Summary
electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.
Abstract
OHCs는 Corti, 포유류의 내이 (内耳) 안에있는 청각 기관의 오르간에 위치하고 원통형 sensorimotor 세포입니다. 이름은 "세포는"stereocilia, 소리 에너지를 1 감지 및 전달을위한 중요한 요소들의 특징 혀끝의 번들에서 유래. OHCs 변경할 수있는 형태를 연장하다 단축하고, 벤드 -에, 전기 기계 및 화학 자극에 응답하여, 모터의 응답이 음향 신호의 증폭 달팽이 2 중요 간주됩니다.
I) electromotility, 일명 빠른 운동성, 밀도 OHC 플라즈마 막의 포장 모터 단백질의 전기 구동 conformational 변화에서 파생 마이크로초 범위의 길이 변경, II) 느린 운동성,의 모양 변경 : OHC의 자극은 두 가지 운동성이있는 답변을 유도 초 밀리초는 cytoskeletal 개편 2, 3을 포함하는 범위입니다. OHC 벤딩은 측면 플라즈마 막, 또는 그 모터 단백질 (예를 들어, 세포의 긴 축에 전기 현장 직각 포함) 4 비대칭 전기 자극에서 모터 단백질의 비대칭 분포에서 중 electromotility과 관련된, 그리고 결과입니다. 기계 및 화학적 자극은 세포 및 / 또는 그들의 환경의 이온 조건의 변화 또한 플라즈마 막 - 임베디드 모터 단백질 5, 6을 자극 수 있지만, 본질적으로 느린 운동성이있는 응답을 유도. OHC 운동성이있는 응답 달팽이 앰프의 필수 요소, 음향 주파수 (대략 인간 20 Hz로 20 kHz에서에서)에서 이러한 운동성이있는 반응의 정성 및 정량 분석되기 때문에 연구 7 청각 분야에서 매우 중요한 문제입니다.
고속 videocameras, LED 기반의 조명 시스템, 정교한 이미지 분석 소프트웨어를 결합하여 새로운 이미징 기술의 개발은 이제 외부 교류 전기장 (EAEF)에 안정적인 질적 및 절연 OHCs의 운동성이있는 응답의 양적 연구를 수행할 수있는 기능을 제공합니다 8. 이것은 이전의 접근 9-11의 한계의 대부분을 circumvents 간단하고 비침습 기술입니다. 또한, LED 기반의 조명 시스템은 샘플에 사소한 열 효과를 극도의 밝기를 제공하며, 때문에 비디오 현미경의 사용, 광학 해상도는 기존의 가벼운 현미경 기술 12보다 적어도 10 배 이상이다. 예를 들어, 실험 설치가 여기서 설명과 함께 약 20 NM의 세포 길이의 변화는 일상적으로하고 안정적으로 10 kHz에서의 주파수에서 감지하고,이 해결 방법은 더 낮은 주파수에서 향상시킬 수 있습니다.
우리는이 실험 접근 OHC의 운동성를 기본 세포와 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해를 확장하는 데 도움이됩니다 확신하고 있습니다.
Protocol
1. OHCs의 분리
- 기니 돼지, 마우스 또는 포유류의 동물 모델에서 관자놀이 뼈를 수확하여이 절차를 시작합니다.
- 다음, 달팽이관을 폭로하기 위해 탐문 니퍼를 사용하여 관자놀이 뼈를 열고 Leibovitz L - 15에 젖어. 뼈다귀 쉘 그대로 유지, 신중하게 뼈 초과를 제거합니다. 이 모든 포유 동물 종의 시간적 뼈를에 적용되는 일반적인 절차입니다 반면에 아주 작은 동물로부터 현세의 뼈를을 상대할 때는 기술에 사소한 변화가 필요할 수 있습니다. 오래된 동물 불라는 일반적으로 프로 시저에 추가 합병증을 소개하고, calcified입니다.
- 마이크로 관찰에서 달팽이관의 꼭대기의 영역을 열고 선의 vascularis 및 # 11 메스 블레이드의 끝부분을 사용하여 나선형 인대를 제거 마이크로 지점 선택하고 고급 트위터.
- 트위터를 사용하여 달팽이 modiolus에서 Corti의 오르간을 벗어, 5 분 실온에서 L - 15 1mg/ml collagenase에 넣어.
- 달팽이관의 기저 전환에서 OHCs이 필요한 경우, 선택과 달팽이관의 기반을 덮고있는 뼈다귀 껍질을 제거하고, Corti의 오르간을 제거하기 전에 메스 블레이드를 사용하여 측두 골의 소용돌이를 구분한다.
- 50 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 녹화 실로 Corti의 오르간을 전송합니다. 그 후 바늘을 통해 역류하여 세포를 떼어 놓다.
2. 실험 설정
- 외부 교류 전기장 (EAEF) 발생기와 이미지 캡처 시스템 (그림 1) 자신의 링크 다이어그램. 제어 회로는 특별히 하우스 귀 연구소의 엔지니어링 핵심 구현되었습니다.
- 실험에 사용된 실험 설정은 대체 LED 기반 조명 시스템 Axiovert 135TV 거꾸로 현미경 (자이스 혈구, 손우드, NY)로 구성되어 있습니다 (하이 파워 LED 시스템 - 36AD3500, 광속 기술, 캠벨, CA), 두 전자 micromanipulators (Eppendorf "Patchman", 독일), 켈러 포트에 PC 제어 울트라 고속 Photron Fastcam X 1024 PCI 카메라 (Photron 미국 주식 회사)와 trinocular 포트에 추가 일반 CCD 카메라. Fastcam 카메라는 높은 주파수 (최대 100,000 프레임)와 고해상도 (예를 들어, 1024 X 1024 1000 FPS에서 픽셀, 10,000 프레임, 18000 FPS에서 384 X 96에서 512 X 128 등)에서 이미지를 캡처할 수 있습니다. CCD 카메라가 다른 모니터에 연결되어있는 반면, 고속 카메라에서 제공하는 이미지는 직접 PC 모니터에서 관찰됩니다. 아날로그 저전력 및 높은 전력 디지털 : LED 기반 조명 시스템은 두 개의 서로 다른 모드에서 작동합니다. 모든 예비 절차 (전극의 위치, 세포 위치, 초점 등)은 저전력 아날로그 모드를 사용하여 수행됩니다. 높은 전력 조명은 카메라 셔터의 조리개에 의해 전환 후 방열을 촉진, 셔터 폐쇄에 의해 꺼져 있습니다. 또한, 동일한 PC에서 실행, 하우스 이어 연구소 공학 코어에서 개발된 만든 소프트웨어는, 고속 카메라, LED 기반 조명 시스템 및 EAEF의 방아쇠를 제어합니다. 전면 포트에 종래의 디지털 카메라는 필요에 따라 여전히 프레임 수 있습니다. (그림 2 A).
- 전극 (0.8 mm의 팁 거리 두 개의 0.25 mm 지름 자세 와이어)은 전자 micromanipulators 중 하나를 사용하여 위치를 주도하고 있습니다. 전극들의 위치는 시각과 미세한 이미지를 통해 모니터링되며 이미지의 초점 평면의 변화는 전극이 실험 챔버의 바닥을 만진 것을 나타냅니다. 처음에는, 전기 분야는 외부 전극을 사용하여 보정합니다. 이 전극은 전기 분야의 "지도"를 생성, 다른 지점에서 전위를 측정합니다. 단일 절연 외부 머리카락 세포가 적용 EAEF하기 위해 세로 축 평행으로 전극의 팁 사이에 위치하는 경우, 그것은 elongating과 전기장의 동일한 주파수로 단축 이동합니다. 세포가 필드에 수직 배치하는 경우 OHC 응답 (휨)의 다른 종류의 관찰과 조사 수 있습니다. (그림 2 B)
3. EAEF의 자극 및 이미지 캡처
- 네 가지 자극 프로토콜은 (그림 3) 선택됩니다
- 지속적인 단일 주파수 (그림 3 A). 자극 모드, 주파수, 진폭 및 파도 유형이 집에서 만든 제어 소프트웨어 (빨간 동그라미)를 사용하여 선택할 수 있습니다.
- bursted 단일 주파수 (그림 3 B). 버스트 사이의 파열 및 공백의 길이도 선택할 수 있습니다.
- 선형 스위프 (그림 3 C). 초기 및 최종 주파수는 선택할 수 있습니다.
- 멀티 자극 (그림 3 D). 단일 주파수 및 선형 지나간다는 하나의 실험에서 조합하여 사용할 수 있습니다. 해당 매개 변수를 선택한 후, 컨트롤 소프트웨어는 시스템을 구성하고 연산자에서 하나의 버튼을 클릭하여 가벼운 동기화 비디오 녹화 및 세포 자극을 시작하실 수 있습니다컴퓨터 화면.
- 이미지는 높은 주파수에서 추가 분석을 위해 AVI 형식으로 캡처됩니다.
4. 대표 결과
- 이 영화에 두 개의 분리된 바깥쪽 세포는 종축에, 그들이 병렬 또는 횡단하는 것입니다 외부 교류 전기 분야, 각각과 자극을 받고있는 길이 또는 곡률의 변화를 보여줍니다. (동영상 # 2).
- OHCs 운동성이있는 응답 ProAnalyst 소프트웨어 (Xcitex 주식 회사, 캠브리지, MA)를 사용하여 라인을 분석하고 있습니다. 이 소프트웨어에서 "기능 추적"기능은 두 지점 프레임으로 프레임 (그림 4) 사이의 거리를 제공합니다. 그리고 세포 (기저 극, 녹색)의 기본, 꼭대기 (붉은 색 Cuticular 판)에서 선택된 지점 사이의 거리를 단축 셀 동안 작고이며, 세포 연신율과 함께 증가합니다. 영화는 프레임간에게 길이의 변화를 분석하는 소프트웨어를 보여줍니다. 이미지의 하단에있는 패널은 운동의 흔적을 보여줍니다. 이 예제에서는 길이의 전체 변화는 6.5 픽셀에 대해서입니다.
- ProAnalyst 소프트웨어에서 "컨투어 추적"기능은 셀 가장자리를 감지하고 자동으로 광학과 (그림 5)의 영역을 측정할 수 있습니다.
- 폴리스티렌 microspheres 무작위로 목욕 솔루션에 추가되고 단단히 플라즈마 막 (그림 6)에 첨부합니다. 다른 microspheres 동시에 선택할 수 있으며, 소프트웨어가 자동으로 모두 프레임으로 프레임을 추적할 수 있습니다. 이러한 방법으로, 세포는 섹션에 나누어 각 섹션의 운동성 독립적으로 평가할 수있다. (그림 6)
- 선택하여 microspheres은 셀 이미지의 측면 가장자리에 위치하고, 각 세그먼트의 길이 변화와 하나의 세그먼트 존중의 각도 변경 (벤딩) 기타도 독립적으로 평가할 수있다. (그림 6B)
그림 1. EAEF 생성기 및 이미지 캡처 시스템과 함께 해당 링크 다이어그램.
실험 설정의 그림 2.) 그림. 전극과 하나의 OHC 전기 필드의 세로 축 병렬로 그들 사이에 위치를 묘사 만화로 현미경 단계의 B) 세부.
그림 3. 단일 주파수 자극에 대해 구성된 수제 제어 소프트웨어의) 사용자 인터페이스를 제공합니다. 선택한 매개 변수는 빨간색으로 동그라미 있습니다. B) 집에서 만든 제어 소프트웨어의 사용자 인터페이스는 버스트 단일 주파수 자극에 대한 구성. 선형 스위프 자극에 대해 구성된 집에서 만든 제어 소프트웨어의 C) 사용자 인터페이스를 제공합니다. 멀티 자극에 대해 구성된 수제 제어 소프트웨어의 D) 사용자 인터페이스를 제공합니다.
그림 4. 기본 (녹색)과 ProAnalyst 소프트웨어의 '기능 추적 "기능을 이용하여 각각의 셀,의 꼭대기 (적색)에서 선택한 두 지점과 OHC의 싱글 프레임. 세포 아래의 곡선은 전기 자극과 관련된 선택된 지점 사이의 거리에있는 정기적인 변화를 보여줍니다. 수직 막대 다른 프레임을 이동하는 것은 개별적인 분석을 위해 선택할 수 있습니다.
그림 5. ProAnalyst의 "컨투어 추적"기능은 셀 가장자리를 감지하고 자동으로 광학 부분의 영역을 측정합니다.
그림 6. 폴리스티렌 microspheres (위) 및 microspheres 개별적으로 (아래)을 선택 5가 동일한 이미지로 장식된 격리 OHC의) 캡처한 이미지. 다른 색상은 각 microsphere에 할당되었고, 그들의 변위는 개별적으로 자동으로 프레임에서 추적 프레임 수, 분석 및 비교. B) 임의의 길이의 세그먼트 microspheres은 세포의 가장자리에 위치한 폴리스티렌을 선택하여 정의될 수 있으며,이 세그먼트의 길이의 변화뿐만 아니라 다른 하나의 세그먼트 존중의 방향 변경 (세포 굽힘) 자동으로 프레임을 평가할 수 이미지 분석 소프트웨어 프레임.
영화 1. 실험용 돼지 OHCs의 격리가. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
영화 2. 전형적인 electromotility과 굽힘 반응을 보여주는 EAEF에 OHCs의 평행과 수직이. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오
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Discussion
여기에 제시 실험 방법은 세포의 움직임에 어떤 제한없이 kHz에서 범위에서 OHC 운동성이있는 응답을 추정 수 있습니다. 다른 자극 프로토콜, 추가적인 마커 (microspheres)은 전기장에 대하여 세포의 방향에 잘 변화로, 그것이 가능한 이전에 액세스할 세부 수준 OHC의 운동성의 새로운 측면을 조사합니다. 다른 방법은, 예를 들어 photodiodes 9 레이저 도플러 vibrometry 10을 사용 이들은 세포의 위치를 꽉 컨트롤을 필요로합니다. 여기, 반대로 모든 측정은 동일한 세포에 속한 지점 사이에 수행하고 있으며, 모든 배기량은 세포 모양이 아닌 참조의 외부 프레임과 관련하여 자신의 운동과 변화에 연결되어 있습니다. 횡단면 OHC 지역의 안정적인 측정도 쉽게 OHC 볼륨의 빠른 변화의 추정을 허용하는, 얻을 수 있습니다. 또한,보다 빠르고 민감한 카메라와 더 나은 이미지 분석 소프트웨어의 지속적인 개발이 메서드의 품질의 지속적인 향상을 보장합니다. 기술, 플라즈마 막 전체의 전위에 조종간의 단점은 kHz에서 범위에서 OHC의 운동성을 평가하는 데 사용되는 모든 현재의 방법으로 공유되는 제한 사항입니다.
따라서 여기에 설명된 방법은 OHCs '운동성이있는 답변을 기본 세포와 분자 메커니즘에 대한 새로운 중요한 단서를 제공할 수있는 연구를 듣기위한 중요한 도구가 될 수 있습니다
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
건강 그란츠 R01DC10146/R01DC010397 국립 연구소에 의해 지원 작품, P30 DC006276 연구 코어를 NIDCD하고, 헤리. 그 내용은 저자의 단독 책임이며 반드시 NIH 또는 헤리의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 관심에 대한 기존 또는 잠재 갈등을 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
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