Summary
Electromotility, yavaş motilite ve eğilme gibi dış tüy hücresi (OHC) hareketli yanıtları, araştırmak için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. OHC motilite harici bir alternatif elektrik alan stimülasyonu ile ve yöntemi, yüksek hızlı görüntü kaydı, LED tabanlı aydınlatma, ve son nesil görüntü analiz yazılımı yararlanır.
Abstract
OHCs Corti, memelilerin iç kulak içindeki işitme organı Organ bulunan silindirik sensorimotor hücreleri vardır. "Kıl hücreleri" adı stereocilia, 1 ses enerjisi algılama ve iletilmesi için kritik bir unsur kendi karakteristik apikal paket türemiştir. OHCs değiştirmek mümkün şekil uzatmak, kısaltmak ve viraj, elektrik, mekanik ve kimyasal stimülasyon yanıt, bir motor yanıt koklear akustik sinyal amplifikasyon 2 için çok önemli kabul.
I) electromotility aka hızlı motilite, yoğun OHC plazma zarı paketlenmiş motor proteinlerin Elektrikle çalışan yapı değişiklikleri türetilen mikrosaniye aralığında uzunluğu ve ii) yavaş motilite, şekil değişiklikleri: OHC stimülasyon iki farklı hareketli yanıtları indükler saniye milisaniye sitoskeletal reorganizasyon 2, 3 içeren değişir. OHC bükme lateral plazma zarı, ya da bu motor protein (örneğin, bir elektrik alanı dik hücrelerin uzun ekseni) 4 asimetrik elektrik stimülasyonu motor proteinlerin asimetrik bir dağılım ya electromotility ile ilişkili ve sonucudur . Mekanik ve kimyasal uyaranlara hücre ve / veya çevreleri iyonik koşullarında değişiklikler de plazma zarı gömülü motor proteinleri 5, 6 uyarabilir olsa bile, aslında yavaş hareketli tepkileri neden olur. OHC hareketli yanıtları koklear amplifikatör önemli bir bileşeni olduğundan, akustik frekansları insanlarda 20 Hz - 20 kHz (kabaca) bu hareketli yanıtları kalitatif ve kantitatif analiz, araştırma 7 işitme alanında çok önemli bir konudur.
Yüksek hızda videocameras, LED tabanlı aydınlatma sistemleri ve gelişmiş görüntü analizi yazılımı birleştirerek yeni bir görüntüleme teknolojisi gelişimi, şimdi harici bir alternatif elektrik alanı (EAEF) izole OHCs hareketli yanıt güvenilir nitel ve nicel çalışmalar gerçekleştirmek için yeteneği sağlar 8. Bu önceki yaklaşımlar 9-11 sınırlamaları en circumvents basit ve non-invaziv bir tekniktir . Ayrıca, LED tabanlı aydınlatma sistemi, numuneler üzerinde önemsiz termal etkileri ile aşırı parlaklık sağlar, çünkü video mikroskopi, optik çözünürlük, geleneksel ışık mikroskobu teknikleri 12 ile daha en az 10 kat daha yüksek. Örneğin, deney düzeneği Burada anlatılan, yaklaşık 20 nm hücre uzunluğunda değişiklikler ile rutin ve güvenilir bir şekilde 10 kHz frekansları tespit ve bu kararın daha düşük frekanslarda daha iyi olabilir.
Biz bu deneysel yaklaşım OHC motilite altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları anlayışımız uzatmak için yardımcı olacağına eminiz.
Protocol
1. OHCs, izolasyon
- Kobay, fare ya da memeli hayvan modeli temporal kemikler hasat bu yordamı başlayın.
- Sonra, temporal kemikler koklea göstermek için bir malleus tokatlama kullanarak açın ve Leibovitz L-15 batırmayın. Kemik kabuk sağlam tutmak, kemik aşan dikkatlice çıkarın. Bu herhangi bir memeli türlerinin zamansal kemikler için geçerli genel bir prosedür olduğunu dikkate alarak çok küçük hayvanlardan elde edilen temporal kemikler ile uğraşırken, tekniği küçük değişiklikler gerekebilir. Eski hayvanlarda bül genellikle işlem için ek bir komplikasyon tanıtan, kalsifiye.
- Mikroskobik gözlem altında, koklea apikal bölgenin stria vascularis ve spiral ligament # 11 neşter bıçak ucu kullanarak açın ve çıkarın, mikro noktası almak ve ince bir cımbız.
- Cımbız kullanarak koklear modiolus Corti Organ çıkartın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca L-15 1mg/ml kollajenaz koyun.
- Koklea bazal döner OHCs gerekmesi durumunda, seçim ile kokleanın tabanını kaplayan kemiksi bir kabuk kaldırmak ve Corti Organ çıkarmadan önce neşter bıçak kullanarak temporal kemik spiral ayrı.
- 50 mcL Hamilton şırınga kullanarak kayıt odasına Corti Organ aktarın. Daha sonra, iğne ile reflü hücreleri ayrıştırmaları.
2. Deneysel Kurulum
- Dış Alternatif Elektrik Alan (EAEF) jeneratör ve görüntü yakalama sistemi (Şekil 1) ile bağlantılar diyagramı. Kontrol devresi House Kulak Enstitüsü Mühendislik Çekirdeği özel hayata geçirildi.
- Deneylerde kullanılan deney düzeneği alternatif bir LED tabanlı aydınlatma sistemi ile Axiovert 135TV inverted mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) oluşur (High Power LED Sistemi-36AD3500, Lightspeed Teknolojileri, Campbell, CA), iki elektronik mikromanipülatörler (Eppendorf "PatchMan", Almanya), Keller portu PC kontrollü bir ultra-yüksek hızlı Photron Fastcam X 1024 PCI kamera (Photron USA Inc) ve trinoküler liman, ek bir düzenli CCD kamera. Fastcam kamera görüntüleri, yüksek frekansları (100.000 fps'ye kadar) ve yüksek çözünürlüklü (örneğin, 1000 fps'de 1024 x 1024 piksel, 10.000 fps, 384 x 96 18.000 fps hızda 512 x 128, vb.) Yakalamak mümkün. CCD kamera farklı bir monitöre bağlı ise, yüksek hızlı kamera tarafından sağlanan görüntüleri doğrudan PC monitörü görülmektedir. Analog düşük güç tüketimi ve yüksek güç dijital LED tabanlı aydınlatma sistemi, iki farklı modda çalışır. Düşük güç analog modu kullanarak tüm ön işlemleri (elektrotlar konumlandırma, hücre konumlandırma, odak, vb.) Yapılmaktadır. Yüksek güç aydınlatma, kamera deklanşör diyafram açık ve daha sonra ısı dağılımını kolaylaştırmak, deklanşör kapatarak kapalı. Ev yapımı yazılım, aynı zamanda, aynı bilgisayarda çalışan House Kulak Enstitüsü Mühendislik Çekirdeği geliştirilen yüksek hızlı kamera, LED tabanlı aydınlatma sistemi, ve EAEF tetikleyici kontrol eder. Ön liman geleneksel dijital fotoğraf makinesi hala gerektiği gibi çerçeveler için izin verir. (Şekil 2).
- Elektrotlar (iki ucu 0.8 mm mesafe ile 0.25 mm çapında Ag teller) elektronik mikromanipülatörler birini kullanarak pozisyon için tahrik edilmektedir. Elektrotlar 'konumunu görsel ve mikroskobik görüntü aracılığıyla izlenir; görüntünün odak düzlemli bir değişiklik elektrotlar deney odasının alt dokundu belirtir. Başlangıçta, elektriksel alan, harici bir elektrot kullanılarak kalibre edilir. Bu elektrot elektrik alanında bir "harita" üreten, farklı noktalarda elektrik potansiyelini ölçer. Izole tek bir dış tüy hücresi uygulanan EAEF uzun eksenine paralel elektrot uçları arasına yerleştirilir ise, uzatma ve elektrik alan aynı frekansta kısaltarak hareket edecektir. OHC yanıt (bükme) farklı türde bir hücre alanında dik yerleştirilmiş ise gözlenen ve araştırılmalıdır. (Şekil 2 B)
3. EAEF uyarılması ve görüntü yakalama
- Dört farklı stimülasyon protokolleri (Şekil 3) seçilebilir:
- sürekli tek bir frekans (Şekil 3). Uyaran modu, frekans, genlik ve dalga tipi ev yapımı kontrol yazılımı (kırmızı daireler) kullanılarak seçilebilir unutmayın.
- bursted tek frekanslı (Şekil 3). Patlama arasındaki patlamaları ve boşlukların uzunluğu da seçilebilir.
- lineer süpürme (Şekil 3 C). Ilk ve son frekansları seçilebilir.
- çok stimülasyon (Şekil 3 D). Tek frekans ve doğrusal tarama, tek bir deney kombine edilebilir. İlgili parametreleri seçtikten sonra, kontrol yazılımı sistemi yapılandırır ve operatörün tek bir düğmeye tıklayarak ışık senkronize video kayıt ve hücre stimülasyon başlatmanıza izin verirbilgisayar ekranında.
- Görüntüler AVI formatında yüksek frekanslarda daha fazla analiz için yakalanır.
4. Temsilcisi Sonuçlar
- Bu film, iki izole dış saç hücrelerinin kendi boyuna eksenine paralel veya çapraz Harici Alternatif Elektrik Alan, sırasıyla uyarılmış ediliyor uzunluk veya eğrilik değişiklikler göstermektedir. (Film # 2).
- OHCs hareketli yanıtları-line ProAnalyst yazılım (Xcitex A.Ş., Cambridge, MA) kullanılarak analiz edilmektedir. Bu yazılım "Özellik İzleme" fonksiyonu kare-kare (Şekil 4) iki nokta arasındaki mesafe sağlar. Ve hücre (Bazal kutup, yeşil renkli) tabanı; apeks (kırmızı renk cuticular plaka) seçilen nokta arasındaki mesafeyi kısaltarak hücre sırasında küçük olduğu için, ve hücre uzaması ile birlikte artar. Filmi kare kare uzunluğunda değişiklikleri analiz yazılımları gösterir. Görüntünün altındaki panel hareketin iz gösterir. Bu örnekte, uzunluğu toplam değişim yaklaşık 6.5 piksel.
- ProAnalyst yazılım "Kontur İzleme" fonksiyonu hücre kenar algılar ve otomatik olarak optik bölümü (Şekil 5) alanında ölçmek.
- Polistiren mikroküreler rastgele banyo çözümü eklendi ve sıkıca plazma zarı (Şekil 6 A) eklemek. Farklı mikroküreler aynı anda seçilebilir ve yazılım otomatik olarak hepsini kare kare izleyebilirsiniz. Bu sayede, hücreler bölümlerde bölünmüş ve her bölümün motilite bağımsız olarak değerlendirilir. (Şekil 6 A)
- Mikroküreler seçerek hücre görüntü lateral kenarlarında bulunan, her segmentin uzunluğu değişiklikler ve bir segmenti saygı açısı değişiklikleri (bükme) diğer bağımsız değerlendirilir olabilir. (Şekil 6B)
Şekil 1 EAEF jeneratör ve görüntü yakalama sistemi ile olan bağlantıları diyagramı.
Deney düzeneği Şekil 2) Resim. Elektrotlar ve tek bir OHC uzun eksenine paralel elektrik alanı ile bunlar arasında yer alan resmeden karikatürler mikroskop sahne B) Detay.
Şekil 3 A), tek frekans uyarılması için yapılandırılmış ev yapımı kontrol yazılımı kullanıcı arayüzü . Seçilen parametreler kırmızı daire içerisine alınmış. B) Kullanıcı arayüzü, ev yapımı kontrol yazılımı patlama tek frekanslı stimülasyon için yapılandırılmış. C) Doğrusal süpürme uyarılması için yapılandırılmış ev yapımı kontrol yazılımı kullanıcı arayüzü. D) çok stimülasyon için yapılandırılmış ev yapımı kontrol yazılımı Kullanıcı arabirimi.
Şekil 4 tabanı (yeşil) ve ProAnalyst yazılım "Özellik izleme" fonksiyonunu kullanarak, sırasıyla hücre, tepe (kırmızı) seçilen iki nokta bir OHC Tek kare . Hücrenin altında eğri, elektrik stimülasyonu ile ilişkili seçilen nokta arasındaki mesafe periyodik olarak değişiklikler gösterir. Hareketli dikey çubuk farklı çerçeveler bireysel analizi için seçilebilir.
Şekil 5 ProAnalyst "Kontur İzleme" fonksiyonu hücre kenar otomatik olarak algılar ve optik bölümün alanı ölçmek.
Şekil 6 polystyrene küreler (üst) ve mikroküreler bireysel (alt) seçilen beş ile aynı görüntü ile dekore edilmiş, yalıtılmış bir OHC) Yakalanan görüntü. Farklı bir renk, her Microsphere atandı ve değiştirmeler, tek tek ve otomatik olarak kare kare takip çerçeve olabilir, analiz ve karşılaştırılmıştır. B) istenilen uzunlukta Grupları mikroküreler hücre kenarlarında bulunan polistiren seçerek tanımlanan olabilir ve bu kesimleri uzunluğu değişikliklerin yanı sıra başkalarına bir segment saygı yönde değişiklik (hücre bükme) tarafından otomatik olarak çerçeve değerlendirilebilir görüntü analiz yazılımları ile çerçevesi.
Movie 1 kobay OHCs izolasyonu video izlemek için buraya tıklayın
Film 2. Tipik electromotility ve bükme tepkiler gösteren EAEF OHCs paralel ve dik video izlemek için buraya tıklayın
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan deneysel yöntem için herhangi bir sınırlama olmaksızın hücre hareketi kHz aralığında OHC hareketli tepkileri tahmin sağlar. Farklı stimülasyon protokolleri, ek belirteçleri (mikroküreler), elektrik alanı ile ilgili hücre yönünü iyi değişiklikleri gibi, daha önce ulaşılmaz bir detay seviyesi ile mümkün OHC hareketlilik yeni yönlerini araştırmak yapmak. Diğer yöntemler fotodiyotlar 9 veya lazer Doppler vibrometry 10 kullanarak, örneğin, hücrenin konumu sıkı bir kontrol gerektirir. Burada, aksine, tüm ölçümler aynı hücreye ait noktaları arasında yapılır ve her yerinden sadece hücre şekil ve harici bir referans çerçevesi açısından değil kendi hareketi ile değişiklikleri ile ilişkilidir. Kesitsel OHC alanının güvenilir ölçümler da kolayca elde OHC hacminde hızlı değişikliklerin bir tahmin sağlar. Buna ek olarak, daha hızlı ve daha duyarlı kameralar ve daha iyi görüntü analiz yazılımı sürekli gelişim, sürekli bir iyileştirme yöntemi kalitesi garanti eder. Plazma zarından elektrik potansiyeli üzerinde hiçbir kontrolü, tekniği, bir dezavantajı kHz aralığında OHC motilite değerlendirmek için kullanılan tüm yöntemleri ile paylaşılan bir sınırlama yoktur.
Bu nedenle, burada açıklanan yöntem, OHCs 'hareketli tepkileri altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları hakkında yeni ve önemli ipuçları sağlama yeteneğine sahip, araştırma işitme için önemli bir araç olabilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Grants R01DC10146/R01DC010397 Enstitüleri tarafından desteklenen çalışma, P30 DC006276 Araştırma Çekirdek NIDCD ve HEI. Burasının içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIH veya HEI resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazarlar ilgi mevcut veya potansiyel çatışma beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).
