. 1D).
5. Retirer délicatement l'autre corne utérine et recommencer avec l'embryon plus proche de l'ovaire.

7. Suture et d'agrafage

1. Une fois que tous les embryons sont de retour dans l'utérus, ajouter à la cavité abdominale ~ 2-3 ml de sérum physiologique chaud.
2. Pour fermer la plaie, commencez par retirer la gaze sur l'abdomen et en identifiant les côtés du péritoine. Commencez suture du péritoine en utilisant la ligne noire de soie tressée. Il n'est pas recommandé d'utiliser résorbable pour cette procédure car elle est généralement plus faible et peut conduire à des saignements post-opératoires et les infections. La ligne d'ancrage sur le péritoine le plus proche du sternum et de procéder à broder loin de l'ancre. S'assurer que tous les points de suture sont serrés, et que nul organes sous-jacents ou de la peau a été par inadvertance cousu dans le péritoine. Clips la ligne de suture restants et jeter.
3. Tirez la peau fermée sur la ligne de suture avec une pince. L'utilisation de 9 mm Reflex ™ fermeture de la peau des agrafes, pince la peau sur la plaie, en prenant soin de ne pas agrafer les dessous de la ligne de suture, ou de tirer la peau trop serrée. La méthode préférée consiste à maintenir la peau et du corps avec des forceps, et viennent dans un angle de 90 degrés avec l'outil de base. Continuez jusqu'à ce que la plaie est fermée (environ trois agrafes). Une fois terminé, assurez-agrafes sont serrés en appuyant délicatement avec l'outil de suture (Fig. 1D).

8. Soins post-chirurgicaux

1. Pour surveiller le rétablissement de l'anesthésie, tournez femme sur son ventre et éteindre l'isoflurane. Garder le visage de l'animal à l'intérieur de l'appareil respiratoire, tournez l'oxygène jusqu'à 3% pour aider à la récupération de l'anesthésie. L'animal doit être placé sur une compresse de gaze propre et sec sur le dessus du coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie.
2. Alors que l'animal est groggy, injecter 2 mL de solution de Ringer sous-cutanée sous la peau du cou de l'animal.
3. Continuez à maintenir l'animal sous flux d'oxygène pendant plusieurs minutes et des tampons de gaze réchauffement afin de réveiller l'animal. Courtes périodes de mouvement de l'animal doit être observé comme il renvoie à une respiration normale. Observez pendant quelques minutes jusqu'à animal semble conscient et éveillé.
4. Vaporiser l'abdomen de la femelle avec la gentamicine de pulvérisation et envelopper l'animal dans un tampon de gaze stérile.
5. Transfert de l'animal dans une cage stérile avec la literie à l'autoclave et le logement en carton.
6. Les bouteilles d'eau doivent être soigneusement nettoyés, stérilisés et remplis d'eau stérile. Pour 500 ml d'eau, ajouter 2 ml d'antibiotique sulfaméthazine (25% actions).
7. Administrer 0,05 mg / kg de buprénorphine par voie sous cutanée de la chirurgie le lendemain matin.
8. Surveiller de près la femelle pendant les 24 premières heures après la chirurgie. Si les animaux sont gardés plus de 24 heures, les femelles sont déplacés vers de nouveaux sterIle des cages le jour 2.

9. Les résultats représentatifs

Néocortex

Le néocortex est la région de la CNS qui est responsable de visuels et sensori-traitement et le fonctionnement cognitif supérieur. Il est composé de neurones de projection glutamatergiques et les interneurones GABAergiques qui sont dérivés de l'télencéphale ventral et dorsal, respectivement. Pour répondre aux rôles des différents gènes dans le développement du néocortex, nous utilisons électroporation in utero soit misexpress ou de bloquer l'expression (par exemple, grâce à l'utilisation de constructions shRNA) de gènes différents dans la dorsale ou ventrale télencéphale ^1,3,4. Pour misexpress gènes dans le télencéphale embryonnaire, nous utilisons un vecteur d'expression bicistronique (pCIG2), contenant un promoteur CMV βactin-amplificateur et un site d'entrée interne des ribosomes (IRES) amélioré par la protéine fluorescente verte (EGFP, dans pCIG2) cassette, permettant transfectées cellules pour être détecté par épifluorescence (Fig. 2A-C). Nous avons utilisé cette technologie pour introduire des constructions d'expression dans le télencéphale de E11.5 E15.5 d'(données présentées au E12.5;. Fig 2). En permettant de développer des embryons quelques jours après l'électroporation, nous sommes en mesure de suivre la différenciation et la migration de la GFP-étiquetée progéniteurs. Comme produit de différenciation, trois jours après l'électroporation cellules GFP ⁺ différencier et migrer hors de la zone ventriculaire (VZ), zone sous-ventriculaire (SVZ) et zone intermédiaire (iz) et dans la plaque corticale (cp;. Fig 2C). Si les cerveaux électroporation à E12.5 sont analysées après 24 heures, nous pouvons surveiller les événements antérieurs à la maturation progénitrices et la migration neuronale par le co-marquage avec des marqueurs de progéniteurs apicale (ie, Pax6;. Fig 2A), les progéniteurs basale (ie, Tbr2; . figure 2B) et les neurones du néocortex postmitotiques (ie, TBR1;. figure 2C).

Diencéphale

L'hypothalamus est à la base ventrale de la SNC et fonctionne comme une passerelle entre le système endocrinien et système nerveux autonome. Pendant le développement, les noyaux multiples qui composent l'hypothalamus matures différencier une zone ancêtre commun que les lignes de la région ventrale-la plupart du diencéphale embryonnaire. Actuellement, les voies moléculaires qui régulent la prolifération des cellules progénitrices, la différenciation neuronale et la formation de noyaux hypothalamiques sont mal comprises. Nous avons utilisé électroporation in utero pour cibler l'expression du gène rapporteur de la diencéphale embryonnaire par l'injection d'ADN dans le ventricule 3 ^ème E12 embryos.We ensuite suivie de la distribution de la GFP dans la différenciation des neurones à l'E14. Avec cette méthodologie, nous avons réussi à cibler expression de la GFP au thalamus, pré-thalamus et l'hypothalamus (figure 3A). L'analyse des coupes coronales révèle que nous avons réussi à cibler expression de la GFP dans les cellules progénitrices qui bordent la zone ventriculaire du 3 ^ème ventricule et les neurones qui migrent vers la zone du manteau pour former des noyaux (figure 3B)

Rétine

La rétine est la couche de neurones de l'œil, responsable de la conversion des photons de lumière en impulsions électriques transmises au cerveau. Elle se développe comme un outpocketing du diencéphale embryonnaire, et par conséquent, est dérivé du tube neural. La rétine neurale se développe à partir d'un compartiment apical progénitrices qui se trouve à côté de l'espace sous-rétinien, une cavité qui sépare l'œil du mésenchyme tête. Cibler les constructions d'ADN aux progéniteurs rétiniens exige donc que les injections sont faites dans une petite zone cible. Utiliser micromanipulateurs, nous avons réussi à cibler avec succès cette petite zone dans les embryons à partir d'E13.5 E15.5 (représentée est E15.5 électroporations du PCIC avec le journaliste mCherry; Fig 4).. Si électroporées rétine sont examinés 24 heures après la transfection, on observe que la plupart des cellules ⁺ mCherry sont situés dans la couche externe neuroblastes (onbl), où sont situés les progéniteurs divisant, et non dans la couche de cellules ganglionnaires de la rétine (GCL; l'image en médaillon), où les cellules postmitotiques localiser.

Figure 1. Introduction à l'électroporation in utero mise en place et la méthodologie. (A) Les éléments clés de la mise en place chirurgicale comprennent un Eppendorf FemtoJet microinjecteur (1), micromanipulateur Narishige avec porte-aiguille (2), steromicroscope Leica (3), éclairage à fibres optiques système (4), ECM 830 Système Place électroporation vague avec des électrodes (5) et un coussin chauffant (6). (A ') L'animal est anesthésié à l'aide d'un vaporisateur pour l'isoflurane anesthésique. (B, B ') Brièvement, après l'anesthésie, les cornes utérines sont exposés et de l'ADN mélangé de vert rapide est injecté dans le cerveau embryonnaire vésicules. Une injection de succès est visualisée par le suivi du jeûne colorant vert (B '). (C, C ') Après l'ADN est injecté avec succès, les électrodes sont placées à aubes de chaque côté de l'utérus, positioning l'embryon ainsi que l'ADN va être tiré vers le pôle positif dans la région du cerveau de son choix. (D, D ') Une fois que tous les embryons sont injectés désiré, l'utérus est repoussé dans l'abdomen (D), le péritoine est suturé, et la peau est agrafée (D'). La femme enceinte est alors autorisé à récupérer et les chiots sont collectés par électroporation dans les points de temps désiré.

Figure 2. Exemple représentatif d'électroporation télencéphalique dorsale. (AC) Microphotographie d'une coupe coronale à travers un télencéphale E13.5 E12.5 dorsale électroporation à des pCIG2. Électroporées GFP ⁺ cellules sont analysés pour leur expression de marqueurs de progéniteurs apicale (Pax6 ^+, rouge, A), les progéniteurs basale (Tbr2 ^+, rouge, B) et les neurones post-mitotiques (TBR1 ^+, rouge, C). cp, plaque corticale; SVZ, zone sous-ventriculaire, vz; zone ventriculaire.

Figure 3. Exemple représentatif d'électroporation diencéphalique. (A) Une vue ventrale d'un cerveau E14 qui a été électroporation à E12 avec pCIG2. GFP épifluorescence est visible dans le thalamus, pré-thalamus et l'hypothalamus, ce qui démontre la propagation de la pCIG2 microinjectés plasmide dans le 3 ^ème ventricule. (B) Microphotographie de coupe coronale du cerveau grâce à une électroporation, montrant la migration de cellules GFP ⁺ hors de la zone ventriculaire et dans la zone du manteau, où noyaux hypothalamiques va se former. 3V, troisième ventricule; T, le thalamus, Hy, l'hypothalamus, MZ, le manteau zone; Tel, télencéphale; Pret, prethalamus; vz, zone ventriculaire.

Figure 4. Exemple représentatif d'électroporation de la rétine. Coupe coronale à travers un oeil E16.5 électroporation avec PCIC à E15.5 montrant l'accumulation de cellules + mCherry dans la couche externe neuroblastes et non pas dans Brn3b ⁺ cellules ganglionnaires de la rétine dans la couche des cellules ganglionnaires. L'encart est une image plus fort grossissement de la zone encadrée. GCL, couche des cellules ganglionnaires rétiniennes; le, lentille; onbl, la couche externe neuroblastes; re, de la rétine.

Discussion

In utero électroporation peut être utilisée pour analyser une grande variété de processus de développement. Par exemple, la transfection de gènes rapporteurs tels que la GFP, mCherry ou la phosphatase alcaline peut être utilisé pour effectuer le traçage et la lignée des expériences de la migration neuronale. Alternativement, la recombinase Cre peut être transitoirement exprimé d'éliminer sélectivement un allèle floxés dans un espace et / ou temporellement contrôlée manière. Par ailleurs, shRNA ou dominant négatif peut être construit à l'électroporation en fonction des gènes knockdown cible. Enfin, la surexpression ciblée ou misexpression de gènes clés dans les deux de type sauvage et / ou des lignées de souris génétiquement mutant peut être utilisé pour étudier les décisions du destin cellulaire. Le débit élevé de ce dosage est essentiel car il permet de tester de nombreuses combinaisons de facteurs dans un temps très court. Une note de prudence est que cette procédure ne provoquent des changements dans l'expression des gènes dans les cellules qui tapissent le site pénétration de l'aiguille (à savoir, une blessure gènes de réponse régulée positivement dans la plaie; comme observé par nous et les autres ^13). Il est donc recommandé de se concentrer sur les cellules par électroporation en dehors du site de la plaie. En outre, les taux de survie des embryons est faible lors du premier apprentissage de cette technique mais rapidement lieu à> 95% avec la pratique. À ce jour, nous avons utilisé avec succès dans les technologies de l'électroporation in utero à identifier les gènes régulés par les facteurs de transcription bHLH proneural dans le télencéphale ^4. Nous avons également validé l'utilisation de cette technique pour l'analyse des télencéphalique éléments cis-régulateurs ^3.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fine scissors	Surgical Tools	Fine Science Tools	14078-10
Iris scissors, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	14061-10
Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder	Surgical Tools	Fine Science Tools	12002-12
Ring forceps, 9mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11103-09
Eye dressing Forcep	Surgical Tools	Fine Science Tools	11051-10
Dumont #7 DMX Forcep	Surgical Tools	Fine Science Tools	11271-30
Dumont #5 DMX Forcep	Surgical Tools	Fine Science Tools	11251-30
Tissue forcep-Adson	Surgical Tools	Fine Science Tools	11027-12
Reflex Clip Applier	Surgical Tools	World Precision Instruments, Inc.	500343
Perforated Spoon, 15 mm diameter	Surgical Tools	Fine Science Tools	10370-18
Autoclip Remover	Surgical Tools	Mikron	427637
Silk Black Braided Suture	Surgical Tools	Ethicon Inc.	K871
Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips	Surgical Tools	World Precision Instruments, Inc.	500346
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Instruments	VWR international	58018-004
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode	Instruments	Protech International, Inc.	CUY650P5
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode	Instruments	Protech International, Inc.	CUY650P7
Eppendorf Femtojet Microinjector	Instruments	VWR international	CA62111-488
Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector	Instruments	VWR international	CAACCESS (misc.)
Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH	Instruments	VWR international	CA33995-534CPN-952-118
Sutter P97 Micropipet Puller	Instruments	Sutter Instrument Co.	P-97
Micropipettes -– Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length	Instruments	Sutter Instrument Co.	BF100-78-10
3-Axis Coarse Manipulator	Instruments	Carl Zeiss, Inc.	M-152
Magnetic Holding Device for micromanipulator	Instruments	World Precision Instruments, Inc.	M1
Steel Base Plate for micromanipulator	Instruments	World Precision Instruments, Inc.	5052
Micropipette Holder	Instruments	World Precision Instruments, Inc.	MPH3
Micropipette Handle	Instruments	World Precision Instruments, Inc.	5444
Stereomicroscope	Instruments	Leica Microsystems	MZ6
Vaporizer for isoflurane anesthetic	Instruments	Porter Instruments Company	MODEL 100-F
Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools	Surgical Reagents	Metrex Research Corporation	10-8100
Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing	Surgical Reagents	Sigma-Aldrich	G1264
Germex for sterilizing surgical tools	Surgical Reagents	Vétoquinol	DIN# 00141569
BNP ophthalmic ointment	Surgical Reagents	Vétoquinol	DIN# 00516414
Nair®	Surgical Reagents	Church & Dwight Co.	commercially available
Stanhexidine 4% w/v skin cleaner	Surgical Reagents	Omega Laboratories Inc.	01938983
Buprenorphine (Temgesic) analgesic	Surgical Reagents	Merck & Co.	531-535
Sulpha "25" sulphamethazine oral antibiotic	Surgical Reagents	Professional Veterinary Laboratories	DIN# 00308218
Lactated Ringer Solution	Surgical Reagents	Baxter Internationl Inc.	DIN# 0061085
Saline -– 0.9% sodium chloride	Surgical Reagents	B. Braun Medical	DIN# 01924303
Inhalation Anesthetic -– Isoflurane USP	Surgical Reagents	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN# 02237518
Fast Green FCF	Surgical Reagents	Sigma-Aldrich	F7252