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प्रोटीन झिल्ली उपरिशायी परख: एक घुलनशील और अघुलनशील प्रोटीन के बीच बातचीत टेस्ट प्रोटोकॉल इन विट्रो में Published: August 14, 2011 doi: 10.3791/2961
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1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

परीक्षण बातचीत प्रोटीन, प्रोटीन प्रोटीन कार्यक्षमता के विच्छेदन के लिए अपरिहार्य है. यहाँ, हम एक परिचय

Protocol

1. अभिव्यक्ति और प्रोटीन की निकासी

  1. विभिन्न उनके पता लगाने के लिए परीक्षण किया जा प्रोटीन टैग. लेबल प्रोटीन झिल्ली (ProIM) पर एक बड़े आकार (जैसे, जीएसटी) के एक टैग के साथ immobilized हो, और unfused टैग एक स्थिर नकारात्मक नियंत्रण (ProIMnc) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. लेबल करने के लिए एक घुलनशील जांच (ProSOL) के रूप में या तो एक बड़े या एक छोटे टैग के साथ इस्तेमाल किया जा प्रोटीन. एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण घुलनशील प्रोटीन (ProSOLnc) के लिए एक ही टैग फ्यूज और बातचीत परख में शामिल करने के लिए पता लगाया बंधन की विशिष्टता की पुष्टि है.
  2. प्रोटीन अभिव्यक्ति को टैग प्रोटीन व्यक्त प्रणाली, यानी, ई. चुनें कोलाई, baculovirus, आदि, संभावित पोस्ट translational संशोधनों और पैदावार के प्रोटीन के लिए आवश्यकता के आधार पर.
  3. पसंद के जीव (1.2 कदम) एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है (20% ग्लिसरॉल, एसडीएस 4%, 20 मिमी Tris - एचसीएल, pH6.8) बफर proteinase अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त का उपयोग करने से ProIM और ProIM नेकां निकालें. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेल निलंबन छोड़ो, 2-mercaptoethanol और 5 मिनट के लिए फोड़ा 0.5% जोड़ें.
  4. पसंद के जीव (1.2 कदम) एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर 16 से ProSOL और ProSOL नेकां निकालें. ये प्रोटीन बंधन बफर में आसानी से घुलनशील (140 मिमी NaCl, 10 मिमी, Tris - एचसीएल पीएच 7.4, 2 मिमी EDTA, 2 मिमी डीटीटी, BSA 1%, 0.1% 20 बीच) 4.1 चरण में किया जाना चाहिए.
  5. रीकॉम्बीनैंट एक मानक पद्धति का उपयोग करके जैसे प्रोटीन, जैव रेड प्रोटीन परख किट की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. जैव रेड प्रोटीन परख किट के रूप में. यदि प्रोटीन शुद्ध के बजाय कच्चे निकालने, परख के लिए प्रयोग किया जाता है, Coomassie खूब ब्लू R-250 के साथ एक एसडीएस polyacrylamide जेल दाग पर इसी बैंड के densitometry और स्कैनिंग में जाना जाता है का उपयोग करके इस निकालने में रुचि के प्रोटीन की एकाग्रता का अनुमान BSA के संदर्भ के रूप में सांद्रता.

2. ProIM और ProIMnc की झिल्ली पर स्थिरीकरण

  1. अर्क के दो सेट, मानक प्रोटोकॉल 16 के लिए अनुसार एक जेल एसडीएस - polyacrylamide पर ProIM ProIM और नेकां के एक μg प्रत्येक युक्त संकल्प.
  2. वैद्युतकणसंचलन के बाद, हस्तांतरण हस्तांतरण बफर के 100 मिलीलीटर (60 मिमी Glycine, 10 मिमी Tris, एसडीएस 0.0006%, 20% MeOH) में जेल जगह है और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. एक nitrocellulose झिल्ली को जेल में मानक प्रोटोकॉल 16 के लिए अनुसार निहित प्रोटीन Electrotransfer.

3. पुनः झिल्ली ही सीमित प्रोटीन की तह

  1. Electrotransfer के बाद, 15 मिनट के लिए बफर के 15 मिलीलीटर में झिल्ली सेते (30 Tris - एचसीएल मिमी pH7.4, 0.05% के बीच 20) कोमल अवशिष्ट एसडीएस हटाने के आंदोलन के साथ.
  2. सावधानी से draining के बाद, विकृतीकरण बफर (7 एम guanidine हाइड्रोक्लोराइड, 2 मिमी EDTA, 50 मिमी डीटीटी, 50 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.3) के 25 मिलीलीटर की झिल्ली हस्तांतरण. और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं. (नोट: nitrocellulose झिल्ली अपारदर्शी हो जाता है जब विकृतीकरण बफर में incubated है). और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. टीबीएस के 25 मिलीलीटर (10 Tris - एचसीएल मिमी, 150 मिमी NaCl, 7.4 पीएच) और 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ सेते झिल्ली स्थानांतरण (नोट: इस कदम के दौरान, झिल्ली अपने मूल सफेद रंग आ).
  4. बाध्यकारी बफर के 25 मिलीलीटर (1.2 कदम देखें) झिल्ली स्थानांतरण और रात भर के लिए डिग्री सेल्सियस कोमल आंदोलन के साथ 4 पर सेते हैं.

4. ProSOL द्वारा ProIM जांच

  1. दो स्ट्रिप्स, दोनों से युक्त ProIM और ProIM नेकां में झिल्ली कट.
  2. या ताजा बाध्यकारी बफर के 10 मिलीलीटर में ProSOL ProSOLnc के 1-10 μg के साथ तैयारी गिराए द्वारा ProSOL और ProSOLnc संकरण समाधान करें. प्रत्येक झिल्ली ProSOL या ProSOLnc संकरण समाधान में स्थानांतरण और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. संकरण समाधान से झिल्ली निकालें और 15 मिनट टीबीएस में प्रत्येक के लिए तीन बार कुल्ला करें.

5. Immunoblotting द्वारा प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत Visualizing

  1. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 2.5% TBST में मलाई निकाला दूध (10 Tris - एचसीएल मिमी, 140 मिमी NaCl, 0.05% के बीच 20, 7.4 पीएच) के साथ झिल्ली ब्लॉक. निर्माता से सिफारिश की एकाग्रता में 0.5% TBST में मलाई निकाला दूध में प्राथमिक एंटीबॉडी (विरोधी strepII पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी) पतला.
  2. समाधान में अवरुद्ध एंटीबॉडी झिल्ली प्लेस, और 4 पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या रात भर के लिए incubated डिग्री सेल्सियस कोमल आंदोलन के साथ.
  3. 15 मिनट के लिए 20 मिलीलीटर TBST में झिल्ली कुल्ला, और दो बार कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए.
  4. माध्यमिक एंटीबॉडी (विरोधी खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी) घोड़ा 0.5% TBST में मलाई निकाला दूध में मूली (एचआरपी) निर्माता द्वारा सिफारिश की एकाग्रता में peroxidase के साथ संयुग्मित पतला. माध्यमिक एंटीबॉडी में झिल्ली प्लेससमाधान और कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  5. 15 मिनट के लिए 20 मिलीलीटर TBST में झिल्ली कुल्ला, और दो बार कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए. बाद अंतिम टीबीएस में कुल्ला करने के लिए, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत एचआरपी chemiluminescence सब्सट्रेट (उदाहरण के लिए, Millipore Immobilon पश्चिमी chemiluminescent एचआरपी सब्सट्रेट) का उपयोग कल्पना.
  6. टैग ProIM, उचित माध्यमिक के रूप में 5.4 5.1 चरणों में वर्णित एंटीबॉडी द्वारा पीछा करने के लिए इनकार के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक ही झिल्ली जांच. कल्पना ProIM और ProIMnc के रूप में 5.5 चरण में वर्णित प्रोटीन झिल्ली उपरिशायी परख (5.5 कदम) में प्राप्त बैंड की पहचान को मान्य. ज्यादातर मामलों में, अलग करना आवश्यक नहीं है क्योंकि इस कदम से प्राप्त संकेत अवशिष्ट 5.5 कदम से प्राप्त संकेत की तुलना में ज्यादा मजबूत है.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

बातचीत ANK सांसद BiFC द्वारा तम्बाकू epidermal कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में मनाया गया. क्योंकि सांसद उच्च अघुलनशील प्रोटीन जब बैक्टीरिया में या पौधों में व्यक्त किया है, प्रोटीन झिल्ली उपरिशायी परख के लिए इन विट्रो (चित्रा 1 बी) में इस बातचीत को मान्य करने के लिए अपनाया गया था. प्रोटीन (ProIM) जीएसटी सांसद या unfused जीएसटी (ProIM नेकां) के 1 μg युक्त अर्क एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन electrotransfer द्वारा एक nitrocellulose झिल्ली को बाद से सुलझाया गया. जब इन ProIMs घुलनशील ANK (ProSOL) - strepII, जीएसटी सांसद, लेकिन unfused नहीं जीएसटी के साथ जांच रहे थे, बंधन प्रदर्शन (चित्रा 1B, गलियों 1, 2, 5 गलियों, 6 के लिए की तुलना). इसके अलावा गलियों, जब ProIMs के एक ही सेट एक असंबंधित ProSOLnc, यानी, Arabidopsis cytoplasmic NADH strepII (NADH3 - strepII) टैग kinase, कोई बाध्यकारी नहीं मनाया गया, के साथ जांच आगे थे ANK सांसद बातचीत की विशिष्टता (चित्रा 1B, प्रदर्शन 3, 4).

चित्रा 1
चित्रा 1 तम्बाकू ANK के विशिष्ट और vivo में इन विट्रो में TMV सांसद के लिए बाध्य. (ए) तम्बाकू epidermal कोशिकाओं के रूप में BiFC द्वारा पता लगाया में रहने वाले ANK सांसद बातचीत. मजबूत YFP संकेत पुनर्निर्मित किया गया जब सांसद और ANK, सी - टर्मिनल और YFP, क्रमशः के एन टर्मिनल आधा इनकार थे, उनके जीन एन्कोडिंग microbombardment के बाद तंबाकू epidermis में coexpressed. यह BiFC संकेत सेल परिधि है, जो 15 plasmodesmata का निदान कर रहे हैं पर puncta में जमा है. (ख) इन विट्रो में बातचीत ANK सांसद के रूप में प्रोटीन झिल्ली उपरिशायी परख द्वारा पता लगाया है. प्रोटीन (ProIM) जीएसटी सांसद या unfused जीएसटी (ProIMnc) के 1 μg युक्त अर्क 15% जेल एसडीएस polyacrylamide nitrocellulose झिल्ली पर electrotransfer द्वारा पीछा किया पर सुलझाया गया. जीएसटी के MPProIM और GSTProIMnc 0.5 / ANK strepII (ProSOL) के μg मिलीलीटर के साथ incubated रहे थे, और ANK बाध्यकारी विरोधी strepII खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की जांच, विरोधी खरगोश आईजीजी + एम माध्यमिक संयुग्मित एंटीबॉडी द्वारा पीछा द्वारा खोजा गया था एचआरपी (1 गलियों और 2). न तो जीएसटी MPProIM न ही GSTProIMnc एक असंबंधित प्रोटीन, Arabidopsis cytoplasmic NADH kinase, strepII टैग (ProSOLnc, गलियों 3 और 4) के लिए जुड़े हुए के साथ बातचीत की . इस परख में मनाया बैंड की पहचान प्रतिरक्षी विरोधी जीएसटी (5 गलियों और 6) के साथ झिल्ली की जांच के द्वारा पुष्टि की गई. जब झिल्ली विकृतीकरण बफर के साथ एक बफर के साथ धोया जा रहा बिना इलाज किया गया था, जीएसटी सांसद ANK के लिए बाध्य खो है, जबकि अज्ञात जीएसटी सांसद और जीएसटी contining प्रोटीन के अर्क में निहित प्रोटीन ANK-strepII के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की, महत्व का प्रदर्शन 3.1 कदम की पहले विकृतीकरण प्रक्रिया (7 गलियों और 8).

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Discussion

इस दृष्टिकोण प्रोटीन के संयोजन के बीच प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, जब कम से कम एक जिनमें से प्रोटीन बंधन बफर में आसानी से घुलनशील है, और 17,18 प्रोटीन के अन्य संयोजन के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था परीक्षण के लिए उपयुक्त है. कि दोनों इन शर्तों के अधीन अघुलनशील प्रोटीन के बीच iInteractions इस प्रोटोकॉल से परीक्षण नहीं किया जा सकता है.

इसके अलावा, ProIM के सफल refolding परख के लिए महत्वपूर्ण है. टीबीएस में electrotransfer बाद झिल्ली Rinsing महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि अवशिष्ट एसडीएस प्रक्रिया / विकृतीकरण renaturation क्षीण कर सकते हैं.

अंत में, गैर विशिष्ट बंधन से बचने के लिए बाध्यकारी बफर में ProSOL की एकाग्रता 1 μg / मिलीलीटर अधिक नहीं होनी चाहिए. ProSOL जो भी ध्यान केंद्रित किया है ProIM गैर विशिष्ट बंधनकारी प्रदर्शन कर सकते हैं. इसके अलावा, संकरण 4.2 चरण के दौरान इस्तेमाल किया बफर में ProSOL, BSA immobilized झिल्ली प्रोटीन की गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक मलाई निकाला दूध के लिए एवजी किया जा सकता है है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हमारी प्रयोगशाला में काम एनआईएच, खाद्य और कृषि USDA राष्ट्रीय संस्थान, NSF, चारण, डो, और बीएसएफ से कुलपति को अनुदान द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein assay kit Bio-Rad 500-0001
Proteinase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich S8820
Mini-PROTEAN system Bio-Rad 165-8000
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system Bio-Rad 170-3940
Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase GenScript A00098
Anti-GST rabbit polyclonal antibody GenScript A00097
Anti-strepII GenScript A00626
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane Pall Corporation 27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate EMD Millipore WBKL S0 050

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References

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Ueki, S., Lacroix, B., Citovsky, V.… More

Ueki, S., Lacroix, B., Citovsky, V. Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (54), e2961, doi:10.3791/2961 (2011).

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