Summary
测试是必不可少的蛋白质 - 蛋白质相互作用蛋白质功能的夹层。在这里，我们引入
Abstract
验证不同的蛋白质之间的相互作用是至关重要的，为在分子水平上的生物学功能的调查。有几种方法， 在体外和体内 ，以评估蛋白结合，并应进行至少有两种方法，相互补充的缺点，以获得可靠的见解。
对于一个在体内实验中，双分子荧光互补（附设）检测最流行 的，至少侵入的方法，使检测活细胞内蛋白质相互作用，以及识别细胞内相互作用的蛋白质1,2的本地化。在这个实验中，测试蛋白质融合GFP或它的变种N -和C -末端非荧光半，两个融合蛋白汇聚由于测试的蛋白质“相互作用时，荧光信号是重组 3-6 。因为它的信号很容易epifluorescence或共聚焦显微镜检测，附设已经成为一个强大的工具，在活细胞3中蛋白质相互作用的研究细胞生物学家之间的选择。然而，这个实验中，有时会产生假阳性结果。例如，荧光信号可以安排尽可能远离对方因7纳米包装在一个小的亚细胞车厢关闭两个GFP片段重组，而由于特定的相互作用 7 。
由于这些限制，从活细胞成像技术所取得的成果，应确认由一个独立的方法的基础上，检测蛋白质相互作用的原理不同。免疫共（联合IP）或谷胱甘肽转移酶（GST）的代表等，通常用于分析蛋白质相互作用，在体外Pull - down实验的替代方法。然而，IIN这些实验，然而，测试的蛋白质一定要容易溶于supportsused结合反应的缓冲区。因此，具体涉及一种不溶性蛋白质的相互作用，不能由这些技术进行评估。
在这里，我们说明了蛋白质膜覆盖结合试验，从而绕过这个困难的协议。在这种技术中，可以可靠地测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用，因为固定在膜基质的蛋白质之一。这种方法， 在体内实验，如附设结合，提供了一个可靠的方法，调查和定性可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用忠实。在这篇文章中，烟草花叶病毒（TMV）之间具有约束力的运动蛋白（MP），发挥多种功能，在病毒的细胞与细胞之间的运输8-14，以及最近发现植物细胞interactor，烟草含有锚蛋白重复蛋白（ANK 15），证明使用这种技术。
Protocol
1。表达和提取的蛋白质
- 差异标记要为他们的检测测试的蛋白质。标签膜（ProIM）被固定在一个尺寸较大的标签（例如，消费税），非融合标签可以使用一个固定的阴性对照组（ProIMnc）的蛋白质。标签用于大型或一个小标签作为一种可溶性的探头（ProSOL）的蛋白质。保险丝相同的标记，以一个合适的阴性对照的可溶性蛋白（ProSOLnc），包括在互动中检测，以确认检测约束力的特异性。
- 选择蛋白表达系统表达标记蛋白，即大肠杆菌大肠杆菌 ，杆状病毒等，根据潜在的翻译后修饰和蛋白质的产量的要求。
- 从选择的有机体，使用SDS - PAGE电泳上样缓冲液（20％的甘油，4％SDS，20毫米的Tris - HCl，pH6.8）含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（步骤1.2）中提取 ProIM和ProIM NC。在室温为15分钟的保留细胞悬液，加入0.5％2 - 巯基乙醇和煮沸5分钟。
- 从选择的有机体，使用标准的协议16（步骤1.2）中提取ProSOL和ProSOL NC。这些蛋白质应该很容易在结合缓冲液中的可溶性（2毫米EDTA，140毫米，10毫米氯化钠，pH值7.4的Tris - HCl，2毫米的数码地面电视服务，1％BSA，0.1％吐温20）的步骤4.1中使用。
- 确定重组的蛋白质，如Bio - Rad公司蛋白测定试剂盒，使用一种标准的方法的浓度。 Bio - Rad公司蛋白检测试剂盒等。如果原油中提取，纯化的蛋白质，而不是，是用来检测，估计相应频段的光密度扫描SDS -聚丙烯酰胺凝胶染色用考马斯亮蓝R - 250和使用已知浓度的蛋白质，这种提取物的兴趣BSA的浓度作为参考。
2。固定在膜ProIM和ProIMnc
- 解决两套提取，每个SDS -聚丙烯酰胺凝胶含有1微克ProIM和ProIM NC根据标准协议16。
- 电泳后，转移地方凝胶在转移缓冲液100毫升（60毫米甘氨酸，10毫米三，0.0006％SDS，20％甲醇）中，轻轻摇动孵育在室温为20分钟。
- Electrotransfer包含在凝胶中根据标准协议 16至硝酸纤维素膜上的蛋白质。
3。膜结合的蛋白质重新折叠
- electrotransfer后，孵育15分钟在15毫升的缓冲膜（30毫米的Tris - HCl pH7.4的0.05％吐温20），轻轻摇动，以去除残留的SDS。
- 经过仔细排水，转移膜的变性缓冲（7米盐酸胍，2毫米EDTA，50毫米数码地面电视，50毫米的Tris - HCl pH值8.3）至25毫升。孵育2小时，在室温下轻轻摇动。 （注：在变性缓冲液孵育时，硝酸纤维素膜变得不透明）。孵育2小时，在室温下轻轻摇动。
- 膜转移至25 ml的TBS（10毫米的Tris - HCl，150 mM氯化钠，pH值7.4），轻轻摇动孵育5分钟（注意：在此步骤中，膜恢复原有的白色）。
- 膜转移至25毫升的结合缓冲液（见第1.2步），并在4℃，轻轻摇动孵育过夜另。
4。通过ProSOL探测的ProIM
- 切成条状，既包含ProIM和ProIM NC膜。
- 稀释1-10微克或10毫升新鲜的结合缓冲液中，无论是ProSOL ProSOLnc准备的ProSOL和ProSOLnc杂交解决方案。膜转移到每个ProSOL或ProSOLnc杂交液和孵育1.5 h在室温轻轻摇动。
- 取出膜杂交的解决方案，并在TBS电视台每15分钟冲洗三次。
5。可视化免疫印迹蛋白质相互作用
- 座膜在室温下1小时与2.5％的脱脂奶粉TBST（10毫米的Tris - HCl，140 mM氯化钠，0.05％吐温20，pH值7.4）。在制造商建议的浓度在0.5％的脱脂奶粉TBST稀释的主要抗体（抗- strepII多克隆兔抗体）。
- 堵塞膜放置在抗体溶液，在室温下1小时或一夜之间孵育4℃，轻轻摇动。
- 在15分钟20毫升TBST冲洗膜，并两次在室温下轻轻摇动5分钟。
- 稀释与辣根过氧化物酶（HRP）的制造商建议的浓度在0.5％的脱脂奶粉TBST标记的第二抗体（抗兔IgG抗体）。将在二级抗体的膜解决方案，并在室温下轻轻摇动1小时孵化。
- 在15分钟20毫升TBST冲洗膜，并两次在室温下轻轻摇动5分钟。最后的TBS冲洗后，可视使用HRP化学发光底物（例如，Millipore公司的Immobilon西部发光辣根过氧化物酶底物）的蛋白 - 蛋白相互作用。
- 探头与融合ProIM，通过适当的辅助步骤5.1至5.4的抗体标记抗体相同的膜。可视化ProIM和ProIMnc中所述的步骤5.5来验证身份的蛋白膜覆盖法（步骤5.5）中获得的频段。在大多数情况下，剥离是没有必要，因为这一步得到的信号是比从步骤5.5中获得的剩余信号强多了。
6。代表性的成果：
附设在烟草表皮细胞（图1A）ANK - MP的相互作用。由于MP是一种高度不溶性蛋白质，在细菌或植物中的表达时，蛋白膜覆盖法通过，以验证这种在体外的相互作用（图1B ）。蛋白提取物中含有1微克的GST - MP（ProIM）或者未熔化的商品及服务税（ProIM NC）的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜，由electrotransfer解决。当这些ProIMs探讨可溶性ANK strepII（ProSOL），GST - MP，但不是非融合商品及服务税，展出具有约束力（图1B，泳道1，2，比较泳道5，6）。此外，当同一组的ProIMs无关ProSOLnc，即标签strepII（NADH3 strepII） 拟南芥胞质 NADH激酶，没有约束力不遵守，探讨进一步证明ANK - MP相互作用的特异性（图1B，车道3，4）。
图1。烟草ANK特异性结合烟草花叶病毒在体内和体外的MP 。 （一）ANK - MP在生活附设检测烟草表皮细胞的相互作用。强YFP的信号重建时，MP和ANK，C端和N -端半YFP的，分别融合，在烟草表皮microbombardment其编码基因共表达。这附设信号在puncta积累在细胞外围，这是15胞间连丝的诊断。 （二）ANK - MP 在体外的相互作用检测蛋白膜覆盖检测。 15％SDS聚丙烯酰胺凝胶electrotransfer随后到硝酸纤维素膜，蛋白提取物中含有1微克的GST - MP（ProIM），或者未熔化的商品及服务税（ProIMnc）解决。 GST - MPProIM和GSTProIMnc孵育0.5微克/毫升ANK strepII（ProSOL），ANK约束力是通过探测与反strepII多克隆抗体的膜，抗兔IgG + M二级抗体偶联检测辣根过氧化物酶（泳道1和2）。无论是GST - MPProIM也不GSTProIMnc互动与融合strepII标签（ProSOLnc，泳道3和4），一个不相关的蛋白，拟南芥胞质NADH激酶。在这个实验中观察到的乐队的身份被确认通过探测与抗GST抗体（5和6车道）膜。变性缓冲处理，而不会被用缓冲液A洗涤，当膜的GST - MP绑定ANK丢失，而不明身份的GST - MP和消费税contining蛋白提取物中的蛋白质与ANK - strepII反应，表现出的重要性步骤3.1之前的变性过程（7和8）。
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Discussion
这种方法适用于检测蛋白质相互作用的蛋白质之间的组合，当至少有一个，其中的蛋白质很容易结合缓冲液中的可溶性，并成功地应用到其他结合蛋白17,18。不能测试都是在这些条件下的不溶性蛋白质之间的iInteractions本议定书。
此外，ProIM成功复性检测的关键。漂洗后的electrotransfer在TBS的膜是关键的一步，因为残留的SDS损害变性/复性过程。
最后，为了避免非特异性结合，对ProSOL的结合缓冲液中的浓度不得超过1微克/毫升。 ProSOL这是过于集中，可能会出现非特异性结合ProIM。此外，为了阻止在步骤4.2中使用的杂交缓冲液中的固定膜蛋白的非特异性结合ProSOL，BSA的可替代脱脂牛奶。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在我们的实验室的工作是从国立卫生研究院，美国农业部国家粮食和农业研究所，国家科学基金会，巴德，能源部和BSF拨款到VC支持
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-PROTEAN system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 | |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 | |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 |
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