Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

Summary

Um método confiável para investigar células ciliadas externas (CCE) respostas móveis, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão, é descrito. Motilidade das CCE é eliciada pela estimulação com um campo elétrico externo alternada, eo método tira proveito da alta velocidade de gravação de imagem, baseada em LED, iluminação e de última geração de software de análise de imagem.

Abstract

CCE são células cilíndricas sensório-motor localizado no órgão de Corti, o órgão auditivo dentro do ouvido dos mamíferos interior. O nome de "células ciliadas" deriva do seu pacote característica apical de estereocílios, um elemento crítico para a detecção e transdução de energia sonora ^1. CCE são capazes de mudar de forma-alongado, encurtar e dobre-em resposta à estimulação elétrica, mecânica e química, uma resposta motora considerada crucial para a amplificação coclear dos sinais acústicos ^2.

Estimulação OHC induz duas diferentes respostas motile: i) eletromotilidade, motilidade rápida aka, mudanças no comprimento na faixa de microssegundos derivados com motor eléctrico mudanças conformacionais em proteínas motoras densamente no OHC membrana plasmática, e ii) a motilidade lenta, muda de forma no milissegundos para segundos gama envolvendo reorganização do citoesqueleto ^{2, 3.} OHC de flexão é associado com eletromotilidade, e resultar tanto de uma distribuição assimétrica de proteínas motoras na membrana plasmática lateral, ou estimulação elétrica assimétrica dessas proteínas motoras (por exemplo, com um campo elétrico perpendicular ao eixo longitudinal das células) ^4. Estímulos mecânicos e químicos induzem essencialmente lento respostas móveis, mesmo que as mudanças nas condições iônica das células e / ou seu ambiente também podem estimular a membrana plasmática-embedded do motor proteínas ^{5, 6.} Desde respostas OHC móveis são um componente essencial do amplificador coclear, a análise qualitativa e quantitativa dessas respostas móveis em freqüências acústicas (cerca de 20 Hz a 20 kHz em humanos) é um assunto muito importante no campo da audição investigação ^7.

O desenvolvimento da nova tecnologia de imagem que combina alta velocidade câmeras de vídeo, sistemas baseados em LEDs de iluminação, e software de análise sofisticada imagem agora fornece a capacidade de executar qualitativa confiável e estudos quantitativos da resposta móveis de CCEs isolado a um campo elétrico externo alternada (EAEF) ^8. Esta é uma técnica simples e não invasivo, que contorna a maioria das limitações das abordagens anteriores ^9-11. Além disso, o sistema de iluminação baseada em LED proporciona brilho extremo com insignificantes efeitos térmicos nas amostras e, por causa do uso de microscopia de vídeo, resolução óptica é de pelo menos 10 vezes maior do que com as técnicas convencionais de microscopia de luz ^12. Por exemplo, com a configuração experimental descrito aqui, mudanças no comprimento das células de cerca de 20 nm pode ser rotineiramente e de forma confiável detectados em freqüências de 10 kHz, e esta resolução pode ser melhorada em freqüências mais baixas.

Estamos confiantes de que essa abordagem experimental ajudará a ampliar nossa compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes a motilidade das CCE.

Protocol

1. Isolamento de CCE

1. Iniciar este procedimento colhendo ossos temporais de cobaias, ratos ou o seu modelo de mamíferos.
2. Em seguida, abra os ossos temporais usando uma pinça martelo, a fim de expor a cóclea, e mergulha-as na Leibovitz L-15. Remover o excesso de osso com cuidado, mantendo a casca óssea intacta. Considerando que este é um procedimento geral aplicável aos ossos temporais de qualquer espécie de mamíferos, pequenas mudanças com a técnica pode ser necessária quando se lida com ossos de animais muito pequenos. Em animais velhos a bula é geralmente calcificada, introduzindo uma complicação adicional ao procedimento.
3. Sob observação microscópica, abrir a região apical da cóclea e remover estria vascular e ligamento espiral com a ponta de uma lâmina de bisturi # 11, um ponto de micro e pegar uma pinça fina.
4. Leve o Órgão de Corti fora do modíolo coclear usando a pinça, e colocá-lo em colagenase 1mg/ml em L-15 em temperatura ambiente por 5 min.
5. Se CCEs do giro basal da cóclea são necessários, retire a casca óssea cobrindo a base da cóclea com a picareta, e separar a espiral a partir do osso temporal usando a lâmina de bisturi antes de remover o órgão de Corti.
6. Transferir o órgão de Corti para a câmara de gravação usando uma seringa de 50 mL Hamilton. Depois, as células se dissociam pelo refluxo através da agulha.

2. Instalação Experimental

1. Diagrama do gerador de campo elétrico externo alternada (EAEF) e suas ligações com o sistema de captação de imagem (Fig. 1). O circuito de controle foi especialmente implementado no Núcleo de Engenharia do House Ear Institute.
2. A configuração experimental utilizada em nossos experimentos consiste de um microscópio 135TV Axiovert invertido (Zeiss, Thornwood, NY) com um sistema de iluminação alternativa baseada em LED (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), dois micromanipuladores eletrônico (Eppendorf "PatchMan", Alemanha), um PC ultra-controlado de alta velocidade Photron FASTCAM X 1024 PCI da câmera (Photron EUA Inc.) no porto Keller e uma câmera CCD adicionais regulares no porto trinocular. A câmera FASTCAM é capaz de capturar imagens em altas freqüências (até 100.000 fps) e alta resolução (por exemplo, 1024 x 1024 pixels a 1000 fps, 512 x 128, 10.000 fps, 384 x 96 em 18.000 fps, e assim por diante). As imagens fornecidas pela câmera de alta velocidade são diretamente observados no monitor de PC, enquanto a câmera CCD está conectado a um monitor diferente. O sistema de iluminação baseada em LED funciona em dois modos diferentes: analógico de baixa potência e alta potência digital. Todos os procedimentos preliminares (posicionamento de eletrodos, posicionamento de célula, foco, etc) são realizadas usando o modo de baixa potência analógico. A iluminação de alta potência é ligado pela abertura do obturador da câmera e, então, desligado pelo fechamento do obturador, facilitando a dissipação de calor. Software caseiro, também desenvolvido no Instituto House Ear Núcleo de Engenharia, em execução no PC mesmo controla o disparo da câmera de alta velocidade, o sistema de iluminação baseados em LEDs, e as EAEF. Uma câmera de foto digital convencional na porta frontal permite ainda os quadros conforme necessário. (Fig. 2 A).
3. Eletrodos (dois fios 0,25 mm de diâmetro-Ag com a distância da ponta de 0,8 mm) são levados a posição usando um dos micromanipuladores eletrônicos. Posição eletrodos é monitorada visualmente e por meio da imagem microscópica; uma mudança no plano focal da imagem indica que os eletrodos tocou o fundo da câmara experimental. Inicialmente, o campo elétrico é calibrado usando um eletrodo externo. Este eletrodo mede o potencial elétrico em pontos diferentes, gerando um "mapa" do campo elétrico. Se uma célula do cabelo isolado exterior é colocado entre as pontas dos eletrodos com o seu paralelo eixo longitudinal ao EAEF aplicado, ele se moverá alongamento e encurtamento na mesma freqüência do campo elétrico. Se a célula é colocado perpendicular ao campo um tipo diferente de resposta OHC (flexão) podem ser observados e investigados. (Fig. 2 B)

3. EAEF estimulação e captação de imagem

1. Quatro diferentes protocolos de estimulação são selecionáveis ​​(Fig. 3):
   1. freqüência única e contínua (Fig. 3 A). Note-se que tipo de modo de estímulo, freqüência, amplitude e onda pode ser selecionado usando o home-made software de controle (círculos vermelhos).
   2. única freqüência bursted (Fig. 3 B). O comprimento das explosões e as lacunas entre estourou também são selecionáveis.
   3. linear de varredura (Fig. 3 C). As freqüências inicial e final são selecionáveis.
   4. múltiplas-estimulação (Fig. 3 D). Freqüência única e varre linear podem ser combinados em um único experimento. Depois de selecionar os parâmetros correspondentes, o software de controle e configura o sistema permite ao operador iniciar-luz de gravação de vídeo sincronizados e estimulação de células, clicando em um único botão notela do computador.
2. As imagens são capturadas em formato AVI, para posterior análise em altas freqüências.

4. Resultados representante

1. Neste filme, dois isolados células ciliadas externas mostram mudanças no comprimento ou curvatura quando estão sendo estimuladas com um campo elétrico externo alternada que é paralela ou transversal, respectivamente, ao seu eixo longitudinal. (Filme # 2).
2. Respostas CCE móveis são analisados ​​off-line utilizando software ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). "Feature Tracking" função neste software fornece a distância entre dois pontos de quadro a quadro (Fig. 4). Durante célula encurtando a distância entre os pontos selecionados no (placa cuticular; cor vermelha) ápice ea base da célula (pólo Basal; cor verde) é menor, e aumenta com o alongamento das células. O filme mostra o software análise quadro a quadro-a mudanças no comprimento. O painel na parte inferior da imagem mostra o traço do movimento. Neste exemplo, a variação total de comprimento é de cerca de 6,5 pixels.
3. "Contour Tracking" função no software ProAnalyst pode detectar automaticamente borda da célula e medir a área da secção óptica (Fig. 5).
4. Microesferas de poliestireno adicionado à solução de banho de forma aleatória e com firmeza anexar à membrana plasmática (Fig. 6 A). Microesferas diferentes podem ser selecionados simultaneamente, eo software pode rastrear automaticamente todos eles quadro a quadro. Desta forma, as células podem ser divididos em seções e da motilidade de cada seção avaliada de forma independente. (Fig. 6 A)
5. Ao selecionar microesferas localizados nas bordas laterais da imagem celular, mudanças no comprimento de cada segmento e as mudanças no ângulo de um segmento que diz respeito a outros (flexão) também pode ser avaliada de forma independente. (Fig. 6B)

Figura 1. Diagrama do gerador EAEF e suas ligações com o sistema de captura de imagem.

Figura 2. Imagem A) da instalação experimental. B) Detalhe da etapa de microscópio, com charges dos eletrodos e um OHC única colocada entre eles com o seu paralelo eixo longitudinal ao campo elétrico.

Figura 3. A interface de usuário) do software de controle caseiro configurado para uma única freqüência de estimulação. Os parâmetros selecionados estão circulados em vermelho. B) interface de usuário da home-made software de controle configurado para estourar única freqüência de estimulação. C) interface de usuário da home-made software de controle configurado para a estimulação de varredura linear. D) interface de usuário do software de controle caseiro configurado para estimulação multi.

Figura 4. Quadro único de um OHC com dois pontos selecionados na base (verde) eo ápice (vermelho) da célula, respectivamente, usando o "recurso de rastreamento" função do software ProAnalyst. A curva abaixo da célula mostra a mudanças periódicas na distância entre os pontos selecionados associados com estimulação elétrica. Movendo a barra vertical frames diferentes podem ser selecionadas para análise individual.

Figura 5. O "Contour Tracking" em função ProAnalyst detecta a borda da célula e automaticamente medir a área da secção óptica.

Figura 6. Uma imagem) Capturado de um OHC isoladas decorados com microesferas de poliestireno (superior), ea mesma imagem com cinco microesferas selecionadas individualmente (em baixo). Uma cor diferente foi designado para cada micro, e seus deslocamentos podem ser individualmente e automaticamente quadro a quadro rastreados, analisados ​​e comparados. B) Segmentos de comprimento arbitrário pode ser definido por escolha de poliestireno microesferas localizados nas bordas da célula, e as alterações no comprimento destes segmentos, bem como alterações na orientação de um segmento que diz respeito aos outros (célula dobra) pode ser automaticamente avaliado quadro a quadro com o software de análise de imagem.

Filme 1. Isolamento de CCEs cobaia. Clique aqui para assistir ao vídeo

Filme 2. CCE paralelas e perpendiculares ao EAEF mostrando eletromotilidade típicos e respostas flexão. Clique aqui para assistir ao vídeo

Discussion

O método experimental aqui apresentado permite estimar respostas OHC móveis na faixa de kHz sem qualquer restrição ao movimento da célula. Protocolos de estimulação diferentes, marcadores adicionais (microesferas), bem como alterações na orientação da célula em relação ao campo elétrico, torná-lo possível investigar novos aspectos da motilidade das CCE, com um nível de detalhes anteriormente inacessíveis. Outros métodos, por exemplo, aqueles que usam fotodiodos ⁹ ou laser Doppler vibrometria ^10, requerem um controle rigoroso da posição da célula. Aqui, ao contrário, todas as medições são realizadas entre os pontos pertencentes à mesma célula, e cada deslocamento está associado apenas com mudanças na forma celular e não com seu movimento em relação a um quadro externo de referência. Medições confiáveis ​​de área transversal OHC também são facilmente obtidos, o que permite uma estimativa de rápidas mudanças no volume de CCE. Além disso, o desenvolvimento contínuo de câmeras mais rápido e mais sensível e software de análise de imagem melhor, garantir uma melhoria contínua da qualidade do método. A desvantagem da técnica, não tem controle sobre o potencial elétrico através da membrana plasmática, é uma limitação compartilhada com todos os métodos atuais usados ​​para avaliar a motilidade OHC na faixa de kHz.

Assim, o método descrito aqui pode ser uma ferramenta importante para a audição de pesquisa, capaz de fornecer pistas novas e importantes sobre os mecanismos celulares e moleculares subjacentes respostas motile CCE "

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15	GIBCO, by Life Technologies	21083
Collagenase (Type 4)	Sigma-Aldrich	C5138	1mg/mL in L-15