Summary
Interação proteína-proteína testes é indispensável para dissecção de funcionalidade da proteína. Aqui, nós apresentamos uma
Abstract
Interações entre proteínas diferentes validar é vital para a investigação de suas funções biológicas em nível molecular. Existem vários métodos, tanto in vitro como in vivo, para avaliar a ligação às proteínas, e pelo menos dois métodos que complementam as deficiências do outro deve ser conduzido para obter conclusões confiáveis.
Para um ensaio in vivo, a complementação bimolecular de fluorescência ensaio (BiFC) representa a abordagem mais popular e menos invasivo que permite detectar a interação proteína-proteína dentro das células vivas, bem como identificar a localização intracelular de proteínas que interagem a 1,2. Neste ensaio, as metades não fluorescente N-e C-terminal da GFP, ou suas variantes são fundidos às proteínas testadas, e quando as duas proteínas de fusão são reunidos devido às interações das proteínas testadas ", o sinal fluorescente é reconstituído 06/03 . Porque seu sinal é facilmente detectável por microscopia de epifluorescência ou confocal, BiFC emergiu como uma poderosa ferramenta de escolha entre os biólogos para estudar sobre interações proteína-proteína em células vivas 3. Este ensaio, entretanto, às vezes pode produzir resultados falsos positivos. Por exemplo, o sinal fluorescente pode ser reconstituído por dois fragmentos de GFP dispostos, tanto quanto 7 nm um do outro devido a fechar embalagem, em um pequeno compartimento subcelular, e que, devido a interações específicas 7.
Devido a essas limitações, os resultados obtidos a partir de tecnologias de imagem ao vivo de células deve ser confirmado por uma abordagem independente, baseada em um princípio diferente para a detecção de interações proteína. Co-imunoprecipitação (IP-Co) ou glutationa transferase (GST) suspenso ensaios representam tais métodos alternativos que são comumente usados para analisar interações proteína-proteína in vitro. No entanto, estes ensaios iin, no entanto, as proteínas testado deve ser facilmente solúvel no buffer que supportsused para a reação de ligação. Portanto, interações específicas, envolvendo uma proteína insolúvel não podem ser avaliados por estas técnicas.
Aqui, nós ilustrar o protocolo para o ensaio overlay proteína de membrana de ligação, que contorna esta dificuldade. Nesta técnica, a interação entre as proteínas solúveis e insolúveis podem ser seguramente testado, porque uma das proteínas é imobilizado em uma matriz de membrana. Este método, em combinação com experimentos in vivo, tais como BiFC, fornece uma abordagem confiável para investigar e caracterizar as interações entre proteínas fielmente solúveis e insolúveis. Neste artigo, a ligação entre o vírus do mosaico do tabaco (TMV) proteína de movimento (MP), que exerce várias funções durante o transporte célula a célula-viral 8-14, e um interator planta recentemente identificado celulares, tabaco anquirina repetir proteína contendo (ANK ) 15, é demonstrado usando esta técnica.
Protocol
1. Expressão e de extração das proteínas
- Diferencialmente tag as proteínas a ser testada para a sua detecção. Rótulo a proteína possa ser imobilizada na membrana (ProIM) com uma tag de um tamanho maior (por exemplo, GST) ea marca não fundido pode ser usado como um controle de imobilizado negativo (ProIMnc). Rótulo a proteína para ser usado como uma sonda solúvel (PROSOL) ou com uma grande ou uma pequena etiqueta. Fusível a mesma marca de uma proteína de controlo negativo adequado solúvel (ProSOLnc) e incluir no ensaio de interação para confirmar a especificidade da ligação detectado.
- Escolher o sistema de expressão de proteína para expressar proteínas marcadas, ou seja, E. coli, baculovírus, etc, dependendo da necessidade de modificações pós-translacionais e os rendimentos potenciais das proteínas.
- Extrato ProIM e ProIM nc do organismo de escolha (passo 1.2) usando SDS-PAGE tampão de carregamento (glicerol 20%, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) contendo coquetel inibidor de protease. Deixe a suspensão de células em temperatura ambiente por 15 min, adicionar 0,5% de 2-mercaptoetanol e ferva por 5 min.
- Extrato PROSOL e PROSOL nc do organismo de escolha (passo 1.2) usando um protocolo padrão 16. Estas proteínas devem ser facilmente solúvel no buffer de ligação (140 mM NaCl, 10 mM, Tris-HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, BSA 1%, 0,1% Tween 20) utilizado no passo 4.1.
- Determinar a concentração de proteínas recombinantes utilizando um método padrão, como Bio-Rad kit ensaio de proteína. tais como Bio-Rad kit ensaio de proteína. Se extrato bruto, em vez de proteína purificada, é usado para o ensaio, a estimativa da concentração da proteína de interesse neste extrato, verificando densitometria da banda correspondentes de um SDS-poliacrilamida gel corado com Coomassie Brilliant Blue R-250 e usando conhecida concentrações de BSA como referência.
2. Imobilização de ProIM e ProIMnc na membrana
- Resolver dois conjuntos de extratos, cada um contendo 1 mg de ProIM e nc ProIM em um gel de poliacrilamida SDS-de acordo com o protocolo padrão 16.
- Após a eletroforese, coloque a transferência do gel para em 100 ml de tampão de transferência (60 mM glicina, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, MeOH 20%) e incubar com agitação suave por 20 min em temperatura ambiente.
- Electrotransfer as proteínas contidas no gel para uma membrana de nitrocelulose de acordo com o protocolo padrão 16.
3. Re-folding de proteínas ligadas à membrana
- Depois electrotransfer, incubar a membrana por 15 min em 15 ml de tampão A (30 mM Tris-HCl pH7.4, 0,05% Tween 20) com agitação suave para remover SDS residual.
- Após a drenagem cuidadosamente, a transferência da membrana para 25 ml de tampão de desnaturação (7 M de cloridrato de guanidina, 2 mM EDTA, 50 mM DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). e incubar por 2 horas em temperatura ambiente com agitação suave. (Nota: A membrana de nitrocelulose torna-se opaco quando incubadas no buffer de desnaturação). e incubar por 2 horas em temperatura ambiente com agitação suave.
- Transferência da membrana para 25 ml de TBS (10 mM Tris pH-HCl, 150 mM NaCl, 7,4) e incubar com agitação suave por 5 min (Nota: Durante esta etapa, a membrana recupera a sua cor original branca).
- Transferência da membrana para 25 ml de tampão de ligação (veja o passo 1.2) e incubar a 4 ° C com agitação suave para pernoite.
4. Sondando o ProIM pela PROSOL
- Corte da membrana em duas faixas, ambas contendo ProIM e ProIM nc.
- Faça as soluções de hibridização PROSOL e ProSOLnc diluindo a preparação com 10-10 mg de qualquer PROSOL ou ProSOLnc em 10 ml de tampão de ligação nova. Transferência de cada membrana na solução de hibridização PROSOL ou ProSOLnc e incubar por 1,5 h à temperatura ambiente com agitação suave.
- Remova as membranas das soluções de hibridização e enxaguar três vezes por 15 min cada um em TBS.
5. Visualizar a interação proteína-proteína por immunoblotting
- Bloco da membrana, com 2,5% de leite desnatado em TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) por 1 h em temperatura ambiente. Diluir o anticorpo primário (anti-anticorpo de coelho strepII policlonal) em 0,5% de leite desnatado em TBST na concentração recomendada pelo fabricante.
- Coloque as membranas bloqueados na solução de anticorpos, e incubados por 1 h em temperatura ambiente ou para a noite a 4 ° C com agitação suave.
- Enxaguar as membranas em 20 TBST ml por 15 min, e duas vezes por 5 min em temperatura ambiente com agitação suave.
- Diluir o anticorpo secundário (anti-IgG de coelho) conjugado com peroxidase de rábano (HRP) em 0,5% de leite desnatado em TBST na concentração recomendada pelo fabricante. Coloque o membranas no anticorpo secundáriosolução e incubar por 1 h em temperatura ambiente com agitação suave.
- Enxaguar as membranas em 20 TBST ml por 15 min, e duas vezes por 5 min em temperatura ambiente com agitação suave. Após o enxágüe final em TBS, visualizar a interação proteína-proteína utilizando um substrato quimioluminescência HRP (por exemplo, Millipore Immobilon ocidental substrato quimioluminescente HRP).
- Sonda as membranas mesmo com o anticorpo primário para a marca fundida a ProIM, seguido pelo anticorpo secundário apropriado conforme descrito nas etapas 5,1-5,4. Visualize ProIM e ProIMnc como descrito no passo 5,5 para validar a identidade das bandas obtidas no ensaio de sobreposição de proteína de membrana (passo 5.5). Na maioria dos casos, stripping não é necessário, porque o sinal obtido por este passo é muito mais forte do sinal residual obtido a partir do passo 5.5.
6. Resultados representativos:
A interação ANK-MP foi observado por BiFC em células epidérmicas de tabaco (Figura 1A). MP porque é uma proteína altamente insolúvel quando expressos em bactérias ou em plantas, a proteína de membrana ensaio overlay foi adotado para validar essa interação in vitro (Figura 1B). Extratos de proteínas contendo 1 mg de GST-MP (ProIM) ou GST não fundido (ProIM nc) foram resolvidas por SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida por electrotransfer a uma membrana de nitrocelulose. Quando estes ProIMs foram sondados com solúveis ANK-strepII (PROSOL), GST-MP, mas não GST não fundido, exibiu ligação (Figura 1B, faixas 1, 2, comparar com pistas 5, 6). Além disso, quando o mesmo conjunto de ProIMs foram sondados com uma ProSOLnc independentes, ou seja, quinase NADH citoplasmático Arabidopsis tag strepII (NADH3-strepII), nenhuma ligação não foi observada, demonstrando a especificidade da interação ANK-MP (Figura 1B, pistas 3, 4).
Figura 1. Ligação específica do tabaco ANK para TMV MP in vivo e in vitro. (A) interação ANK-MP em células vivas do tabaco epidérmica como detectado pelo BiFC. YFP sinal forte foi reconstruído quando MP e ANK, fundido ao C-terminal e N-terminal metades de YFP, respectivamente, foram co-expressos na epiderme do tabaco seguintes microbombardment de genes a sua codificação. Este sinal BiFC acumulado em puncta na periferia das células, que são de diagnóstico de plasmodesmos 15. (B) interação ANK-MP in vitro como detectado pelo teste de proteína de membrana overlay. Extratos de proteínas contendo 1 mg de GST-MP (ProIM) ou GST não fundido (ProIMnc) foram resolvidas em um 15% gel de poliacrilamida SDS, seguido por electrotransfer em uma membrana de nitrocelulose. A GST-MPProIM e GSTProIMnc foram incubadas com 0,5 mg / ml de ANK-strepII (PROSOL), e ANK ligação foi detectado pela sondagem da membrana com anticorpo anti-coelho strepII policlonal, seguido de anticorpos IgG anti-coelho M + secundário conjugado com HRP (faixas 1 e 2). Nem GST-MPProIM nem GSTProIMnc interagiu com uma proteína não relacionada, Arabidopsis quinase NADH citoplasmático, fundida ao tag strepII (ProSOLnc, faixas 3 e 4). A identidade da banda observada neste ensaio foi confirmada por sondagem a membrana com anticorpos anti-GST (faixas 5 e 6). Quando a membrana foi tratado com tampão de desnaturação sem ser lavada com tampão A, a ligação do GST-MP para ANK é perdido, enquanto que as proteínas não identificadas contidas no GST-MP e extratos de proteína GST contining reagiu com ANK-strepII, demonstrando a importância da etapa de 3,1 antes do processo de desnaturação (faixas 7 e 8).
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Discussion
Esta abordagem é adequada para testar interações proteína-proteína entre as combinações das proteínas, quando pelo menos um dos quais as proteínas é facilmente solúvel no buffer de ligação, e foi aplicado com sucesso em outra combinação de proteínas 17,18. O iInteractions entre as proteínas que são insolúveis nestas condições não pode ser testada por este protocolo.
Além disso, redobrando bem-sucedida de ProIM é fundamental para o ensaio. Lavar a membrana em TBS após a electrotransfer é o passo fundamental, porque a SDS residual pode prejudicar o processo de desnaturação / renaturalização.
Finalmente, para evitar ligações não específicas, a concentração da PROSOL no buffer de ligação não deve exceder 1 mg / ml. PROSOL que é muito concentrado podem apresentar ligação não específica para ProIM. Além disso, de bloquear a ligação não específica de proteínas da membrana imobilizado para PROSOL, BSA no tampão de hibridação utilizada durante a etapa 4.2 pode ser substituído ao leite desnatado.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho em nosso laboratório é suportada por concessões do NIH, National Institute of USDA para Agricultura e Alimentação, NSF, BARD, DOE, e BSF para VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-PROTEAN system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 | |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 | |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 |
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