Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar'da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Published: June 23, 2011 doi: 10.3791/2957

Summary

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Abstract

Birden fazla gelişimsel yolların aydınlatılmasında yol açan gen ekspresyonu manipüle etme yeteneği, günümüz deneysel embriyoloji taşıdır. Birçok güçlü ve iyi kurulmuş transgenik teknolojiler, hem kaybı ve fonksiyon-kazanç modellerinin üretimi için izin, farenin gen ekspresyon düzeyleri işlemek için kullanılabilir. Ancak, transgenik fare üretimi hem masraflı ve zaman alıcı. Bu nedenle, gen manipülasyonunun Alternatif yöntemler yaygın olarak aranmış var. Uterus içinde elektroporasyon gen teslim başarıyla 3,4 adapte olduğunu canlı fare embriyoları 1,2 içine bir yöntemdir. Bu büyük ölçüde, yaygın olarak civciv 5 kullanılan ovo elektroporasyon teknolojileri alanında başarısı üzerine dayanır. Kısaca, DNA, hücre içine DNA alımı için izin gelişmekte olan beyin ve bir elektrik akımı nedenleri, hücre zarlarında geçici gözeneklerin oluşumunu uygulama açık ventriküller içine enjekte edilir. Bizim ellerde, genç embriyoların hedefleme ultrason kılavuzluğunda mikroenjeksiyon protokol, daha önce 6 açıklanan gerektirecektir embriyolar verimli, erken embriyonik gün (E) 11,5 olarak electroporated olabilir. Tersine, E15.5 parietal ve frontal kemik farklılaşma, beyin içine mikroenjeksiyon engellemektedir başlama nedeniyle kolayca electroporate son aşamasında,. Buna karşılık, retina embriyogenezisin sonuna kadar erişilebilir. Embriyolar embriyonik ya da erken doğum sonrası dönemi boyunca, herhangi bir zaman noktasında toplanabilir. Enjeksiyon bir muhabir inşa transfekte hücreler belirlenmesini kolaylaştırır.

Bugüne kadar, utero elektroporasyon en yaygın neokortikal geliştirme 1,2,3,4 analizi için kullanılır olmuştur. Daha yeni çalışmalarda embriyonik retina 7,8,9 ve 10,11,12 talamus hedef var. Burada, bir embriyonik MSS farklı etki hedef kolayca adapte edilebilir utero elektroporasyon protokolde güncellenmiştir sunuyoruz. Biz bu tekniği kullanarak, embriyonik telencephalon, diensefalon ve retina hedef olduğunu kanıtlar. Ilk lateral ventriküller içine DNA ifade yapıları tanıtmak için bu tekniğin kullanımını gösteren, bize embriyonik telencephalon progenitör olgunlaşma, farklılaşma ve göç izlemenize olanak veren Temsilcisi sonuçları sunulmuştur. Ayrıca göç güzergâhları takip edilmesi diensefalik çekirdekleri nöronların ayırt izin vererek, bu teknik, 3. ventrikül çevresindeki diensefalik toprakları DNA hedef kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Son olarak, biz, bize retina gelişimi üzerinde gen ekspresyonu manipüle etkilerini analiz etmek izin veren, mikromanipülatörler kullanımı bize doğru subretinal alan da dahil olmak üzere küçük hedef alanlar, içine DNA yapıları tanıtmak için izin verdiğini göstermektedir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Set-up

  1. Set-up cerrahi alanında Şek. 1A, A '. Set-up anahtar bileşenleri, iğne tutucu, Leica steromicroscope, fiber optik aydınlatma sistemi, elektrotlar ile ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistem, ısıtma yastığı ve isofluran anestetik bir buharlaştırıcı Narishige mikromanipülatör bir Eppendorf FemtoJet mikroenjektör içerir.
  2. Tüm aletleri, cerrahi aletler sonicating için Metriclean2 Düşük köpük çözüm kullanarak Bransonic Ultrasonik Temizleyici ile temizleyin. Otoklavlayarak araçları sterilize edin. Steril araçları sonra Germex tutulur.
  3. Şırınga ılık steril serum fizyolojik ve steril Laktatlı Ringer çözeltisi ile hazırlayın.

2. Anestezi

  1. Küçük (12cm x 20cm) anestezi kamara içinde Yeri hayvan. Buharlaştırıcı kullanarak, 1L/min (Şekil 1A, A ')% 5 isofluran anestetik ve oksijen sağlar. Özellikle, bir atma sistemi kullanarak izofluran egzoz toplamak için önemlidir.
  2. Hayvan solunum derin ve düzenli hale odasından çıkarın. , Burun pinching ve göz kırpma refleks testleri, tam bir anestezi sağlamak için kullanılır.
  3. Bir ısıtma yastığı (37 ° C) üst sırtını hamile fare yerleştirin. % 70 etanol ile silerek ilk ısıtma yastığı sterilize edilmiştir ve daha sonra steril lintless bir gazlı bez ile kaplıdır. Bir solunum tüpü ve maske (% 2.25) ameliyat sırasında izofluran sunmak aparat kullanın.
  4. Buprenorfin (0.1mg/kg vücut ağırlığı) subkütan boynun ense deri altına enjekte edilir.
  5. Derin ve düzenli nefes almayı için ameliyat boyunca hayvan izleyin. Hayvan, gasp, basık veya hızlı nefes olmamalıdır. Sığ, hızlı nefes alıp verme, hafif anestezi bir işareti olabilir, ve izofluran akışının artırılması gerekmektedir. Hayvan gasp başlarsa, izofluran akışını azaltır. Solunum durması durumunda, izofluran kapatın ve hayvan iyileşene kadar oksijen akışını artırmak. Daha düşük bir konsantrasyonda izofluran yeniden başlatın.

3. Cerrahi Hayvan Hazırlama

  1. Teyp, ısıtma yastığı hayvan ön ayakları ve künt forseps ile ayağın arka kısma bir retraksiyon yanıt için tekrar kontrol edin.
  2. Kullanarak, steril bir pamuk uçlu çubukla, karın üzerine tüy dökücü krem ​​kalın bir tabaka (yani, Nair) yayıldı. Firma vuruş, underfur tamamen kaplanmış sağlar. Steril bir epilasyon için temiz bir bez ile aralıklı kontrol, ortalama üç dakika bekletin. Steril bir gazlı bez steril su ile ıslatın ve tüm izlerini gitmiş kadar karın silin. Su klorheksidin (yani, Stanhexidine) cildin daha temiz ve daha tekrarlayın. Karın, temiz, steril gazlı bez ile kurulayın.
  3. Kesi yeri, daha steril su ile takip bir klorheksidin (yani, Stanhexidine) ile sterilize edin. Karın, temiz, steril gazlı bez ile kurulayın. % 70 etanol ve temiz, steril bir pamuklu çubukla kullanarak bu adımı yineleyin.
  4. Steril bir gazlı bezle rahim boynuzları ameliyat sırasında çekilmiş olacak ortasında bir yarık ile karın üzerine yerleştirin.

4. İnsizyon ve Rahim Horns maruz kalması

  1. Rahim boynuzları göstermek için, ilk, orta hatta cilt altında soluk bir çizgi olarak linea alba bulun. Forseps kullanarak, karın duvarı uzak deri çekin ve cilt makas (yaklaşık 1 cm uzunluğunda) ile orta karın aşağıya doğru küçük, düz bir kesi kesmek.
  2. Kavisli bir forseps ve makas kullanarak, periton işlemi tekrarlayın.
  3. Üzerinde küçük bir kesi dikey yarık ile steril gazlı bez koyun ve ısınmış steril tuzlu su ile nemlendirin.
  4. Kesi forseps Slayt ve rahim bulun. Uterin boynuz çıkarırken forseps ile açık kesi tutun.
  5. Dikkatli bir şekilde birinci ve ikinci görünen embriyoları arasında rahim kavramak ve embriyolar gazlı bez üzerine çekin. Steril gazlı bez üzerine yerleştirerek uterus boynuzu her iki tarafını kaldırın ve herhangi bir rezorbsiyonlar ya da "sağlıksız" (örneğin daha küçük vücut büyüklüğü) embriyolar belirterek, embriyo sayısını. Serum fizyolojik ile rahim boynuzları Islak ve dikkatli bir rahim karın içine yarım dönüş.

5. Ventrikül içine DNA enjeksiyonu

  1. Cerrahi iğneler, kılcal damarları ile borosilikat mikropipetler kullanarak Sutter Flaming Mikropipet Çektirme hazırlanır (Program: ısı = 750, = 30 çekin, Vel = 90, Zaman = 150) . Iğne ucu steril bir neşter bıçak kullanarak, 45 derecelik bir açıyla yavaşça kazınıyor.
  2. Iğne yüklemek için, Pasteur pipetler bir alev altında dar bir çap çekti. % 0.01 metil yeşil karışık 3mg/ml endotoksin içermeyen DNA ~ 10 ul (metil yeşil boya DNA enjeksiyonları görüntülenebilmekte sağlar unutmayın). Ağızlık çizmek için yükleme pipet bağlı Dolu iğne daha sonra bir mikromanipülatör stand üzerine monte edilir ve enjektör FemtoJet'te bağlı.
  3. Yumurtalığa yakın embriyo ile başlayarak, dairesel forsepsenjeksiyonları bir rostral kaudal yönde gerçekleşmesini sağlayan, "yüzü ileri konumlandırılmış böylece hafifçe desidua içinde embriyo açmak için kullanılır. Aydınlatma için fiber optik ışık kaynağı, rostral bölgelerde büyük lateral ventriküller (Şekil 1B, B ') ile çevrili olan embriyonik beyin, orta hat görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılır.
  4. Embriyo dairesel forseps kullanarak pozisyonda tutulur. Beyin girdiği açısı yaklaşık 45 derece olacak şekilde iğne rahim yukarıda konumlandırılmış. Mikromanipülatör, hızlı ve kararlı hareket kullanarak, iğne ucu rahim duvarına ve embriyonun lateral ventrikül içine sokulur. Enjeksiyonlar lateral ventriküller, 3. ventrikül veya sırasıyla telencephalon diensefalon ve retina, hedef subretinal alana doğru yönlendirilir. DNA lateral ventriküller içine enjekte 3. ventrikül içine akacaktır böyle erken embriyonik aşamada embriyonik beyin veziküller açık olduğunu unutmayın.
  5. Eppendorf FemtoJet mikroenjektör kullanarak endotoksin DNA (1-3 mcL) enjekte etmek için ayak pedalına basın. Başarılı bir enjeksiyon metil yeşil boya embriyonik beyin ventriküller boyunca yayarak kolayca görüntülenmiştir. Iğne kırılmaları önlemek için geri çekerek daha sonra yavaş yavaş kaldırılır.

6. Elektroporasyon

  1. Enjekte embriyonun rahim içinde (hala), annenin karın ve ısınmış tuzlu su ile iyice ıslak örten steril gazlı bez yerleştirilir. Lütfen dikkat ** membran yüzeyine tuzlu su yanı sıra verimli bir elektrik akımının geçmesine izin esastır.
  2. DNA enjeksiyonu takiben rahim kavrama GenePaddle elektrotlar kullanılır. 40-50V ve 50 ms beş kare elektrik darbeleri ECM8300 BTX elektroporasyon sistemi (Şekil 1C, C ') kullanarak saniyede bir darbe hızında teslim edilir.
  3. Enjekte / electroporated embriyo koruyucu ıslak bir gazlı bez ile örtün ve bir sonraki embriyo devam edin.
  4. İstenen tüm embriyoların enjeksiyon / elektroporasyon tamamlanmasından sonra dikkatli bir şekilde karın (Şekil 1D) rahim boynuzları geri itin.
  5. Diğer uterin horn dikkatlice çıkarın ve yumurtalık yakın embriyo yeniden başlar.

7. Sütür ve Zımbalama

  1. Tüm embriyolar geri rahim içinde, karın boşluğuna ~ 2-3 ml ılık tuzlu su ekleyin.
  2. Yarayı kapatmak için gazlı bez karın kaldırılması ve periton iki tespit başlar. Periton sütür örgülü siyah ipek satırını kullanarak başlayın. Bu genellikle zayıf ve ameliyat sonrası kanama ve enfeksiyona yol açabilir, bu işlem için sütür kullanmak için tavsiye edilmez. Sternumun en yakın periton hattı Çapa ve çapa uzak dikiş geçin. Tüm dikişler sıkı ve altta yatan organ veya cilt yanlışlıkla periton içine dikili olmuştur olun. Klip ve kalan dikiş hattı atın.
  3. Forseps ile dikiş hattı üzerinden çekin cilt kapalı. 9 mm Reflex ™ deri kapatma zımba, zımba dikiş hattı altında umurumda değil alarak, cilt üzerinde yara klip, ya da çok sıkı cilt çekin. Tercih edilen yöntem, forseps ile vücuttan deri ve uzak tutun ve zımba aracı ile 90 derecelik bir açıyla gelir. Yara kapanana kadar devam edin (yaklaşık üç zımba). Bittiği zaman, zımba yavaşça dikiş aracı (Şekil 1D) ile birlikte basarak sıkı olduğundan emin olun.

8. Post-cerrahi Bakımı

  1. Anestezik kurtarma izlemek için, kadın midesinin üzerine çevirin ve kapalı izofluran açmak. Solunum cihazı içindeki hayvanın yüz tutulması, anestezi kurtarma yardımcı olmak için% 3 oksijen açmak. Hayvan hipotermi önlemek için ısıtma yastığı üstüne temiz, kuru bir gazlı bez konulmalıdır.
  2. Hayvan sersemlemiş olsa da, hayvanın boynuna cilt altında subkutan 2 ml Ringer solüsyonu enjekte edilir.
  3. Hayvan canlandırmak amacıyla birkaç dakika ve ısınma gazlı bez için oksijen akışı altında hayvan tutarak devam edin. Normal bir solunum paterni döner hayvan hareketinin Kısa hamlelerle dikkat edilmelidir. Hayvan bilinçli ve uyanık görünene kadar birkaç dakika süreyle uyun.
  4. Kadın Gentamisin sprey ile karın Sprey ve hayvan steril bir gazlı bezle sarın.
  5. Hayvan otoklavlanmış yatak ve karton konut ile steril bir kafes içine aktarın.
  6. Su şişeleri iyice temizlenir, steril ve steril su ile dolu olmalıdır. Su için 500 mL, 2 mL sulfametazin antibiyotik (% 25 hisse senedi) ekleyin.
  7. 0.05 mg / kg buprenorfin subkutan sabah cerrahi sonrası yönetme.
  8. Kadın ameliyat sonrası ilk 24 saat için yakından izleyin. Hayvanların 24 saat daha uzun süre tutulur, kadınlarda yeni ster taşınır2 gün ile kafesleri.

9 - Temsilcisi Sonuçlar

Neokorteks

Neokorteks, görsel ve sensorimotor işleme ve daha yüksek bilişsel işlevler sorumlu CNS bölgedir. Sırasıyla dorsal ve ventral telencephalon türetilmiştir glutamaterjik projeksiyon nöronları ve GABAerjik internöronlar oluşur. Neokortikal gelişiminde farklı genlerin rolleri ele almak için, ya misexpress utero elektroporasyon kullanımı ya da dorsal veya ventral telencephalon 1,3,4 farklı genler ifade bloğu (yani, shRNA yapıları kullanımı yoluyla). Embriyonik telencephalon genler misexpress için, biz, bir CMV βactin organizatörü geliştirici ve bir iç ribozom giriş yeri (IRES) gelişmiş yeşil flüoresan protein içeren bir bicistronic ifade vektör (pCIG2) kullanımı (EGFP; pCIG2) kaset, transfekte izin hücreleri Epifloresans (Şekil 2A-C) tarafından tespit edilmesi. Biz E11.5 E15.5 (Şekil 2 gösterildiği gibi veri E12.5) telencephalon ifade yapıları tanıtmak için bu teknolojiyi kullandı. Embriyolar birkaç gün sonrası elektroporasyon geliştirmek izin vererek, GFP etiketli atalarıdır farklılaşma ve göç takip edebiliyoruz. Farklılaşması devam ederken, 3 gün, post-elektroporasyon GFP + hücrelerin ayırt etmek ve ventriküler zon (vz), subventricular bölgesi (SVZ) ve ara bölge (iz) ve kortikal plaka (cp; Şekil 2C) içine dışına göç . , Bazal atalarıdır (yani Tbr2; E12.5 az electroporated 24 saat sonra beyinleri analiz yapıyorsanız, biz progenitör olgunlaşması ve nöronal göç apikal atalarıdır belirteçleri ile birlikte-etiketleme (Şekil 2A, yani Pax6) tarafından önceki olaylar izleyebilir; Şekil 2B) ve postmitotic neokortikal nöronların (yani, Tbr1 Şekil 2C).

Diencephalon

Hipotalamus, endokrin ve otonom sinir sistemi arasında bir ağ geçidi olarak merkezi sinir sistemi ve işlevleri ventral dibinde yatıyor. Gelişimi sırasında, olgun hipotalamus makyaj çoklu çekirdeklerin ortak bir progenitör bölgesi ayırt embriyonik diensefalon ventral en bölge bu satırları. Şu anda, progenitör hücre çoğalması, nöronal farklılaşma ve hipotalamik çekirdeğinin oluşumunu düzenleyen moleküler yollar tam olarak anlaşılamamıştır. E12 embryos.We 3. ventrikül içine DNA enjekte edilerek embriyonik diensefalon muhabiri gen ekspresyonu hedef utero elektroporasyon kullanılan E14 nöronların ayırt GFP dağılımı izledi. Bu metodoloji ile, başarıyla talamus, pre-talamus ve hipotalamus (Şekil 3A), GFP ifade hedeflediğiniz. Koronal bölümleri Analizi başarıyla GFP ifade progenitör hücrelerin hedef olduğunu ortaya koymaktadır 3. ventrikül ve nöronların çekirdekleri oluşturmak için manto bölge dışına göç hattı ventriküler bölgesi (Şekil 3B)

Retina

Retina gözün sinir tabakası, beyne iletilen elektrik impulsları ışık fotonları dönüştürmek için sorumludur. Bu embriyonik diensefalon outpocketing olarak gelişir ve bu nedenle, nöral tüp türetilmiştir. Nöral retina subretinal alan, baş mezenşimin göz ayıran boşluğuna bitişik yatıyor apikal progenitör bölmesi geliştirir. Bu nedenle retina atalarıdır DNA yapıları Hedefleme küçük bir hedef alana bu enjeksiyonları yapılır gerektirir. Mikromanipülatörler kullanarak, başarılı bir şekilde (Şekil 4 gösterildiği mCherry muhabiri ile PCIC E15.5 electroporations) E13.5 E15.5 için embriyolar bu küçük bir alanda hedef başardık. ; Electroporated retinae 24 saat sonrası transfeksiyon incelendiğinde ise, en mCherry + hücreleri dış neuroblast bölünmesi atalarıdır bulunmaktadır katmanı (onbl), ve retina ganglion hücre tabakası (inset görüntü GCL) bulunmaktadır gözlemlemek postmitotic hücreleri yerelleştirilmesine.

Şekil 1
Şekil 1. Utero elektroporasyon set-up ve metodoloji Giriş (A), cerrahi set-up anahtar bileşenleri bir Eppendorf FemtoJet mikroenjektör (1), iğne tutucu (2) Narishige mikromanipülatör, Leica steromicroscope (3), fiber optik aydınlatma sistemi (4), elektrotlar (5) ve ısıtma yastığı (6) ile ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi. (A ') hayvan isofluran anestetik bir buharlaştırıcı kullanılarak anestezi. (B, B ') Kısaca, anestezi sonra, rahim boynuzları maruz kalan ve hızlı yeşil karışık DNA embriyonik beyin veziküller içine enjekte edilir. Başarılı bir enjeksiyon hızlı yeşil boya (B ') takip ederek görüntülenmiştir. DNA başarıyla enjekte edildikten sonra (C, C '), rahim, positi iki tarafında, kürek elektrotlar yerleştirilirDNA seçim beyin bölgeye pozitif kutbu doğru çekilecektir, böylece embriyo oning. (D, D ') istenilen tüm embriyolar enjekte sonra, rahim karın (D) içine itilir, periton sütüre edilir ve deri (D zımbalanmalı'). Hamile kadın daha sonra kurtarmak için izin verilir ve electroporated yavrular istenilen zaman noktalarda toplanmaktadır.

Şekil 2
Şekil 2. PCIG2 ile E12.5 electroporated bir E13.5 dorsal telencephalon aracılığıyla koronal bölümünün dorsal telencephalic elektroporasyon Temsilcisi örnek (AC) yüzey elde. Electroporated GFP + hücreler apikal atalarıdır belirteçleri ifade analiz (Pax6 +, kırmızı, A), bazal atalarıdır (Tbr2 +, kırmızı, B) ve postmitotic nöron (Tbr1 +, kırmızı, C). cp, kortikal plaka; SVZ, subventricular bölge, vz, ventriküler bölge.

Şekil 3
Şekil 3. Diensefalik elektroporasyon Temsilcisi örnek (A) pCIG2 ile E12 electroporated olmuştur, E14 beynin ventral görünüm. GFP Epifloresans talamus görünür, ön-talamus ve hipotalamus, 3. ventrikül boyunca plazmid microinjected pCIG2 yayılmasını gösteren. Electroporated beyin ile koronal bölümünde (B) yüzey elde GFP göç gösteren + ventrikül bölgesi ve hipotalamik çekirdekleri oluşturacak manto bölgesi, içine hücreleri. 3V, üçüncü ventrikül; T, talamus; Hy, hipotalamus, mz, manto bölge; Telefon, telencephalon; Pret, prethalamus; vz, ventriküler dilimi.

Şekil 4
Şekil 4. Retina elektroporasyon Temsilcisi örneğidir. MCherry + hücrelerin dış neuroblast tabakası birikimi gösteren E15.5 PCIC ile electroporated bir E16.5 göz ile koronal bölümünde değil Brn3b + retina ganglion hücrelerinin ganglion hücre tabakası. Içerlek kutulu alanda daha yüksek bir büyütme görüntü. GCL, retina ganglion hücre tabakası, le, lens; onbl, dış neuroblast katmanı; yeniden, retina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In utero elektroporasyon, gelişimsel süreçlerini geniş bir yelpazede analiz etmek için kullanılır . Örneğin, GFP, mCherry veya alkali fosfataz gibi muhabir genlerin transfeksiyon soy izleme ve nöronal göç deneyler yapmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, Cre recombinase geçici seçici floxed allel bir mekansal ve / veya geçici olarak kontrollü bir şekilde ortadan kaldırmak için ifade edilebilir. Ayrıca, shRNA veya dominant negatif yapıları demonte hedef genin fonksiyonu electroporated olabilir. Son olarak, vahşi tip ve / veya genetik mutant fare hatları hedeflenen aşırı ekspresyonu veya anahtar genlerin misexpression hücre kaderi kararlarını incelemek için kullanılabilir. Bu testin yüksek kapasiteli, çok kısa bir süre içinde birçok faktörlerin kombinasyonları test etmek için izin verir gibi kritik öneme sahiptir. Bir uyarı notu bu yordamı hücrelerdeki gen ekspresyonu neden olduğunu, bu hat iğne giriş yeri (yani, yara upregüle yaralanma yanıt genleri; tarafından gözlemlenen ve diğerleri 13) . Böylece yara yerinin dışında electroporated hücreleri üzerinde odaklanmak tavsiye edilir. Buna ek olarak, bu tekniği ilk olarak öğrenme, embriyonik sağkalım oranları düşük ama hızlı bir şekilde uygulama ile>% 95 artış. Bugüne kadar, başarıyla telencephalon 4 proneural bHLH transkripsiyon faktörleri tarafından düzenlenen genleri tanımlamak için utero elektroporasyon teknolojiler kullanmış. Biz de cis-düzenleyici unsurlar telencephalic 3 analizi için bu tekniğin kullanımını onaylamıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar utero elektroporasyon teknoloji CS laboratuar kurulması Eva Hadzimova Pierre Mattar ve Christopher Kovaç ilk çalışma için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR) hibe (MOP 44.094) ve CS ve bir Alberta Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı Hibe DMK Takım Grant (00.933-000) Gelişmekte olan CIHR / Hazırlık Mücadele Körlük (FFB) tarafından finanse edildi. RD CIHR Kanada Umut Bursu tarafından desteklenen, RC FFB Bursu tarafından desteklenen ve LML Genetik CIHR Eğitim Grant ve Çocuk Gelişimi tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fine scissors Surgical Tools Fine Science Tools 14078-10
Iris scissors, curved Surgical Tools Fine Science Tools 14061-10
Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder Surgical Tools Fine Science Tools 12002-12
Ring forceps, 9mm Surgical Tools Fine Science Tools 11103-09
Eye dressing Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11051-10
Dumont #7 DMX Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11271-30
Dumont #5 DMX Forcep Surgical Tools Fine Science Tools 11251-30
Tissue forcep-Adson Surgical Tools Fine Science Tools 11027-12
Reflex Clip Applier Surgical Tools World Precision Instruments, Inc. 500343
Perforated Spoon, 15 mm diameter Surgical Tools Fine Science Tools 10370-18
Autoclip Remover Surgical Tools Mikron 427637
Silk Black Braided Suture Surgical Tools Ethicon Inc. K871
Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips Surgical Tools World Precision Instruments, Inc. 500346
ECM 830 Square Wave Electroporation System Instruments VWR international 58018-004
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode Instruments Protech International, Inc. CUY650P5
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode Instruments Protech International, Inc. CUY650P7
Eppendorf Femtojet Microinjector Instruments VWR international CA62111-488
Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector Instruments VWR international CAACCESS (misc.)
Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH Instruments VWR international CA33995-534CPN-952-118
Sutter P97 Micropipet Puller Instruments Sutter Instrument Co. P-97
Micropipettes -– Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length Instruments Sutter Instrument Co. BF100-78-10
3-Axis Coarse Manipulator Instruments Carl Zeiss, Inc. M-152
Magnetic Holding Device for micromanipulator Instruments World Precision Instruments, Inc. M1
Steel Base Plate for micromanipulator Instruments World Precision Instruments, Inc. 5052
Micropipette Holder Instruments World Precision Instruments, Inc. MPH3
Micropipette Handle Instruments World Precision Instruments, Inc. 5444
Stereomicroscope Instruments Leica Microsystems MZ6
Vaporizer for isoflurane anesthetic Instruments Porter Instruments Company MODEL 100-F
Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools Surgical Reagents Metrex Research Corporation 10-8100
Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing Surgical Reagents Sigma-Aldrich G1264
Germex for sterilizing surgical tools Surgical Reagents Vétoquinol DIN# 00141569
BNP ophthalmic ointment Surgical Reagents Vétoquinol DIN# 00516414
Nair® Surgical Reagents Church & Dwight Co. commercially available
Stanhexidine 4% w/v skin cleaner Surgical Reagents Omega Laboratories Inc. 01938983
Buprenorphine (Temgesic) analgesic Surgical Reagents Merck & Co. 531-535
Sulpha "25" sulphamethazine oral antibiotic Surgical Reagents Professional Veterinary Laboratories DIN# 00308218
Lactated Ringer Solution Surgical Reagents Baxter Internationl Inc. DIN# 0061085
Saline -– 0.9% sodium chloride Surgical Reagents B. Braun Medical DIN# 01924303
Inhalation Anesthetic -– Isoflurane USP Surgical Reagents Pharmaceutical Partners of Canada DIN# 02237518
Fast Green FCF Surgical Reagents Sigma-Aldrich F7252

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  2. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  3. Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. 1273-1286 (2007).
  4. Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
  5. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  6. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
  8. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (2009).
  9. Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
  10. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  11. Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  12. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
  13. Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat<em> In Utero</em> Elektroporasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).More

Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter