Summary
Nous démontrons protocoles pour la fabrication et l'automatisation des élastomères polydiméthylsiloxane (PDMS) des tableaux basés sur microvanne qui n'ont pas besoin d'énergie supplémentaire de fermer et de fonctionnalité de photolithographie définie volumes précis. Un parallèle subnanoliter-volume du mélangeur et d'un système de perfusion intégré microfluidique sont présentés.
Abstract
Miniaturisés systèmes microfluidiques fournir des solutions simples et efficaces à faible coût en points-of-care diagnostic et tests à haut débit biomédicale. Contrôle de flux robuste et précis des volumes fluidiques sont deux exigences essentielles pour ces applications. Nous avons développé les puces microfluidiques avec élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) tableaux microvanne que: 1) n'ont pas besoin de source d'énergie supplémentaire pour fermer le chemin fluidique, où le dispositif de chargement est très portable, et 2) permettent de microfabricating profond (jusqu'à 1 mm) canaux avec des flancs verticaux et résultant en des caractéristiques très précises.
Le PDMS microvannes à base de dispositifs constitués de trois couches: une couche contenant des chemins fluidiques fluidique et microchambres de différentes tailles, une couche de contrôle contenant des microcanaux nécessaire pour actionner le chemin fluidique avec microvannes, et un milieu fine membrane de PDMS qui est lié à la commande couche. Couche et les couches de contrôle fluidique sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maîtres résine photosensible, et la fine membrane de PDMS est faite par filature PDMS à des hauteurs spécifiées. La couche de contrôle est lié à la fine membrane de PDMS, après activation de l'oxygène à la fois, et ensuite assemblés avec la couche fluidiques. Les microvannes sont fermés au repos et peut être ouvert par l'application d'une pression négative (par exemple, le vide maison). La fermeture et l'ouverture sont microvanne automatisé via électrovannes commandées par un logiciel informatique.
Ici, nous démontrer deux microvanne basée sur les puces microfluidiques pour deux applications différentes. La première puce permet de stocker et de mélange précis des sous-nanolitre volumes de solutions aqueuses à différents rapports de mélange. La seconde puce permet contrôlé par ordinateur perfusion de cultures de cellules microfluidique.
Les appareils sont faciles à fabriquer et facile à contrôler. En raison de la biocompatibilité des PDMS, ces puces pourraient avoir de vastes applications dans des tests de diagnostic miniaturisés ainsi que les études de base en biologie cellulaire.
Protocol
Conception du dispositif microfluidique en utilisant CorelDraw ou le logiciel AutoCAD
Principe de PDMS microvannes appareils basés sur: Les appareils se composent de trois couches: une couche contenant fluidiques microchambres de différentes tailles, une "couche de contrôle» contenant des microcanaux nécessaire pour actionner le chemin fluidique avec microvannes, et un milieu fine membrane de PDMS qui est lié à la couche de contrôle. Au repos, en raison de la conformité et l'hydrophobicité de PDMS, les opercules (réversible) contre son siège, donc les chambres restent isolés les uns des autres, sans apport d'énergie. Vannes peut être ouvert par l'application d'une pression négative (par exemple, le vide maison), alors la membrane de PDMS dévie vers le bas et se sépare de la surface qui supporte le mur entre les deux chambres fluidiques, reliant ainsi le chemin fluidique. Fermeture de la vanne peut être réalisé en modifiant le paramètre de pression allant du vide à la pression atmosphérique.
Couche fluidique et les schémas couche de contrôle ont été conçus en utilisant CorelDraw ou le logiciel AutoCAD. Masques contenant ces dessins ont été imprimés à haute résolution (8000 à 20000 dpi) sur des films de la transparence grâce à des services commerciaux (CAO / Art, Bandon, OR) (masques non représentée).
La fabrication des maîtres de silicium en utilisant la norme SU-8 photolithographie
- Standard SU-8 méthodes photolithographie ont été utilisés pour créer des SU-8 "maîtres" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) pour la couche microfluidique et la couche de commande de la vanne dans une salle blanche (non montré dans cette vidéo).
- Afin de faciliter la libération, avant de réplication PDMS SU-8, ont été les maîtres silanisé par l'exposition à une vapeur d'un fluorosilane ((tridécafluoro-1, 1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (TFOCS)), dans un jar dessicateur (sans séchage pellets) attaché à une source de vide. La chambre de dessiccateur devra être situé dans une hotte en raison de la nature corrosive des vapeurs TFOCS.
- Placer une petite portion de serviette en papier absorbant à l'intérieur de la chambre de dessiccateur. Ajouter une goutte de TFOCS à l'essuie-tout et d'évacuer l'air de la chambre. Appliquer vide pendant 1 min et éteindre. Fermer le vide et permettre 30 min pour le dépôt. Gardez les maîtres dans des récipients fermés pour une utilisation future.
Réplique de moulage de PDMS par les maîtres
- La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maîtres.
- Bien mélanger PDMS pré-polymère et d'agent de reticulation (10:1 en poids. Ratio), de la bulle dans un dessiccateur pendant 10-15 min jusqu'à ce que des bulles claires.
- Couper tube en silicone en morceaux de 1-2 cm de long. Choisissez la taille appropriée du tuyau selon l'application. Nous utilisons des tubes 1,14 mm ID ici pour une connexion facile à un tuyau OD 1 / 16 pouce plus tard.
- Utilisez Duco ® Ciment au tube de colle sur les régions d'entrée de la SU-8 maître de la couche de contrôle. Soyez prudent de ne pas utiliser trop de colle, comme le tube de silicone est constituée des mêmes éléments que le PDMS, et le tube sera intégré dans le dispositif de PDMS microfluidique, la création de l'air et fluidiques entrées serré / sorties.
- Dans notre dispositif, les régions d'entrée sont conçus sur les masques des deux fluides et les couches de contrôle, mais les entrées tube en silicone ne sont moulés en une seule couche (par exemple, la couche de contrôle) de l'appareil. Pour créer les entrées de la couche fluidique, nous enlever manuellement ou perforer les quelques sections de la membrane qui couvre les régions d'entrée. Par conséquent, après l'alignement et le montage, tous les microcanaux (ceux qui portent des flux ainsi que ceux qui contrôlent les valves) sont accessibles depuis le haut de l'appareil de sorte que la surface inférieure est planaire, permettant l'imagerie de l'appareil sur une scène microscope classique.
- Versez délicatement de-bulles sur les deux PDMS maîtres, autour du tube dans le maître de contrôle de la couche. De la bulle à nouveau dans un dessiccateur. Après de-bullage est complète, la mise en 65 ° C four pendant> 1 heure pour le durcissement.
- Retirer guéri PDMS-couverte maîtres du four.
- Couper les dispositifs individuels des maîtres (chaque maître contient trois appareils identiques) et de se décoller.
- Enlever la colle des régions d'entrée à l'aide d'une aiguille ou une paire de pinces.
- Prenez le contrôle de la couche de PDMS dans la salle blanche.
Mince fabrication des membranes en PDMS
- Comme le montre le principe de l'appareil, la couche intermédiaire se compose d'un ~ 12 um d'épaisseur membrane de PDMS.
- Mélanger 10:01 poids. ratio de PDMS prépolymère / mélange durcisseur avec de l'hexane (3:1 en poids. ratio) par vortex.
- Déplacer dans une salle blanche. (Un environnement sans poussière est essentielle pour assurer que les membranes en PDMS sont exempts de défauts; particules de poussière peut entraîner des membranes contenant des trous et / ou mal lié à la moisissure réplique.)
- Mettez un silanisé 3 pouces de diamètre sur la plaquettele mandrin à vide d'un spinner Solitec. La plaquette doit être silanisé (dérivatisés avec fluorosilane) avant de filer PDMS afin de faciliter la libération de PDMS à partir des surfaces de silicium. Le bol en téflon extérieur du mandrin était enveloppé d'un film plastique pour un nettoyage facile.
- Distribuer 2-3 ml de PDMS / Hexane mélange sur la plaquette en utilisant une aiguille de la seringue de calibre 18 (pour minimiser les bulles).
- Définissez les paramètres spin. Centrifuger à 7000 rpm pendant 30 sec, résultant en un film de PDMS d'épaisseur ~ um 12.
- Chauffer la plaquette à 85 ° C pendant 4 min sur une plaque chauffante pour guérir le film de PDMS.
Multicouche de collage et l'assemblage dispositif de PDMS
- Mettez la couche de contrôle et de la membrane de PDMS dans une chambre de plasma d'oxygène. Tourner sur le plasma pendant 30 sec (pression d'oxygène de 30 psi, le débit de 3 à 5 SCFH, 550W). Apportez la couche de contrôle en contact avec la membrane de PDMS immédiatement (dans les 5 minutes) après activation de l'oxygène. Les paramètres du système, tels que la pression d'oxygène, le débit et la puissance du plasma et du temps de traitement, sont empiriquement configuré selon les différentes applications.
- Attendre 5 min, puis retirez la couche de contrôle de la plaquette avec la membrane.
- Retirer les membranes sur les domaines afin que les deux entrées de commande et les couches fluides sont accessibles par le haut via un tube.
- Aligner la couche de contrôle (avec tubes comme entrées) avec la couche fluidiques (planar) sous un stéréoscope. Parce que les joints PDMS sur le PDMS, pas de liaison permanente est requise.
Contrôlé par ordinateur d'ouverture et de clôture de microvannes PDMS par vide ou sous pression
- Après l'alignement de périphérique et de montage, insérez 1 / 16 po OD (ID pouces 1 / 32) tuyau Tygon dans les criques 1,14 mm ID de silicone et de connecter les entrées aux sources de pression ou les réservoirs fluidiques.
- Pour ouvrir et fermer les vannes, les pressions sont contrôlés par une ligne de vide et d'une ligne de pression d'air relié par deux régulateurs de pression à un tableau de miniatures électrovannes à trois voies.
- Les électrovannes sont raccordées au National Instruments matériel d'acquisition de données via le logiciel Labview.
- Fonctionnement de l'appareil et la déviation de membrane sont visualisés avec une caméra CCD couleur (SPOT RT, instruments de diagnostic, Sterling Heights, Michigan).
Parallèlement mélange de deux colorants de couleurs différentes dans les différents volumes définis nanolitre
Nous démontrons l'opération d'un mélangeur en parallèle qui permet de stocker et de mélange précis des sous-nanolitre volumes de solutions aqueuses à différents rapports de mélange:
- La couche fluidiques contient deux tableaux de microchambres: En tableau A, la taille de la microchambres diminue, à partir de la gauche, à partir de 200 um x 400 um à 200 um x 40 um; A 10 est une chambre de 500 um um x 40 et est utilisé seulement pour connexion fluidique dans Array; à droite de la chambre A 10 est un ensemble de chambres symétriquement croissante dans les tailles. Les chambres en B array sont conçus de telle sorte que le volume ajouté de deux chambres voisines dans des lignes différentes toujours égale à. A 0, A et B 10r 0r 10, B sont conçus comme des témoins respectifs des solutions A et B sans se mélanger.
- La couche de contrôle dispose de deux ensembles de manière indépendante contrôlée par des vannes. Un jeu de vannes V {1} est utilisé pour connecter deux tableaux de chambre avec leurs entrées respectives, tandis qu'une deuxième série de vannes V {2} est utilisé pour connecter chaque paire de chambres dans les deux tableaux.
- Remplissez le microchambres en ouvrant set robinet {1} V pour permettre l'écoulement de deux solutions de colorants à des tableaux A et B, respectivement. Flux des solutions peut être réalisé soit en mains propres ou par le vide en tirant contrôlé avec électrovannes. Si des bulles d'air se forment dans l'microchambres, plus de solution peut être poussé pour éliminer les bulles, ou l'appareil peut être laissé pour quelques minutes et les bulles vont disparaître en raison de la perméabilité à l'air de PDMS.
- Fermez le robinet ensemble {1} V pour isoler chaque chambre dans les deux tableaux.
- Set robinet ouvert {2} V pour permettre au fluide de mélange entre les chambres adjacentes dans des tableaux différents. Le mélange ne prend ~ 1-2 min à remplir pour ces volumes.
- Fermer {2} V pour pousser le fluide vers chaque chambre fluidique et chambres déforment à leur forme originale. Comme les deux tableaux fluidiques sont conçus avec des chambres de différentes tailles 11, 11 différents rapports de mélange sont produits en une seule étape de mélange.
Un système intégré pour la microfluidique contrôlée par ordinateur perfusion de cultures de cellules microfluidique
Nous démontrons un système microfluidique qui est capable de la perfusion automatisée de multiples solutions pour une chambre de culture cellulaire unique. L'entrées sont contrôlées par des microvannes, qui peut être activé dans toute séquence d'entrées simples, des combinaisons différentes, ou tous à la fois. L'appareil est capable de produire des gradients ou des mélanges des différentes solutions.
Cet appareil se compose également de trois couches: une couche fluidique, une couche de contrôle, et un milieu fine membrane de PDMS.
Étapes de fabrication de rechange pour cet appareil:
- Les orifices d'entrée pour les canaux fluidiques et les canaux de contrôle sont «coup de poing" en utilisant un diamètre 1,2 mm Harris Micro-Punch (Ted Pella, Inc.) Les tubes sont reliés aux entrées en utilisant des aiguilles de calibre 18 émoussées qui sont insérés dans le PDMS à travers la couche de contrôle. Cela permet un emballage plus dense de criques que les tubes en silicone. La conformité du PDMS fournit un joint étanche autour des aiguilles d'exécuter efficacement fluide ou pression pneumatique.
- Comme décrit précédemment, le collage de la fine membrane de PDMS à la couche de contrôle est accompli en utilisant l'exposition au plasma d'oxygène.
- La couche fluidique est préparé par moulage réplique avec PDMS pré-polymère et cross-linker à un ratio de 5:1 et partiellement cure pendant 25 minutes à 60 ° C dans un four à convection. À ce stade, la couche partiellement guérie fluidique est encore collante, et pourtant il peut être retiré de la maîtriser.
- La couche fluidique est aligné manuellement au contrôle pré-assemblés et couches de la membrane à l'aide d'un stéréoscope. Le dispositif assemblé est ensuite placé sur une plaque chauffante pendant 5 minutes à 80 º C. Ensuite, les lignes de commande de soupapes sont connectés au contrôleur automatisé et les soupapes sont actionnées jusqu'à ce que la membrane se détache de la couche fluidiques à tous les sièges de soupapes en appliquant un vide. Après "détacher" les vannes, le contrôleur ordinateur est configuré pour le cycle des vannes sur et en dehors tandis que le dispositif est encore guéri sur la plaque chauffante à 80 º C pendant au moins 1 heure.
Les caractéristiques de notre système microfluidique intégré: L'appareil est capable de perfusion automatisée de 16 solutions différentes à une chambre de culture cellulaire en utilisant un schéma valves multiplexés. La conception de canal assure que la résistance de l'ensemble des entrées est équilibré. Notre conception microvanne isole des solutions et des commandes de rinçage par des canaux intégré pour l'élimination rapide de liquide, ce qui limite la contamination croisée. Un mixeur intégré à chevrons peut être activé pour produire des mélanges de différentes entrées. De plus, il ya quatre canaux résistance variant qui peut être activé pour modifier le débit.
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Discussion
Principaux avantages de notre conception microvanne:
- Aucune source d'énergie supplémentaire est nécessaire pour fermer le chemin fluidique, où le dispositif de chargement est très portable, et
- L'appareil peut être construit par des répliques du PDMS photolithographie à motifs SU-8 moules, permettant microfabricating profond (jusqu'à 1 mm) canaux à parois latérales verticales (c'est à dire la hauteur des caractéristiques peuvent être spécifiées indépendamment de leur largeur) et résultant en très caractéristiques précises.
Avantages de la console en parallèle:
- Il est facile à fabriquer et facile à contrôler.
- Les volumes sont définis par photolithographie et, par conséquent, très précis.
- Fluide et les réactifs peuvent être stockés dans le microdispositif pendant plusieurs jours, permettant des dosages hautement portable.
- Notamment, le PDMS est biocompatible, afin que l'appareil a une large applicabilité dans des tests de diagnostic miniaturisés ainsi que dans des essais cellulaires tels que le dépistage de drogue et à base d'enzyme de détection de biomolécules.
Avantages de la chambre de perfusion microfluidiques intégrés:
- Il est capable de la perfusion de solutions automatisées de multiples produits chimiques à une chambre de culture cellulaire unique.
- Les entrées sont contrôlées par des microvannes, qui peut être activé dans toute séquence d'entrées simples, des combinaisons différentes, ou tous à la fois.
- L'appareil est capable de produire des gradients ou des mélanges des différentes solutions.
Principales précautions pour les procédés de fabrication:
- Un environnement sans poussière est essentielle lors de la fabrication membrane de PDMS, ce qui garantit que les membranes sont exempts de défauts.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Institut national d'imagerie biomédicale et d'accorder Bioingénierie # EB003307 et par le Prix National Science Foundation carrière à la FA
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean silicon wafers | Supplies | Silicon Sense Inc. | 3P0110TEST | 3-inch diameter, P/Boron |
| "Master" wafers containing SU-8 patterns | Supplies | Fabricated in house using standard photolithography procedures | ||
| Desiccators (2) | Equipment | VWR international | 24987-048 | One for silanization, one for PDMS de-bubbling. |
| Balance | Equipment | OHAUS Corp. | SC6010 | |
| Oven | Equipment | Sheldon Manufacturing, Inc. | 1330GM | |
| MiniVortexer | Equipment | VWR international | 58816-121 | |
| Spinner | Equipment | Headway Research Inc. | PWM32 | |
| Plasma etcher | Equipment | Plasmatic Systems, Inc. | Plasma Preen II-973 | |
| Hot Plate | Equipment | Torre Pines Scientific | HP30A | |
| Stereoscope | Microscope | Nikon Instruments | TMZ1500 | |
| CCD camera | Equipment | Diagnostic Instruments | SPOT RT | |
| Solenoid valves | Equipment | Lee Company | LHDA0511111H | |
| Data acquisition board | Hardware | National Instruments | PCI 6025E, CB-50LP | |
| LabView | Software | National Instruments | Version 8.0 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Reagent | United Chemical Technologies | T2492 | Silanization must be done in a chemical fume hood. |
| PDMS prepolymer and crosslinker | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Hexane | Reagent | EMD Millipore | HX0295-6 | |
| Color Dyes | Reagent | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | FD&C 110, 135, 150 | Blue #1, Yellow #5, Red #3. |
| 3 ml disposable transfer pipets | Supplies | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Kimwipes | Supplies | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| Weighing boats | Supplies | VWR international | 12577-027 | |
| Tongue depressor | Supplies | Fisher Scientific | 11-700-555 | |
| P100 dishes | Supplies | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.)) | Supplies | Cole-Parmer | 07625-30 | |
| Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in) | Supplies | Cole-Parmer | 06418-02 | |
| Duco Cement | Supplies | Devcon Inc. | 6245 | |
| Razor blade | Tools | VWR international | 55411-050 | |
| Needles | Tools | Fisher Scientific | 0053482 (25 Gauge) | |
| #5 Forceps | Tools | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 50 ml centrifuge tube | Supplies | Fisher Scientific | 05-526B | |
| Seal wrap film | Supplies | AEP Industries Inc. | 0153877 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Supplies | Fisher Scientific | 05-406-16 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Supplies | BD Biosciences | 352097 | |
| Purple nitrile power-free gloves | Supplies | VWR international | 40101-348 | |
| 1.2 mm Harris biopsy punch | Tools | Ted Pella, Inc. | 15074 |
References
- Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays. Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
