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Immunology and Infection

Amplifying और मानक नैदानिक ​​Assays द्वारा जांच की सीमा से नीचे वायरल लोड के साथ एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों में एचआईवी -1 शाही सेना बढ़ाता

Published: September 26, 2011 doi: 10.3791/2960
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3
1The virology Core at the HIV Drug Resistance Program, NCI-Frederick, 2Division of Infectious Diseases, University of Pittsburgh, 3Department of Molecular Biology and Microbiology, Tuffts University

Summary

प्लाज्मा और अनुक्रमण में एचआईवी -1 शाही सेना के स्तर को बढ़ाता एकल एचआईवी -1 (50-75 प्रतियां / मिलीलीटर) पता लगाने की सीमा से नीचे वायरल भार के साथ व्यक्तियों से जीनोम मुश्किल है. यहाँ हम का वर्णन कैसे निकालने और प्लाज्मा वायरल शाही सेना का उपयोग कर एक वास्तविक समय पीसीआर परख कि मज़बूती से एचआईवी -1 शाही सेना के उपाय नीचे 0.3 प्रतियां / एमएल और कैसे एकल जीनोम अनुक्रमण द्वारा वायरल जीनोम बढ़ाना करने के लिए बहुत कम वायरल लोड के साथ नमूनों से यों.

Abstract

वायरल जीनों amplifying और मानक assays के द्वारा पता लगाने (नीचे 50-75 प्रतियां / मिलीलीटर) की सीमा से नीचे वायरल लोड के साथ एचआईवी -1 संक्रमित व्यक्तियों में एचआईवी -1 शाही सेना बढ़ाता रोगियों में वायरल गतिशीलता और वायरस मेजबान बातचीत करने के लिए लाभ अंतर्दृष्टि आवश्यक है परिचय स्वाभाविक रूप से संक्रमण और जो संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (कार्ट) पर कर रहे हैं नियंत्रण.

यहाँ हम का वर्णन कैसे एकल जीनोम अनुक्रमण (एसजीएस प्रोटोकॉल) 13, 19 और कैसे करने के लिए सही कम वायरल भार (एकल कॉपी परख प्रोटोकॉल (एससीए)) 12, 20 के साथ रोगियों में एचआईवी -1 शाही सेना यों द्वारा वायरल जीनोम को बढ़ाना.

परख एकल कॉपी प्लाज्मा assayed जा रहा है की मात्रा पर निर्भर करता है संवेदनशीलता के साथ एक वास्तविक समय पीसीआर परख है. यदि एक एकल वायरस जीनोम प्लाज्मा की 7 मिलीलीटर में पाया जाता है, तो शाही सेना की नकल संख्या 0.3 प्रतियां / एमएल होने की सूचना है. परख शाही सेना निकासी की क्षमता के लिए आंतरिक नियंत्रण परीक्षण है, और डीएनए या संक्रमण से संभव प्रवर्धन के लिए नियंत्रण. रोगी के नमूने तीन प्रतियों में मापा जाता है.

एकल जीनोम अनुक्रमण (एसजीएस) परख, अब व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और गैर श्रम गहन 3, 7, 12, 14, 15 माना जाता है, एक सीमित कमजोर पड़ने परख है, जिसमें endpoint पतला सीडीएनए उत्पाद एक 96 - अच्छी तरह से फैला हुआ है थाली. एक पॉसों वितरण के लिए अनुसार, जब कुओं की कम से कम 1 / 3 से उत्पाद देने के लिए, वहाँ एक एकल सीडीएनए अणु से पीसीआर उत्पाद प्रवर्धन की जा रही है परिणामी की एक 80% मौका है. एसजीएस जा रहा resampling के अधीन नहीं जा रहा है और पीसीआर शुरू 19 पुनर्संयोजन द्वारा पक्षपाती नहीं क्लोनिंग से अधिक लाभ है. हालांकि, एससीए और एसजीएस के प्रवर्धन सफलता प्राइमर डिजाइन पर निर्भर करते हैं. दोनों assays एचआईवी -1 उप - प्रकार बी के लिए विकसित किए गए, लेकिन अन्य subtypes और जीनोम के अन्य क्षेत्रों के लिए बदलने प्राइमरों, जांच, और मानकों के द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है.

Protocol

1. शाही सेना के प्लाज्मा की एक बड़ी मात्रा से निकालना

एक प्रति परख (एससीए) के एक सिंहावलोकन और एक जीनोम अनुक्रमण प्रोटोकॉल (एसजीएस) के आंकड़े 1 और 2 में प्रदान की जाती हैं.

  1. प्लाज्मा की 7 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए, 15 मिलीलीटर EDTA में एकत्र रक्त के लगभग 14 मिलीलीटर स्पिन (नहीं हेपरिन) 15 मिनट के लिए 2600 XG पर ब्रेक लगाना के बिना संग्रह ट्यूबों. पिपेट प्लाज्मा 15 मिलीलीटर ट्यूबों में (buffy कोट परत से बचने सुनिश्चित करने).
  2. यदि शाही सेना एक प्रति परख (एससीए), स्पाइक Rous सारकोमा वायरस आंतरिक virion नियंत्रण (RCAS) की 30,000 प्रतियां के साथ प्लाज्मा के लिए निकाला जा रहा है. पहले RCAS वायरस के लिए प्रदर्शन एससीए के रूप में पहले वर्णित (20) तैयार की है. संक्षेप में, सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से RCAS वायरस आरटी गतिविधि के द्वारा मात्रा निर्धारित है, 200 उल प्रति 30,000 virions की अंतिम एकाग्रता, 5% FBS के साथ RPMI टिशू कल्चर मीडिया में पतला पतला, और -80 डिग्री एकल उपयोग aliquots में सी संग्रहीत. RCAS वायरस / पहले thawed जमे हुए परख में उपयोग नहीं किया जा चाहिए. RCAS रोगी प्लाज्मा शाही सेना निकासी की क्षमता के लिए और पीसीआर मात्रा का ठहराव की सटीकता के लिए नियंत्रण में बालीदार है. : RCAS के बारे में अधिक जानकारी के निम्नलिखित लिंक पर पाया जा सकता है http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/.
  3. प्लाज्मा "पूर्व स्पिन", 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों में, 2600 XG पर 15 मिनट के लिए बाहर किसी भी lipids और सेलुलर मलबे, जो सटीक शाही सेना मात्रा का ठहराव के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं अलग है.
  4. लेबल Seton आसान सील नमूना संख्या और स्थान है जहां गोली ट्यूब में फार्म की पहचान करने के लिए एक स्थायी मार्कर के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों. पूर्व स्पिन के बाद, प्लाज्मा pipetting और सतह पर किसी भी सेलुलर मलबे और / या लिपिड से बचने के द्वारा Seton सील आसान अपकेंद्रित्र ट्यूबों प्लाज्मा हस्तांतरण. प्लाज्मा के इनपुट मात्रा रिकॉर्ड.
  5. जोड़ें Tris-buffered खारा (टीबीएस) लड़ी पिरोया गर्दन के नीचे के लिए सील Seton आसान ट्यूब की शेष मात्रा को भरने के लिए. सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले ट्यूब में मौजूद हैं या ट्यूब ultracentrifuge एक में गिर जाएगा. यकीन है कि ट्यूब पर निशान जावक का सामना करना पड़ रहा है जब रोटर में ट्यूब रखने बनाओ.
  6. फिर से प्रयोग करने योग्य और टोपी जगह एक पूर्व ठंडा Sorval T1270 और 4 में 170.000 (50,000 rpm) XG ° 30 मिनट के लिए सी में Sorval 90SE ultracentrifuge में रोटर अपकेंद्रित्र में नमूने के साथ सील.
  7. बाद centrifugation सतह पर तैरनेवाला हटाने और वायरल गोली (यह दिखाई नहीं किया जाएगा) 90 उल आणविक ग्रेड पानी और 10 proteinase - कश्मीर उल (20 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने.
  8. एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी और 30 मिनट के लिए स्नान सेते में रखें ट्यूब. सुनिश्चित करें ट्यूबों इतना है कि गोली के साथ पक्ष proteinase कश्मीर और पानी के मिश्रण में डूब जाता है एक कोण पर सेट कर रहे हैं.
  9. ऊष्मायन के बाद, शीघ्र ही ट्यूब को एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में स्पिन ट्यूब के नीचे सभी तरल एकत्र (5 सेकंड के बारे में) और 6M guanidinium thiocyanate समाधान के 315 उल और 20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन के 10 उल (नोट जोड़ें: उचित पालन करें इस खतरनाक सामग्री के लिए निपटान दिशानिर्देशों, ब्लीच या एसिड के साथ मिश्रण नहीं है और अलग कंटेनर में निपटान) .
  10. हल्के भंवर और शीघ्र ही स्पिन (5 सेकंड के बारे में लिए). कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं और फिर एक नए लेबल 1.5 मिलीलीटर RNase मुफ्त अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए प्रत्येक ट्यूब की सामग्री हस्तांतरण.
  11. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 21,000 XG पर प्रत्येक ट्यूब, 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर आणविक ग्रेड isopropyl शराब के 495 उल जोड़ें.
  12. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 70% इथेनॉल 500 उल जोड़ें.
  13. 10 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 21,000 XG पर भंवर. एक हस्तांतरण विंदुक के साथ इथेनॉल निकालें. फिर से घुमाओ और एक विंदुक के साथ किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें. एयर 10 मिनट के लिए सूखी. (लिए एसजीएस प्रोटोकॉल 5 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.0 40 उल में शाही सेना भंग, और एसजीएस प्रोटोकॉल के साथ जारी).
  14. आरएनए बफर के 55 उल में गोली भंग. आरएनए बफर 100 मिमी डीटीटी के 10 उल और 40 Rnasin / यू उल की 25 उल जोड़ने के द्वारा प्राप्त की है 965 उल Tris - एचसीएल (8.0 पीएच, 5 मिमी). बर्फ पर रखें.

2. एकल प्रतिलिपि बनाएँ परख

एक 96 - अच्छी तरह से थाली दोनों एचआईवी और RCAS मानकों और नियंत्रण सहित 8 रोगी के नमूने रखती है. इस प्रोटोकॉल के एक ही थाली के सेट - अप का वर्णन करेंगे.

  1. 1 मिलीलीटर शाही सेना - बफर के 2 aliquots एचआईवी -1 शाही सेना और RCAS शाही सेना टेप में जो शाही सेना मानक घटता के लिए पतला हो जाएगा की तैयारी द्वारा शुरू करो. आरएनए बफर 1.13 के तहत वर्णित है.
  2. 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में बर्फ पर dilutions तैयार. 54 उल शाही सेना - बफर 3x10 5 प्रतियां / उल देने के लिए एचआईवी -1 शाही सेना शेयर (1x10 6 प्रतियां / उल) के 25 उल जोड़कर आरएनए बफर में एचआईवी -1 शाही सेना टेप के आधे लॉग dilutions बनाओ .
  3. लगातार आधा लॉग dilutions (25 उल + 54 उल) 10 (उल नोट प्रति 0.3 प्रतियां बनाने के लिए नीचे जारी रखें: 0.3, 1, और 3 dilutions विश्लेषण के दौरान इन के लिए मानक वक्र का एक हिस्सा नहीं होगा एक्सट्रपलेशन मूल्यों के रूप में उपयोग किया जाता है और unknowns dur करने के लिए सेट किया जाना चाहिएआईएनजी विश्लेषण). RCAS टेप 1x10 6 प्रतियां / उल पर रखता हैं. इसी तरह, आरएनए बफर में RCAS टेप के आधे लॉग dilutions के लिए नीचे 100 प्रतियां तैयार है लेकिन 10 उल प्रति.
  4. सीडीएनए संश्लेषण के रूप में तालिका 1 में सूचीबद्ध के लिए आरटी कॉकटेल तैयार. आरटी और NRT प्रतिक्रियाओं के रूप में तालिका 1 में सूचीबद्ध ध्यान में रखते हुए अप करने के लिए खाते में किसी भी हानि है कि हस्तांतरण के दौरान हो सकता है के लिए एक अतिरिक्त थोड़ा तैयार. नोट: NRT कॉकटेल के लिए, आरटी एंजाइम पानी से बदला है डीएनए से प्रवर्धन के लिए नियंत्रण.
    नोट: यह कदम हाल ही में एक Qiagen रोबोट (मूल कॉर्बेट) पर सेट थाली के अलावा स्वचालित किया गया है.
  5. ऑप्टिकल प्लेट 96 अच्छी तरह से (के रूप में 3 चित्र में दिखाया) सेट, एक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण के आरटी 20 उल जोड़कर. 8 कुओं में लेबल "NRT," रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (NRT प्रतिक्रिया मिश्रण) के बिना कॉकटेल जोड़ने. थाली के लिए कॉकटेल जोड़ने के बाद, कुओं लेबल "कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी)" के लिए पानी की 10 उल जोड़ने. चित्रा 3 में दिखाया गया है सांद्रता में "एचआईवी" लेबल कुओं को एचआईवी टेप के 10 उल जोड़ें. अनुसार सांद्रता में "RCAS" लेबल कुओं RCAS टेप के 10 उल जोड़ें. 3 आसन्न प्लेट चित्र पर "नमूना" लेबल कुओं में रोगी नमूना के 10 उल जोड़ें. लेबल कुओं eluted नमूना के 10 उल जोड़ें "NRT." एक ही नमूने के 5 उल और पानी का लेबल कुओं 5 उल जोड़ें "आंतरिक नियंत्रण."
  6. सील की थाली और thermocycler पर चलाएँ: 25 ° सी 15 मिनट के लिए, 42 ° 40 मिनट, 85 ° सी 10 मिनट के लिए, 25 ° सी 30 मिनट के लिए, और 5 डिग्री सेल्सियस पकड़ के लिए सी.
  7. तालिका 2 के अनुसार तैयार करें पीसीआर मास्टर घोला जा सकता है.
  8. जब सीडीएनए संश्लेषण पूरा हो गया है, एक सीडीएनए का उपयोग करने के लिए नामित क्षेत्र के लिए कदम. इस क्षेत्र में नामित, दोनों एचआईवी और RCAS लिए सीडीएनए की थाली में से प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पीसीआर मास्टर मिश्रण के 20 उल जोड़ें. यह एक नामित क्षेत्र में किसी भी संभावित संक्रमण से बचने के लिए इस कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  9. स्पिन थाली, अबी या रॉश ऑप्टिकल और ऑप्टिकल कंबल (केवल अबी 7700 के लिए आवश्यक कंबल) के साथ कवर को कवर के साथ मुहर. रॉश 480 या 7700 अबी पर चलाएँ. पीसीआर स्थितियां: 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए, तो 95 के 45 चक्रों ° सी 15 सेकंड के लिए, 60 ° सी 1 मिनट के लिए. अलग विश्लेषण RCAS और एचआईवी के लिए आवश्यक है. परिणामों का उदाहरण 4 चित्र में दिखाया जाता है. मानक वक्र के ढलान कम प्रतिलिपि संख्या टेप के एक सामान्य पॉसों वितरण से प्रभावित हो जाएगा. मानक वक्र, इन कम प्रतिलिपि संख्या मानकों (0.3, 1, और 3 प्रतियां) के लिए सबसे सही ढलान के क्रम में यह सुनिश्चित करने के लिए "अज्ञात" के रूप में सेट हैं 17

3. एकल जीनोम अनुक्रमण

  1. सीडीएनए संश्लेषण. 10 मिमी dNTPs के 5 उल और एक 96 में अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट (Biorad) में 5 2 एक अच्छी तरह से करने के लिए मिमी जीन विशिष्ट प्राइमर (नीति या वातावरण) के उल जोड़ें. निकाले शाही सेना के 40 उल जोड़ें. सील की थाली.
  2. 10 मिनट के लिए 65 में thermocycler में शाही सेना मिश्रण ° सी denature.
  3. सीडीएनए संश्लेषण, तालिका 3 में सूचीबद्ध के लिए अभिकर्मकों मिक्स. Denaturing कदम के बाद, बर्फ पर पीसीआर थाली जगह, प्रत्येक नमूने के सीडीएनए मिश्रण के 50 उल जोड़ें.
  4. भागो thermocycler पर पीसीआर प्लेट: 45 ° 50 मिनट, 85 डिग्री सेल्सियस के लिए सी में 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पकड़.
  5. पहले पीसीआर, 10 उल प्रतिक्रियाओं. एक अभिकर्मक ट्रे में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी के पहले दौर प्रवर्धन p6 आर टी या वातावरण (3 तालिका में सूचीबद्ध अभिकर्मकों, प्राइमरों 5 तालिका में सूचीबद्ध) के लिए या तो प्राइमरों का उपयोग .
  6. एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट (70 नमूने और 3 नकारात्मक नियंत्रण) 73 कुओं के लिए पीसीआर मिश्रण के 8.0 उल बग़ैर.
  7. सीडीएनए संश्लेषण के बाद पूरा हो गया है एक सीडीएनए का उपयोग करने के लिए नामित क्षेत्र सीडीएनए और पीसीआर पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त थाली ले जाने के है. नामित क्षेत्र में, प्रत्येक सीडीएनए 140 उल अंतिम मात्रा लाने नमूना Tris - एचसीएल पीएच 8.0 40 उल जोड़ें. नकारात्मक नियंत्रण के प्रत्येक के लिए 70 कुओं और पानी की 2.0 उल के प्रत्येक 2.0 सीडीएनए की उल जोड़ें. सील पीसीआर थाली. Thermocycler, 4 तालिका में कार्यक्रम पर चलाएँ.
  8. नेस्टेड पीसीआर - 20ul प्रतिक्रियाओं. नेस्टेड पीसीआर के लिए अभिकर्मक ट्रे (3 तालिका में सूचीबद्ध अभिकर्मकों, प्राइमरों 5 तालिका में सूचीबद्ध) में अभिकर्मकों मिक्स.
  9. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट पर 73 कुओं multichannel विंदुक द्वारा नेस्टेड पीसीआर मिश्रण के 18 उल जोड़ें
  10. पहली पीसीआर 01:05 पतला और नेस्टेड पीसीआर के पहले दौर पीसीआर के दो उल जोड़ें. Thermocycler पर पीसीआर तालिका 4 में सूचीबद्ध शर्तों के तहत, प्रतिक्रिया चलाएँ.
  11. एक 1% agarose जेल पर नमूने चलाएँ. सुनिश्चित करें कि पीसीआर उत्पादों के बहुमत सीडीएनए के एक एक अणु के परिणाम हैं, कुओं का कोई भी अधिक 30% सकारात्मक होना चाहिए. प्रक्रिया के Beckman कल्टर Biomek एफएम रोबोट का उपयोग करने के लिए एक 1% करने के लिए पीसीआर प्लेटों की सामग्री लोड करने के लिए स्वचालित है, 96 ई जेल कुओं (Invitrogen). ई - जैल ई आधार पर 7 मिनट के लिए चलाए जा रहे हैं. अनुक्रम 5 तालिका में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग उत्पादों.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

एससीए:

सभी नियंत्रण क्रम में एचआईवी -1 शाही सेना माप सही विचार देना चाहिए. यदि एक नकारात्मक नियंत्रण की स्थिति हैve, रन संभव संदूषण की वजह से अवहेलना होना चाहिए. निष्कर्षण कदम के दौरान शाही सेना के नुकसान के लिए आदेश में नियंत्रित करने के लिए, प्लाज्मा में बालीदार RCAS के कम से कम 50% बरामद किया जाना चाहिए. अगर औसत RCAS <15,000 प्रतियां है, नमूना विफल रहता है और अवहेलना होना चाहिए क्योंकि शाही सेना का एक महत्वपूर्ण राशि निकासी या प्रोटोकॉल के अन्य चरणों के दौरान किया गया है खो सकता है. यह सभी रोगी होने की संभावना की वजह से 6 प्लाज्मा में उच्च लिपिड परीक्षण नमूनों के बारे में 10% में होता है . RCAS वायरस की वसूली के लिए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण और पीसीआर प्रवर्धन की दक्षता की गुणवत्ता के लिए नियंत्रण का मतलब है. यह एचआईवी वसूली के लिए सही है के बाद से एचआईवी की संभावना immunoglobulins और अन्य मानव प्रोटीन यह थोड़ा टिशू कल्चर से अलग वायरस से अलग बनाने के लिए बाध्य है के लिए इस्तेमाल नहीं किया है. हमारी प्रयोगशाला में RCAS की वसूली औसत 25,716 + / - 4057 प्रतियां / प्रतिक्रिया मिश्रण, या लगभग 95% + / RCAS शाही सेना के -15% 17 जोड़ी है . NRT (कोई रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस) नियंत्रण समानांतर में चलाने के क्रम में डीएनए से प्रवर्धन के लिए परीक्षण करने के लिए. NRT मूल्य तीन एचआईवी -1 शाही सेना के मूल्यों में से प्रत्येक से subtracted है, तो औसत की गणना है और अगर इस संख्या को शून्य (डीएनए का प्रवर्धन शाही सेना के प्रवर्धन से अधिक) की तुलना में कम है, परिणाम विफल हो जाएगा और अवहेलना की जानी चाहिए क्योंकि बजाय शाही सेना डीएनए से प्रवर्धन के जोखिम के. यदि एचआईवी -1 शाही सेना केवल 1 / 3 कुओं से परिलक्षित होता है, फिर परीक्षण नमूना करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रवर्धन वास्तविक नमूना और एक संभव contaminant कारण नहीं किया जा रहा है assayed के लिए सच है की सिफारिश की है.

यदि सभी नियंत्रणों के पास, औसत एचआईवी एक प्लाज्मा में शाही सेना की नकल संख्या गणना की जा सकती है.

उदाहरण 1: यदि औसत एचआईवी -1 की नकल संख्या शून्य है, पता लगाने की सीमा प्लाज्मा की मात्रा assayed के आधार पर गणना की है . एक उदाहरण के रूप में, हम कहते हैं कि प्लाज्मा के 7 मिलीग्राम assayed किया गया था. शाही सेना की छोटी राशि है कि इस परख के साथ किया गया है पाया जा सकता है कुओं और दो अन्य कुओं में अच्छी तरह से प्रति 0.33 प्रतियों की एक औसत देने 0 प्रतियां में एक प्रतिलिपि किया गया होगा. औसत प्रतिलिपि संख्या तो आरएनए क्षालन में कुल प्रतिलिपि संख्या (प्रत्येक अच्छी तरह से में 10 उल है, लेकिन कुल क्षालन मात्रा 55 उल) करने के लिए 5.5 का एक कारक से गुणा किया जाना है. पता लगाने की निचली सीमा तो है: 5.5 x 0.33 से विभाजित 7ml = 1.83 / 7 = 0.3 प्रतियां / एमएल प्रतियां. प्लाज्मा में एचआईवी -1 शाही सेना के इस उदाहरण में एकाग्रता <0.3 प्रतियां / एमएल था.

उदाहरण 2: एचआईवी -1 शाही सेना detectable है. शाही सेना प्लाज्मा के 7 मिलीलीटर से निकाला गया था. एचआईवी -1 शाही सेना के प्रति की औसत प्रतिलिपि संख्या अच्छी तरह से अच्छी तरह से 2.0 प्रति प्रतियां होने की गणना की है. फिर प्लाज्मा के मिलीलीटर प्रति औसत प्रतिलिपि संख्या 5.5 x 2.0 / प्रतियां 7 मिलीलीटर = 1.6 एचआईवी 1 आरएनए / प्लाज्मा मिली.

एक टेम्पलेट एक्सेल शीट को कॉपी संख्या की गणना के लिए इस्तेमाल किया नीचे वेबसाइट से लोड किया जा सकता है.

एसजीएस:

यदि एक नकारात्मक नियंत्रण के सकारात्मक संभव संदूषण की वजह से चलाने अवहेलना होना चाहिए. प्रत्येक रन से उत्पाद की संख्या प्रत्येक नमूने में वायरल लोड और नमूना की हालत पर निर्भर करेगा. हमारे अनुभव में lipids या प्लाज्मा में कोशिकाओं की एक बहुत उत्पाद प्राप्त करने का मौका कम हो जाएगा. शर्तों और पिछले ठंड भंडारण और नमूना का विगलन भी शाही सेना की वसूली काफी प्रभावित करेगा. सामान्य में, जब 50 प्रतियां / एमएल, उत्पाद (जेल पर बैंड) नीचे वायरल भार के साथ नमूनों के साथ काम करने के बारे में 1 / 3 / 2 -1 संसाधित नमूनों की उम्मीद की जानी है. उपरोक्त कारकों पर निर्भर करता है, प्लेट प्रति 1-5 बैंड एक अच्छा कम इन रोगियों में वायरल लोड की वजह से परिणाम पर विचार किया जाना चाहिए.

सीडीएनए संश्लेषण (आरटी / कॉकटेल सीडीएनए प्रतिक्रिया) एक प्रतिक्रिया कोई रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (NRT) / कॉकटेल सीडीएनए प्रतिक्रिया (1 प्रतिक्रिया)
आण्विक ग्रेड एच 2 हे 8.1 उल 8.2 उल
25 मिमी 2 MgCl 6 उल 6 उल
25 मिमी dNTPs 0.6 उल 0.6 उल
100 मिमी डीटीटी 0.2 उल 0.2 उल
रैंडम Hexamers (0.1 स्नातकीय / उल) 1.5 उल 1.5 उल
10X TaqMan बफर एक 3.0 उल 3.0 उल
Rnasin (40 यू / उल) 0.5 उल 0.5 उल
Strategene आरटी (200 यू / उल) 0.1 उल न जोड़ें
कुल 20 उल 20 उल
नमूना शाही सेना 10 उल 10 उल
कुल मात्रा 30 उल 30 उल

टेबल रिएक्शन 1. Mixtएकल प्रतिलिपि बनाएँ परख में सीडीएनए संश्लेषण के लिए ures.

पीसीआर मास्टर मिश्रण एक प्रतिक्रिया प्राइमर्स
एच 2 हे 15.1 उल एचआईवी फॉरवर्ड प्राइमर 5'-CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA-3 '
10X पीसीआर गोल्ड बफर 2.0 उल एचआईवी रिवर्स प्राइमर 5'-TGCTTGATGTCCCCCCACT-3 '
25 मिमी 2 MgCl 2.0 उल एचआईवी Probe5'FAM CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA-Tamra 3 '
* फॉरवर्ड प्राइमर (100 उम) 0.3 उल
* रिवर्स प्राइमर (100 उम) 0.3 उल अग्रेषित RCAS Primer5' - GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA-3 '
* जांच (100 उम) 0.05 उल RCAS Primer5' - TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC-3 'रिवर्स
TaqGold (5 यू / उल) 0.25 उल RCAS जांच 5'FAM TGGGTCGGGTGGTCGTGCC-Tamra 3 '
कुल 20.0 उल

टेबल 2. पीसीआर मास्टर मिश्रण और एक प्रति परख के लिए प्राइमरों.

सीडीएनए / कॉकटेल सीडीएनए प्रतिक्रियाओं 1 शाही सेना नमूना प्रथम पीसीआर कॉकटेल 1 प्लेट (75 प्रतिक्रियाओं) नेस्टेड पीसीआर कॉकटेल 1 प्लेट (75 प्रतिक्रियाओं)
10X आरटी बफर (Invitrogen) 10 उल 10X पीसीआर बफर (Invitrogen) 75 उल 10X पीसीआर बफर 150 उल
25 मिमी 2 MgCl 20 उल 50 मिमी MgSO 4 30 उल 50 मिमी MgSO 4 60 उल
0.1M डीटीटी एक उल 10 मिमी dNTPs 15 उल 10 मिमी dNTPs 30 उल
RNase - मुक्त पानी 17.5 उल 50 उम प्राइमरों (ea) 3 उल 50 उम प्राइमरों (ea) 6 उल
RNase आउट (Invitrogen) एक उल प्लेटिनम Taq हाय Fi एनजाइम (Invitrogen) 6 उल प्लेटिनम Taq हाय Fi एनजाइम (Invitrogen) 12 उल
सुपरस्क्रिप्ट (200 यू / उल) III (Invitrogen) 0.5 उल आण्विक - ग्रेड पानी 468 उल आण्विक - ग्रेड पानी 1086 उल

तालिका 1 सीडीएनए और एकल जीनोम अनुक्रमण के लिए पीसीआर मिश्रण .

P6 - आरटी 1 पीसीआर कार्यक्रम लि एक पीसीआर कार्यक्रम
1. 94 ° 2 मिनट के लिए सी 1. 94 ° 2 मिनट के लिए सी
2. 94 ° 30 सेकंड के लिए सी 0.94 2 ° C 30 सेकंड के लिए
0.94 2 ° C 30 सेकंड के लिए 3. 52 ° 30 सेकंड के लिए सी
4. 72 ° सी 1 मिनट 30 सेकंड 4. 72 ° C 1 मिनट के लिए
5. # 2 के पास जाओ, 44 चक्र 5. # 2 के पास जाओ, 44 चक्र
6. 72 ° C 3 मिनट के लिए 6. 72 ° C 3 मिनट के लिए
7. 4 ° सी पकड़ 7. 4 ° सी पकड़
P6 - आरटी 2 पीसीआर कार्यक्रम लि 2 पीसीआर कार्यक्रम
1. 94 ° 2 मिनट के लिए सी 1. 94 ° 2 मिनट के लिए सी
2. 94 ° 30 सेकंड के लिए सी 2. 94 ° 30 सेकंड के लिए सी
3. 55 ° 30 सेकंड के लिए सी 3. 56 ° C 30 सेकंड के लिए
4. 72 ° C 1 मिनट के लिए 4. 72 ° C 45 सेकंड के लिए
5. # 1, 40 (कुल 41 चक्र) पर जाएँ 5. # 1, 40 (कुल 41 चक्र) पर जाएँ
6. 72 ° C 3 मिनट के लिए 6. 72 ° C 3 मिनट के लिए
7. 4 ° सी पकड़ 7. 4 ° सी पकड़

तालिका 4 सिंगल जीनोम अनुक्रमण परख के लिए Thermocycler शर्तों .

प्रतिक्रिया भजन की पुस्तक अनुक्रम
P6 - आरटी सीडीएनए 3500 - 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3'
सीडीएनए वातावरण E115 - 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 '
1 P6 - आरटी. पीसीआर 3500 - 5 'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3'
1 P6 - आरटी. पीसीआर 1849 + 5 'GATGACAGCATGTCAGGGAG 3'
P6 - आरटी2.PCR 1870 + 5 'GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3'
P6 - आरटी 2.PCR 3410 - 5 'CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3'
1 env. पीसीआर E115 - 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3 '
1 env. पीसीआर E20 + 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3 '
2 वातावरण. पीसीआर E30 + 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 '
2 वातावरण. पीसीआर E125 - 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 '
P6 - आरटी अनुक्रमण 2030 + 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3 '
P6 - आरटी अनुक्रमण 2600 + 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3 '
P6 - आरटी अनुक्रमण 2610 - 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3 '
P6 - आरटी अनुक्रमण 3330 - 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3 '
वातावरण अनुक्रमण E30 + 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3 '
वातावरण अनुक्रमण E125 - 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3 '

एकल जीनोम अनुक्रमण परख के लिए 5. टेबल प्राइमर्स .

चित्रा 1
चित्रा 1 झुलसाना जीनोम अनुक्रमण (एसजीएस) परख का अवलोकन.

चित्रा 2
चित्रा 2 एकल प्रतिलिपि बनाएँ परख (एससीए) का अवलोकन.

चित्रा 3
चित्रा 3 सिंगल प्रतिलिपि बनाएँ परख के लिए सेट अप प्लेट .

चित्रा 4
चित्रा 4 7700 अबी से गोली मार दी स्क्रीन. रोगी के नमूने और बी नुकीला मरीज के नमूनों के साथ RCAS मानक वक्र दिखाने के साथ एचआईवी -1 शाही सेना के मानक वक्र दिखा.

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Discussion

एचआईवी 1 संयोजन एंटीरिट्रोवाइरल उपचार पर संक्रमित व्यक्तियों (कार्ट) या जो स्वाभाविक रूप से संक्रमण नियंत्रण बहुत कम वायरल लोड, आमतौर पर 4 प्लाज्मा, 11, 12, 17, 18 के लगभग 1 मिलीलीटर प्रति कॉपी है . प्राकृतिक नियंत्रण के साथ रोगियों में वायरल लोड, अक्सर एक व्यक्ति के सेट बिंदु 1, 2, 17 के आसपास उतार चढ़ाव. assays के संवेदनशीलता का वर्णन के साथ साथ उच्च प्लाज्मा के इनपुट की मात्रा पर निर्भर है. आम तौर पर, हम प्लाज्मा की 7 मिलीलीटर के साथ काम कर रहा है, लेकिन प्लाज्मा की छोटी मात्रा से सकारात्मक परिणाम प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से वास्तविक प्लाज्मा वायरल लोड पर निर्भर करता है,. शाही सेना निकासी के साथ साथ वर्णित विधि एक "घर काढ़ा" जो श्रम गहन है. हमने पाया है कि इस निष्कर्षण विधि बहुत विश्वसनीय और शाही सेना के निष्कर्षण के लिए मौजूदा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट की तुलना में ज्यादा प्रभावी है. प्लाज्मा की गुणवत्ता के उत्पाद प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. पिछला ठंड और प्लाज्मा के विगलन या -80 डिग्री से अधिक तापमान पर भंडारण शाही सेना नुकसान और उत्पाद की संभावना कम हो जाएगा. एक प्लाज्मा के पूर्व स्पिन "भी अत्यधिक की सिफारिश की लिपिड, कोशिकाओं और अन्य विशेषताओं है कि अल्ट्रा centrifugation पहले परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं अलग है.

प्रोटोकॉल में कई चरणों को स्वचालित किया गया है.

एससीए परख के रूप में वास्तविक समय Dornadula एट अल द्वारा वर्णित परख उदाहरण के लिए अन्य ultrasensitive assays की तुलना में अधिक संवेदनशील होने का लाभ है. 5 प्लाज्मा की 5.0 मिलीलीटर प्रति प्रतियां का पता लगाने के के एक कम सीमा के साथ, संशोधित Amplicor ultrasensitive परख (Roche, बेसल, स्विट्जरलैंड) Havlir एट अल द्वारा वर्णित 9. प्लाज्मा के मिलीलीटर प्रति 2.5 प्रतियां और अर्द्ध मात्रात्मक प्रतिलेखन करने के लिए नीचे का पता लगाने मध्यस्थता प्रवर्धन परख (TMA) Hatano एट अल द्वारा 3.5 प्रतियां / मिलीलीटर का पता लगाने के के एक अनुमान के अनुसार कम सीमा के साथ 8 वर्णित है . अन्य ultrasensitive 5 assays, 8 की तुलना में, 9 एससीए परख में शाही सेना वसूली द्वारा निगरानी एक आंतरिक virion (RCAS) मानक है कि एचआईवी -1 के रूप में एक ही अवसादन दर के पास है, इस प्रकार यह एक बैकअप वायरस के रूप में कार्य करता है कि सभी वायरस सुनिश्चित ultracentrifugation स्पिन के दौरान pelleted और कड़े निष्कर्षण प्रक्रिया के शेष सहा. यह भी बहुत उपयोगी नकारात्मक झूठी पता लगाने की संभावना को खत्म करने में मदद. एससीए परख सीधे मात्रात्मक होने के TMA 8 परख अधिक स्पष्ट लाभ है. हालांकि एससीए परख अन्य ultrasensitive बहुत श्रम गहन और महंगी assays की तुलना में है. एससीए परख से परिणाम केवल विश्वसनीय हैं अगर सभी आंतरिक नियंत्रण से गुजरती हैं.

परख एकल जीनोम जीनोम के प्रवर्धन के लिए सोने के मानक है. यह जा रहा है फिर नमूने के अधीन नहीं अगर इनपुट की राशि 16 कम है और पीसीआर शुरू 15 पुनर्संयोजन द्वारा पक्षपातपूर्ण नहीं है क्लोनिंग पर लाभ दिया है. हालांकि एसजीएस प्राइमर डिजाइन द्वारा सीमित है, जो पूर्वाग्रह हो सकता है जो एचआईवी - एक आबादी 10 प्रवर्धित हैं .

दोनों एससीए और एसजीएस अत्यधिक प्राइमर डिजाइन पर निर्भर हैं. दोनों assays यहाँ वर्णित बी उप प्रकार भीतर परिवर्तनशीलता के कारण एचआईवी-1 subtype बी बढ़ाना करने के लिए डिजाइन किए गए थे, उत्पाद के बारे में प्राइमरों और टेम्पलेट के बीच बेमेल की वजह से 10% नमूनों की में नहीं प्राप्त की है. हालांकि, दोनों assays को आसानी से बदलने प्राइमर डिजाइन और मानक वक्र द्वारा या अन्य उपप्रकारों अन्य जीनोमिक क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए रोगियों को जो एचआईवी -1 के कई अध्ययनों में भाग लिया स्वीकार करना चाहते हैं.

जेएमसी एफएम Kirby फाउंडेशन से समर्थन के साथ अमेरिकन कैंसर सोसायटी के एक रिसर्च प्रोफेसर था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Random hexamers (500 ug/ml) Promega Corp. C118A
Taqman buffer A Applied Biosystems 4304441
RNAsin (40 U/ul) Promega Corp. N211B
RT enzyme (200 U/ul) Stratagene, Agilent Technologies 600107-51
Amplitaq Gold DNA polymerase Applied Biosystems 4311814 6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM Invitrogen AM9855G
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul Invitrogen 18080-044
Superscript III 10X buffer Invitrogen comes with the enzyme
DTT 100 mM Invitrogen comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul Invitrogen 11304-102
10X High Fidelity PCR Buffer Invitrogen 11304-102 comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml Ambion 2546
Guanidinium Thiocyanate solution 6M Fluka 50983
Glycogen 20 mg/ml Roche Group 10901393001
Isopropanol Sigma-Aldrich 19516
Ethanol 70% Sigma-Aldrich E702-3
Molecular grade water GIBCO, by Life Technologies 10977-015
dNTPs (25 mmol each) Bioline BIO-39025
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) Seaton Scientific 6041
White Delrin crowns Seaton Scientific 4020 Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml Beckman Coulter Inc. 361642
Hex driver ½ inc opening Seaton Scientific 4013
cap removal tupe Seaton Scientific 4014
5 ml serological pipettes Costar 4051
Pipetboy Any Supplier
15 ml Transfer pipettes ISC Bioexpress P-5005-7
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip VWR international 14670-329
15 ml centrifuge tubes Falcon BD
1 ml centrifuge tubes Any Supplier
Tris buffer Saline tablets Sigma-Aldrich T5030-100TAB
Ultracentrifuge and rotor Sorvall, Thermo Scientific 90SE and T-1270
96-well PCR plates Bio-Rad HSS-9601
50 ml Reagent reservoir Costar 4870
Microamp optical 96-well reaction plate Applied Biosystems N801-0560
Optical plate covers Applied Biosystems 4333183
MicroAmp Optical Compression Pad Applied Biosystems 4312639
Microseal A film Bio-Rad MSA-5001
2 ml centrifuge tubes Any Supplier
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) Invitrogen G-7008-01
E-base (Invitrogen) Invitrogen EB-M03
EDTA Collection tubes any brand

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References

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