Summary
En tillförlitlig metod för att undersöka yttre hårceller (OHC) rörliga svar, inklusive electromotility, långsam motilitet och bockning, beskrivs. OHC motilitet utlöses genom stimulering med en extern växlande elektriskt fält, och metoden drar fördel av hög hastighet bild inspelning, LED-baserad belysning, och sista generationen bildanalys programvara.
Abstract
OHCs är cylindriska sensomotoriska celler som finns i organ Corti, det auditiva orgeln inuti däggdjur innerörat. Namnet "hårcellerna" härstammar från deras karakteristiska apikala bunt av sinneshår ett kritiskt element för att upptäcka och transduktion av ljud energi 1. OHCs kan ändra form-elongate, förkorta och böj-som svar på elektriska, mekaniska och kemiska stimulering, anses vara en motor respons avgörande för cochlea förstärkning av akustiska signaler 2.
OHC stimulering framkallar två olika rörliga svar: i) electromotility, alias snabba rörlighet, förändringar i längd i mikrosekunder intervallet från eldrivna konformationsändringar i motorproteiner tätt packade i OHC plasmamembran, och ii) långsamma motilitet, form förändringar i millisekund till sekunder utbud med cytoskelettala omorganisation 2, 3. OHC bockning förknippas med electromotility och resultera antingen från en asymmetrisk fördelning av motor proteiner i sidled plasmamembranet, eller asymmetrisk elektrisk stimulering av dessa motorproteiner (t.ex. med ett elektriskt fält vinkelrätt mot den långa axeln av cellerna) 4. Mekaniska och kemiska stimuli framkalla huvudsak långsamma rörliga svar, även om förändringar i den joniska villkor av cellerna och / eller deras omgivning också kan stimulera plasmamembranet-inbäddade motorproteiner 5, 6. Sedan OHC rörliga svar är en viktig del av Cochlear förstärkaren, den kvalitativa och kvantitativa analysen av dessa rörliga svaren på akustiska frekvenser (ungefär från 20 Hz till 20 kHz i människor) är en mycket viktig fråga inom området hörsel forskning 7.
Utvecklingen av ny bildteknik som kombinerar hög hastighet Videokameror, LED-baserade system belysning, och sofistikerad bildanalys programvara ger nu möjlighet att göra tillförlitliga kvalitativa och kvantitativa studier av rörliga svar av isolerade OHCs till en extern alternerande elektriskt fält (EAEF) 8. Detta är en enkel och icke-invasiv teknik som kringgår de flesta av de begränsningar som tidigare metoder 9-11. Dessutom ger LED-baserad belysning systemet extrem ljusstyrka med obetydliga termiska effekter på prover och, på grund av användningen av video mikroskopi, är optisk upplösning på minst 10-faldigt högre än med konventionell ljusmikroskopi tekniker 12. Till exempel med experimentuppställning beskrivs här, kan förändringar i cellernas längd av ca 20 nm rutinmässigt och tillförlitligt upptäcks vid frekvenser på 10 kHz, och denna resolution kan förbättras ytterligare vid lägre frekvenser.
Vi är övertygade om att detta experiment bidrar det till att utöka vår förståelse av de cellulära och molekylära mekanismerna bakom OHC motilitet.
Protocol
1. Isolering av OHCs
- Börja här proceduren genom att skörda temporal ben från marsvin, möss eller din däggdjur djurmodell.
- Öppna sedan den temporala benen med hjälp av en Malleus avbitartång för att avslöja snäckan, och sänk ner dem i Leibovitz L-15. Ta bort ben överskott försiktigt, hålla beniga skal intakt. Detta är ett allmänt förfarande som gäller för temporal ben av däggdjur, kan smärre ändringar i tekniken vara nödvändig när det handlar om tidsmässiga ben från mycket små djur. I gamla djur bulla är oftast förkalkade, införa ytterligare en komplikation till ingreppet.
- Enligt mikroskopiska observationer, öppna apikala regionen av snäckan och ta bort stria vascularis och spiral ligament hjälp av spetsen på en # 11 skalpell blad, en mikro punkt plocka och en fin pincett.
- Ta organ Corti off från Cochlear modiolus med pincett, och placera den i 1mg/ml kollagenas i L-15 i rumstemperatur i 5 minuter.
- Om OHCs från basal varv på hörselsnäckan behövs, ta bort den beniga skal som täcker botten på hörselsnäckan med hackan, och separera spiral från tinningbenet med skalpell blad innan du tar bort organ Corti.
- Överför organ Corti till inspelningen kammaren med 50 mikroliter Hamilton spruta. Efteråt särskilja cellerna av återflöde genom nålen.
2. Experimentuppställning
- Diagram över den externa Alternerande elektriska fältet (EAEF) generator och deras förbindelser med Bildinsamling system (Fig. 1). Kontrollen kretsar är speciellt genomföras på Engineering Kärnan i House Ear Institute.
- Den experimentuppställning används i våra experiment består av en Axiovert 135TV inverterat mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) med en alternativ LED-belysning system (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), två elektroniska micromanipulators (Eppendorf "Patchman", Tyskland), en PC-styrd ultrahög hastighet Photron Fastcam X 1024 PCI-kamera (Photron USA Inc.) i Keller-port och en extra ordinarie CCD-kamera i Trinokulärt hamnen. Den Fastcam kameran kan ta bilder vid höga frekvenser (upp till 100.000 bps) och hög upplösning (t.ex. 1024 x 1024 bildpunkter vid 1000 bps, 512 x 128 vid 10000 bps, 384 x 96 på 18.000 fps, och så vidare). De bilder som tillhandahålls av höghastighetskamera direkt kan observeras i PC-skärm, medan CCD-kameran är ansluten till en annan bildskärm. Den LED-baserade belysning fungerar i två olika lägen: låg effekt analog och hög effekt digitala. Alla preliminära förfaranden (elektroder positionering, cell positionering, fokus, etc) görs med lågenergi-analog-läge. Den hög effekt belysning sätts på med bländaren på kamerans slutare och sedan stängas av slutare stängning, vilket underlättar värmeavledning. Hemmagjord programvara, också utvecklats på House Ear Institute Engineering Core, som körs på samma dator kontrollerar in avtryckaren på höghastighetskamera, LED-baserade belysning system och EAEF. En konventionell digitalkamera i fronten hamnen tillåter fortfarande ramar som behövs. (Fig. 2 A).
- Elektroder (två 0,25 mm diameter Ag ledningar med spets avstånd på 0,8 mm) drivs att positionera med en av den elektroniska micromanipulators. Elektroder ställning övervakas visuellt och genom den mikroskopiska bilden, en förändring i fokalplan bilden indikerar att elektroderna rörde botten av experimentella kammaren. Inledningsvis är det elektriska fältet kalibreras med hjälp av en extern elektrod. Denna elektrod mäter den elektriska potentialen på olika ställen, vilket genererar en "karta" över det elektriska fältet. Om en enda isolerad yttre hårceller är placerad mellan de tips av elektroderna med sin längsgående axel parallell med tillämpad EAEF kommer den att flytta vid förlängning och förkortning på samma frekvens för det elektriska fältet. Om cellen är placerad vinkelrätt mot fältet en annan typ av OHC svar (böjning) kan observeras och undersökas. (Fig. 2 B)
3. EAEF stimulans och bildtagning
- Fyra olika stimuleringsprotokoll är valbara (Fig. 3):
- kontinuerlig enda frekvens (Figur 3 A). Observera att stimulans-läge, frekvens, amplitud och våg typ kan väljas med hemgjord styrprogram (röda cirklar).
- sprack enda frekvens (bild 3 B). Längden på brister och luckor mellan brast också väljas.
- linjär sopa (Fig. 3 C). Den inledande och avslutande frekvenser kan väljas.
- multi-stimulering (Fig. 3 D). Enda frekvens och linjära sveper kan kombineras i ett enda experiment. När du har valt motsvarande parametrar, konfigurerar styrprogram systemet och ger operatören möjlighet att inleda ljus synkroniserad videoinspelning och cell stimulering genom att klicka på en enda knapp idatorskärmen.
- Bilderna är tagna i AVI-format för vidare analys vid höga frekvenser.
4. Representativa resultat
- I denna film, två isolerade yttre hårcellerna visar förändringar i längd eller kurvatur när de stimuleras med en extern växlande elektriskt fält som är parallellt eller tvärgående, respektive att deras längdaxel. (Film # 2).
- OHCs rörliga svaren analyseras off-line med hjälp av ProAnalyst programvara (Xcitex Inc., Cambridge, MA). "Feature Tracking" funktion i denna programvara ger avståndet mellan två punkter bildruta-för-ruta (bild 4). Under cell förkorta avståndet mellan punkter som valts i toppen (Cuticular plattan, röd färg) och basen av cellen (Basal polen, grön färg) är mindre, och ökar med cell töjning. Filmen visar programmet att analysera bildruta för bildruta förändringarna i längd. Panelen längst ned i bilden visar spår av rörelsen. I detta exempel är den totala förändringen i längd ca 6,5 pixlar.
- "Contour Tracking" funktion i ProAnalyst programvara kan upptäcka cellkanten och automatiskt mäter den del av optiska delen (bild 5).
- Polystyren mikrosfärer läggs till badet lösningen slumpmässigt och fast fäster vid plasmamembranet (bild 6 A). Olika mikrosfärer kan väljas samtidigt, och programmet kan automatiskt spåra alla dem ruta för ruta. På detta sätt kan cellerna delas upp i sektioner och motilitet av varje avsnitt beräknas individuellt. (Bild 6 A)
- Genom att välja mikrosfärer ligger på sidokanter cellen bilden, andra (böjning) förändringar i längden på varje segment och förändringar i vinkel på ett segment avseende kan också självständigt utvärderas. (Fig. 6B)
Figur 1. Diagram av EAEF generator och deras förbindelser med Bildinsamling systemet.
Figur 2. A) Bild på experiment. B) Detalj av mikroskop scenen, med teckningar föreställande elektroderna och en enda överliggande kamaxel placeras mellan dem med sin längsgående axel parallell med det elektriska fältet.
Figur 3. A) Användargränssnitt för hemgjorda styrprogram konfigurerad för enskilda frekvenser stimulans. De valda parametrarna är inringad i rött. B) Användargränssnitt för hemmagjorda styrprogram konfigurerad för burst enskilda frekvenser stimulans. C) Användargränssnitt för hemmagjorda styrprogram konfigurerad för Linear svep stimulering. D) Användargränssnitt för hemgjorda styrprogram konfigureras för multi-stimulering.
Figur 4. Enkelbild av en OHC med två punkter som valts vid basen (grön) och spetsen (rött) i cellen, respektive, med hjälp av "Feature tracking" funktion ProAnalyst programvara. Kurvan nedan cellen visar det periodiska förändringar i avståndet mellan de valda punkterna i samband med elektrisk stimulering. Flytta lodrätt streck olika ramar kan väljas för enskilda analyser.
Figur 5. "Contour Tracking" funktion i ProAnalyst upptäcker cellkanten och automatiskt mäter den del av optiska avsnitt.
Figur 6. A) tagen bild av en isolerad OHC dekorerad med polystyren mikrosfärer (överst) och samma bild med fem mikrosfärer individuellt valda (botten). En annan färg skulle tilldelas varje mikrosfär, och deras förskjutningar kan individuellt och automatiskt spåras ruta för ruta, analyseras och jämföras. B) segment av godtycklig längd kan definieras genom att välja polystyren mikrosfärer sitter på kanten av cellen, och förändringar i längden på dessa segment, liksom förändringar i inriktningen på ett segment respekt för andra (cell böjning) kan utvärderas automatiskt ramen med ram med bilden analysprogram.
Film 1. Isolering av marsvin OHCs. Klicka här för att se på video
Film 2. OHCs parallellt och vinkelrätt mot EAEF visar typiska electromotility och bockning svar. Klicka här för att se på video
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den experimentella metoden som presenteras här kan uppskatta OHC rörliga svar i kHz intervall utan några begränsningar till cellens rörelse. Olika stimuleringsprotokoll, extra markörer (mikrosfärer), liksom förändringar i inriktningen av cellen med hänsyn till det elektriska fältet, gör det möjligt att undersöka nya aspekter av OHC motilitet med en detaljnivå som tidigare otillgängliga. Andra metoder, t.ex. de som använder fotodioder 9 eller laser Doppler vibrometry 10, kräver en strikt kontroll av positionen för cellen. Här, däremot, är alla mätningar som utförts mellan punkter som hör till samma cell, och varje förflyttning är bara förknippad med förändringar i cellernas form och inte med deras rörelser i förhållande till en extern referensram. Tillförlitliga mätningar av tvärsnittsarea OHC området är också lätt erhållas, vilket möjliggör en uppskattning av snabba förändringar i OHC volym. Dessutom en kontinuerlig utveckling av snabbare och känsligare kameror och bättre bildanalys mjukvara, garanterar en kontinuerlig förbättring av kvaliteten på metoden. En nackdel med tekniken, ingen kontroll på den elektriska potentialen över membranet, är en begränsning delas med alla de nuvarande metoderna för att utvärdera OHC motilitet i kHz.
Således kan den metod som beskrivs här vara ett viktigt verktyg för hörsel forskning kan ge nya och viktiga ledtrådar om de cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom OHCs "rörliga svar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet stöds av National Institutes of Health bidrag R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Forskning Core och högskolan. Dess innehåll är ensamt ansvarig för författare och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter NIH eller högskolan. Författarna förklarar ingen befintlig eller potentiell intressekonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).
