Summary
Eine zuverlässige Methode, um der äußeren Haarzellen (OHC) beweglich Reaktionen, einschließlich Elektromotilität, langsame Motilität und Biegen, untersuchen beschrieben. OHC Motilität wird durch die Stimulation mit einem externen elektrischen Wechselfeld, und die Methode nutzt die Highspeed-Aufnahme, LED-Beleuchtung, und die letzte Generation Bildanalyse-Software.
Abstract
OHCs sind zylindrisch sensomotorischen Zellen im Corti-Organ, das Hörorgan im Inneren des Säuger-Innenohrs befindet. Der Name "Haarzellen" leitet sich von ihrer charakteristischen apikalen Bündel von Stereozilien, ein entscheidendes Element für die Detektion und Transduktion von Schallenergie 1. OHCs der Lage sind, verändern ihre Form-länglich, zu verkürzen und biegen in Reaktion auf elektrische, mechanische und chemische Stimulation, als eine motorische Reaktion entscheidend für Cochlea Verstärkung der akustischen Signale 2.
OHC Stimulation induziert zwei verschiedene bewegliche Antworten: i) Elektromotilität, auch bekannt als schnelle Motilität, Veränderungen in der Länge im Bereich von Mikrosekunden von elektrisch angetriebenen Konformationsänderungen in Motorproteine dicht in OHC Plasmamembran verpackt abgeleitet, und ii) langsam Beweglichkeit, Form Veränderungen in der Millisekunde bis Sekundenbereich mit Zytoskelett-Reorganisation 2, 3. OHC Biegen ist mit Elektromotilität verbunden sind, und das Ergebnis entweder von einer asymmetrischen Verteilung der Motorproteine in den seitlichen Plasmamembran, oder asymmetrische elektrische Stimulation dieser Motorproteine (zB mit einem elektrischen Feld senkrecht zur Längsachse der Zellen) 4. Mechanische und chemische Reize auslösen Wesentlichen langsam bewegliche Antworten, auch wenn Veränderungen in der ionischen Bedingungen der Zellen und / oder deren Umgebung kann auch Impulse für die Plasmamembran-embedded Motorproteine 5, 6. Da OHC bewegliche Antworten ein wesentlicher Bestandteil des cochleären Verstärkers, die qualitative und quantitative Analyse dieser beweglichen Reaktionen auf akustische Frequenzen (etwa von 20 Hz bis 20 kHz beim Menschen) sind, ist ein sehr wichtiges Thema im Bereich des Hörens Forschung 7.
Die Entwicklung neuer Imaging-Technologie kombiniert Hochgeschwindigkeits-Videokameras, LED-basierten Beleuchtungssystemen und ausgefeilte Bildanalyse-Software bietet nun die Möglichkeit, zuverlässige qualitative und quantitative Untersuchungen der beweglichen Reaktion von isolierten OHCs an ein externes elektrisches Wechselfeld (EAEF) durchführen 8. Dies ist eine einfache und nicht-invasive Technik, die die meisten der Grenzen der bisherigen Ansätze 9-11 umgeht. Darüber hinaus bietet die LED-basierte Beleuchtung System extreme Helligkeit mit unbedeutenden thermischen Auswirkungen auf die Proben und wegen der Verwendung von Video-Mikroskopie, ist die optische Auflösung mindestens 10-fach höher als bei konventionellen Lichtmikroskopie Techniken 12. Zum Beispiel mit dem Versuchsaufbau hier beschrieben, können Veränderungen in der Zelle Länge von etwa 20 nm routinemäßig und zuverlässig bei Frequenzen von 10 kHz erfasst, und diese Auflösung kann bei niedrigeren Frequenzen verbessert werden.
Wir sind zuversichtlich, dass dieser experimentelle Ansatz wird dazu beitragen, unser Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die OHC Beweglichkeit zu erweitern.
Protocol
1. Isolierung von OHCs
- Begin dieses Verfahren durch die Ernte Felsenbeine von Meerschweinchen, Mäuse oder Ihre Säugetierabfällen Modell.
- Dann öffnen Sie den zeitlichen Knochen mit einem Hammer Zange, um die Cochlea aussetzen, und tauche sie in Leibovitz L-15. Entfernen Sie überschüssige Knochen vorsichtig, halten die knöchernen Schale intakt. Diese ist ein allgemeines Verfahren für Felsenbeine von Säugetieren können kleinere Änderungen an der Technik notwendig sein, wenn es um zeitliche Knochen von sehr kleinen Tieren. In alten Tieren der Bulla ist in der Regel verkalkt, die Einführung einer zusätzlichen Komplikation des Verfahrens.
- Unter mikroskopischer Beobachtung, öffnen Sie den apikalen Bereich der Cochlea und beseitigen Stria vascularis und Ligamentum spirale mit der Spitze eines Nr. 11 Skalpell, wählen Sie eine Micro-Punkt und einer Geldstrafe Pinzette.
- Nehmen Sie das Corti-Organ aus dem Cochlea-Modiolus mit der Pinzette, und steckte es in 1mg/ml Kollagenase in L-15 bei Raumtemperatur für 5 min.
- Wenn OHCs von basalen Windungen der Cochlea benötigt werden, entfernen Sie die knöcherne Hülle um die Basis der Schnecke mit der Abholung, und trennen Sie die Spirale aus dem Schläfenbein mit dem Skalpell, bevor Sie das Corti-Organ.
- Übertragen Sie die Corti-Organ, um die Aufnahme Kammer mit einem 50 ul Hamilton-Spritze. Danach distanzieren Zellen durch Rückfluss durch die Nadel.
2. Versuchsaufbau
- Schematische Darstellung des externen elektrischen Wechselfeld (EAEF) Generator und ihre Verbindungen mit dem Bild-Capture-System (Abb. 1). Die Steuerschaltung wurde speziell auf die Engineering-Core des House Ear Institute umgesetzt.
- Der Versuchsaufbau ist in unseren Experimenten verwendet besteht aus einem Axiovert 135TV inversen Mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) mit einer alternativen LED-basierte Beleuchtung (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), zwei elektronische Mikromanipulatoren (Eppendorf "PatchMan", Deutschland), eine PC-gesteuerte ultra-High-Speed-Photron FastCAM X 1024 PCI-Kamera (Photron USA Inc.) in den Keller-Anschluss und einen zusätzlichen regulären CCD-Kamera in der trinokularen Port. Die FastCAM Kamera kann Bilder bei hohen Frequenzen (bis zu 100.000 fps) und hoher Auflösung (zB 1024 x 1024 Pixel bei 1.000 fps, 512 x 128 bei 10.000 fps, 384 x 96 bei 18.000 fps, und so weiter) zu erfassen. Die Bilder von der High-Speed-Kamera zur Verfügung gestellt werden direkt in den PC-Monitor beobachtet, während die CCD-Kamera auf einen anderen Monitor angeschlossen ist. Die LED-Beleuchtung-System arbeitet in zwei verschiedenen Modi: Low-Power-Analog-und High-Power-digital. Alle vorläufigen Verfahren (Elektroden positioniert, Zell-Positionierung, Fokus, usw.) werden unter Verwendung der Low-Power-Analog-Modus. Die High-Power-Beleuchtung wird durch die Öffnung der Verschluss der Kamera eingeschaltet und dann ausgeschaltet, indem Verschlussgeräusch, die Erleichterung Wärmeableitung. Homemade-Software, auch bei der House Ear Institute Maschinenbau-Core entwickelt, die auf dem gleichen PC steuert die Auslöser der High-Speed-Kamera, die LED-basierte Beleuchtung, und die EAEF. Eine herkömmliche Digitalkamera in der Front-Port können Standbilder, wie gebraucht. (Abb. 2 A).
- Elektroden (zwei 0,25 mm-Durchmesser Ag Drähte mit Spitze Abstand von 0,8 mm) angetrieben werden, um Position mit einer der elektronische Mikromanipulatoren. Elektroden-Position wird visuell und durch das mikroskopische Bild beobachtet; eine Änderung in der Brennebene des Bildes zeigt an, dass die Elektroden der Unterseite des experimentellen Kammer berührt. Zunächst wird das elektrische Feld kalibriert mit einem externen Elektrode. Diese Elektrode misst das elektrische Potential an verschiedenen Punkten, wodurch eine "Landkarte" des elektrischen Feldes. Wenn ein einzelner isolierter äußeren Haarzellen ist zwischen den Spitzen der Elektroden mit seiner Längsachse parallel zum angelegten EAEF platziert, wird sie bewegen verlängert und verkürzt auf der gleichen Frequenz des elektrischen Feldes. Wenn die Zelle senkrecht zum Feld platziert eine andere Art von OHC Antwort (Biegen) können beobachtet und untersucht werden. (Abb. 2 B)
3. EAEF Stimulation und Bilderfassung
- Vier verschiedene Stimulationsprotokolle sind wählbar (Abb. 3):
- kontinuierliche einzigen Frequenz (Abb. 3 A). Beachten Sie, dass Stimulus-Modus, Frequenz, Amplitude und Wellen-Typ ausgewählt werden mit dem hausgemachten Steuerungs-Software (rote Kreise) werden.
- bursted einzigen Frequenz (Abb. 3 B). Die Länge des Bursts und Lücken zwischen Burst sind auch wählbar.
- linear sweep (Abb. 3 C). Die Anfangs-und End-Frequenzen sind wählbar.
- Multi-Stimulation (Abb. 3 D). Einzel-Frequenz und linear fegt können in einem einzigen Experiment kombiniert werden. Nach Auswahl der entsprechenden Parameter konfiguriert der Steuerungs-Software des Systems und ermöglicht dem Bediener, Licht-synchronisierte Videoaufzeichnung und-Zell-Stimulation durch Klicken auf einen einzigen Tastendruck in initiierendem Computer-Bildschirm.
- Die Bilder werden im AVI-Format zur weiteren Analyse bei hohen Frequenzen erfasst.
4. Repräsentative Ergebnisse
- In diesem Film zeigen zwei isolierten äußeren Haarzellen Veränderungen in der Länge oder Krümmung, wenn sie als mit einer externen elektrischen Wechselfeld, das parallel oder quer ist, bzw. stimuliert, um ihre Längsachse. (Movie # 2).
- OHCs bewegliche Antworten sind off-line mit ProAnalyst Software (Xcitex Inc., Cambridge, MA) analysiert. "Feature Tracking"-Funktion in dieser Software bietet die Entfernung zwischen zwei Punkten Frame-by-Frame (Abb. 4). Bei der Zellteilung verkürzen die Distanz zwischen den Punkten an der Spitze (Kutikularplatte; rote Farbe) ausgewählt und die Basis der Zelle (Basal-polig; grüne Farbe) kleiner ist, und nimmt mit der Zellstreckung. Der Film zeigt die Software die Analyse Frame-by-Frame die Änderungen in der Länge. Die Leiste am unteren Rand des Bildes zeigt die Spur der Bewegung. In diesem Beispiel ist die totale Veränderung in der Länge etwa 6,5 Pixel.
- "Contour Tracking"-Funktion in ProAnalyst Software kann erkennen, Zellkante und automatisch messen dem Bereich der optischen Schnitt (Abb. 5).
- Polystyrol-Mikrokugeln hinzugefügt, um die Badlösung zufällig und fest an der Plasmamembran (Abb. 6 A) befestigen. Verschiedene Mikrosphären können gleichzeitig ausgewählt werden, und die Software kann automatisch verfolgen sie alle Frame für Frame. Auf diese Weise können die Zellen in Abschnitte unterteilt werden und die Beweglichkeit der einzelnen Abschnitte ausgewertet unabhängig. (Abb. 6 A)
- Durch die Auswahl Mikrosphären an den seitlichen Rändern der Zelle Bild befindet, Veränderungen in der Länge der einzelnen Segmente und Änderungen in Winkel von einem Segment in Bezug auf andere (Biegen) können auch unabhängig voneinander beurteilt werden. (Abb. 6B)
Abbildung 1. Schematische Darstellung der EAEF Generator und ihre Verbindungen mit dem Bild-Capture-System.
Abbildung 2. A) Bild des Versuchsaufbaus. B) Detail des Mikroskoptisches, mit Karikaturen der Elektroden und einem OHC platziert zwischen ihnen mit seiner Längsachse parallel zum elektrischen Feld.
Abbildung 3. A) Benutzeroberfläche des hausgemachten Steuerungs-Software für Single-Frequency-Stimulation konfiguriert. Die ausgewählten Parameter werden in rot eingekreist. B) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Burst Single-Frequency Stimulation konfiguriert. C) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Linear Sweep Stimulation konfiguriert. D) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Multi-Stimulation konfiguriert.
Abbildung 4. Einzelbild eines OHC mit zwei Punkten an der Basis (grün) und die Spitze (rot) der Zelle bzw. mit dem "Feature-Tracking"-Funktion des ProAnalyst Software selektiert. Die Kurve unterhalb der Zelle zeigt die periodischen Änderungen des Abstands zwischen den ausgewählten Punkten mit elektrischen Stimulation verbunden ist. Verschieben Sie die vertikale Leiste verschiedenen Rahmen können für einzelne Analyse ausgewählt werden.
Abbildung 5. Der "Contour Tracking"-Funktion in ProAnalyst erkennt die Zelle Rand und automatisch messen dem Bereich der optischen Schnitt.
Abbildung 6. A) Das aufgenommene Bild eines isolierten OHC mit Polystyrol-Mikrosphären (oben), und das gleiche Bild mit fünf Mikrosphären individuell ausgewählt (unten) verziert. Eine andere Farbe wurde auf jedes Mikrokügelchen zugewiesen, und ihre Verschiebungen lassen sich individuell und automatisch verfolgt werden Frame für Frame, analysiert und verglichen. B) Segmente von beliebiger Länge kann durch die Auswahl Polystyrol-Mikrosphären an den Rändern der Zelle befindet definiert werden, und Änderungen in der Länge dieser Segmente sowie Änderungen in der Ausrichtung von einem Segment in Bezug auf andere (Zelle Biegen) können automatisch ausgewertet werden Frame für Rahmen mit der Bildanalyse-Software.
Movie 1. Isolation von Meerschweinchen OHCs. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen
Movie 2. OHCs parallel und senkrecht zur EAEF zeigt typische Elektromotilität und Biegen Antworten. Klicken Sie hier, um Video anzuschauen
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Discussion
Die experimentelle Methode hier vorgestellten ermöglicht die Schätzung OHC motile Reaktionen in den kHz-Bereich ohne Einschränkung auf die Zelle der Bewegung. Verschiedene Stimulationsprotokolle, zusätzliche Markierungen (Mikrosphären), sowie Veränderungen in der Ausrichtung der Zelle in Bezug auf das elektrische Feld, machen es möglich, neue Aspekte der OHC Motilität mit einer Detailgenauigkeit bisher unzugänglichen untersuchen. Andere Methoden, z. B. die Verwendung von Fotodioden 9 oder Laser-Doppler 10, erfordern eine strenge Kontrolle der Position der Zelle. Hier, im Gegensatz dazu sind alle Messungen zwischen den Punkten ein und derselben Zelle durchgeführt, und jede Verschiebung ist nur mit Veränderungen in der Zellform und nicht mit ihrer Bewegung in Bezug auf ein externes Bezugssystem verbunden. Zuverlässige Messungen der Querschnittsfläche OHC-Bereich sind ebenfalls leicht zu erhalten, das ermöglicht eine Abschätzung der schnellen Veränderungen in OHC Volumen. Darüber hinaus die kontinuierliche Entwicklung schneller und empfindlicher Kameras und besseres Image-Analyse-Software, garantieren eine kontinuierliche Verbesserung der Qualität der Methode. Ein Nachteil der Technik, keine Kontrolle über die elektrische Spannung über der Zellmembran, ist eine Einschränkung mit allen aktuellen Methoden zur OHC Motilität in den kHz-Bereich zu bewerten geteilt.
So könnte der hier beschriebenen Methode ein wichtiges Werkzeug für Hörforschung werden, der fähig ist, die neue und wichtige Hinweise über die zellulären und molekularen Mechanismen OHCs 'bewegliche Antworten
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Arbeit unterstützt von den National Institutes of Health Grants R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Forschung Core und HEI. Sein Inhalt ist ausschließlich die Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH oder HEI. Die Autoren erklären, keine bestehenden oder potenziellen Interessenkonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
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