Summary
В этой статье описывается порядок проведения экспертизы основных посмертных от мыши или крысы, и набор основных органов, а также более сложные типы выборки из для гистологического, микробиологических и ПЦР оценки.
Abstract
Есть несколько типов образцов, которые могут быть собраны из эвтаназии животных в целях диагностики или обнаружить возбудителей инфекционных заболеваний животных в колонии. Правильное коллекции тканей для дальнейшего гистологического обработка может повлиять на качество результатов контроля. В этой статье описывается поведение основных макроскопическом исследовании включая определение сердца, печени, легких, почек и селезенки, а также как собирать эти органы. Кроме того, четыре из наиболее сложных тканей / образец методы коллекции демонстрируются. Коллекция легких и перфузии может быть особенно трудно, так как ткань должна быть должным образом раздуты с фиксатором для того, чтобы внутри ткани исправить должным образом и дать возможность тщательного гистологического оценки. В этой статье показано шаг за шагом технику для удаления легких и раздувать его с фиксатором для достижения оптимальной фиксации ткани в течение 24 часов. Мозг коллекции можно так же трудно, так как ткань мягкая и легко повреждается. В этой статье показано шаг за шагом техника выявить и удалить мозг из черепа с минимальным повреждением тканей. Брыжеечных лимфатических узлов хороший тип образца, в котором для обнаружения многих распространенных инфекционных агентов, как кишечные вирусы сохраняются дольше в лимфатических узлах, чем они пролили в кале. В этой статье показано шаг за шагом процедуры для поиска и удаления асептически брыжеечных лимфатических узлов. Наконец, выявление возбудителей инфекционных заболеваний дыхательных путей может выполняться бактериальной культуры или ПЦР тестирование носа и / или бронхиальной жидкости всасывает принято на вскрытии. Эта процедура описывает получение и подготовку дыхательных образца аспирата для бактериальной культуры и ПЦР-тестирование.
Protocol
1. Подготовка к вскрытии
- Важная часть любой макроскопическом исследовании посмертных (брутто вскрытия) являются история животных и описание результатов.
- Ветеринарный патолог читать ваши гистопатология слайды, возможно, не видели животное и полагается на вас за справочной информации.
- Опишите точно, что вы видите перед собой усыпить животное. Например, "женская мышь, одна из пяти в клетке; C57BL/6N, голова наклонена вправо" или "коричневой самцов крыс, напряжение неизвестно; животное царапин, есть пятнистый выпадение волос на спинке, около хвоста и голова ".
- Используйте ясно, описательные, объективный язык. Модификаторы, такие как "мягкие", "умеренный" и "тяжелой" может быть полезно, если отключений между уровнями четко разграничены. Описание вещей с точки зрения продовольственной или бытовые предметы, как правило, не рекомендуется.
- Взвешивания и измерения животных, находки, или органы часто бывает полезно. "Большой селезенки", чтобы Вы могли бы быть нормальной селезенки в другой наблюдатель. Сказать, что селезенка меры 3см х 1,5 см обеспечивает более объективную информацию.
- Photodocumentation может иметь неоценимое значение.
- Соблюдайте все соответствующие гигиены и индивидуальной защиты, необходимые для работы с живыми животными, потенциально инфекционных туши, или химических веществ, таких как формалин.
2. Валовой место вскрытие и исследование сердца, легких, печени, почек и селезенки
- Соберите необходимые материалы до эвтаназии животных. Как минимум, это должно включать плату рассечение или аналогичных рабочую поверхность, пинцеты, ножницы, наклейки для контейнеров, фиксатора, и любые средства массовой информации или сбор трубы / чашки, которые потенциально могут быть необходимы.
- Кратко оценки состояния, поведения, и движения животного. Наблюдать и записывать дыхание моделей (например, быстрое, мелкий), а также возможность амбулаторного и походки (например, хромая, кружит, тремор).
- Усыпить животное в соответствии со стандартными процедурами в вашем учреждении, всегда придерживаясь AVMA руководящих принципов.
- Оценка состояния организма животного для кожи и шерсти нарушения, истощение, или обезвоживания. Обратите внимание на каких-либо искусственных манипуляций, имплантанты, или хирургических рубцов.
- Проверьте все внешние отверстия (уши, глаза, нос, ануса, половых отверстий, и полости рта). Использование рассекает сферу рекомендуется для более тесного наблюдения.
- Положите эвтаназии мыши или крысы тушу в спинных лежачее положение на чистую борту рассечение или аналогичных рабочей поверхности.
- Использование ножницы, надрезать кожу по всей длине нижняя из ануса к подбородку, отражающие кожи и надрезание брюшной стенки, подвергая брюшной полости, слюнных и препуциальный / клиторальный железы и шейки матки и подмышечных лимфатических узлов. Вырезать грудной клетки для выявления и изучения внутренних органов грудной, сделав два сокращения боков до каждой стороне грудной клетки, то в поперечнике, в верхней части грудины, чтобы открыть пространство достаточно широким, чтобы тщательно изучить все доли легких.
- Проверьте появление опорно-двигательного аппарата структуры.
- Оцените все органы для отклонения. В частности найти и идентифицировать сердце и легкие в грудной полости. В частности найти и идентифицировать печени, почек и селезенки в брюшной полости. Обратите внимание на любые изменения цвета, различия в размерах, и пропавших без вести или mislocated органов. Обратите внимание на последовательность поверхностей, любые дополнительные ткани (например, массы), жидкость карманы, или наличие жидкости в брюшной / грудной полости.
- Обратите внимание на желудочно-кишечный тракт за содержание или отсутствие содержания, обращая особое внимание на утолщенными стенками, массы и / или кровотечения. Надрезать почки (слева продольного сечения, щелкните правой кнопкой сечения, на средней линии, но не в центре) с помощью скальпеля или лезвия бритвы и проверить паренхимы для каких-либо отклонений. Проверьте брыжейки для увеличения лимфатических узлов и / или массы.
- Изучить мочеполовой системы, ищет завалов, жидкость карманы, кровоизлияния или другие нарушения.
3. Посмертные коллекция сердца, печени, почек и селезенки гистопатология
- Соберите соответствующего размера, маркированный контейнер (ы), наполненный подходящим размере 10% нейтральный буферный формалин (НБФ). Отрегулируйте размере 10% NBF с целью получения 20:01 Отношение фиксатором для ткани.
- Место мыши или крысы тушу в спинных лежачее положение на чистую борту рассечение или аналогичных рабочую поверхность и подвергать ткани интересов.
- Удаление ткани от туши использованием щипцы и ножницы.
- Ткань должна быть тесно обрезается, чтобы удалить жир и ненужные соединительной ткани. Ткань должна быть чистой крови; использовать обычные (или физиологический) раствор) для полоскания при необходимости. Никогда не используйте дистиллированную или водопроводную воду для полоскания тканей.
- Место ткани в контейнере 10% NBF.
- Соберите соответствующего размера, маркированный контейнер (ы), наполненный подходящим размере 10% NBF. Отрегулируйте размере 10% NBF с целью получения 20:01 Отношение фиксатором для ткани.
- Место мыши или крысы тушу в спинных лежачее положение на чистую борту рассечение или аналогичных рабочей поверхности.
- Expose трахеи, сердца и легких.
- Использование ножницами и щипцами удалить кожу и мышцы вышележащих вентральной грудного и шейного регионах.
- Использование ножницы и пинцет, удалите грудную клетку подвергая сердца и легких, делая 2 сокращения боков до каждой стороне грудной клетки, то через возле ключицы, чтобы открыть пространство достаточно широким, чтобы тщательно изучить все доли легких.
- Срежьте мышц шеи простирается от грудины и ребер в челюсть, в том числе вышележащих трахеи.
- Вставить ножницы под передним краем грудной клетки и сделать 2 порезы, по одному с каждой стороны, чтобы удалить часть кости вышележащих трахеи.
- Возьмитесь трахеи возле челюсть щипцами и вырезать полностью через трахею с помощью ножниц, расположенных выше щипцы
- Аккуратно буксир трахеи вверх использованием щипцов, Ножницы вентральной соединения ткани с помощью ножниц, пока весь набор грудной ткани (трахеи, легких и сердца, это иногда называется "срывать") была удалена из организма.
- Положите легких квартира на рабочей поверхности.
- Свободно галстук часть шовного материала или кухни вьются вокруг трахеи заботясь, чтобы не тянуть туго.
- Заполните шприц с фиксатором и прикрепить иглу, которая достаточно мала, чтобы войти в трахею. Для мышей, 1 мл или 3 мл шприц с иглой 26 работает хорошо. Для крыс, 5 мл шприц с 18 калибра шприц работает хорошо.
- Вставьте иглу в отверстие трахеи и использовать щипцы провести трахеи окружающих иглы. Начните медленно заполнения легких с фиксатором.
- Заполните легких, пока полностью надут. Не пере-или underinflate. Количество фиксатора, необходимых для полного раздувать легкие варьируется в зависимости от возраста, процедить, и здоровье животных.
- Чрезмерная инфляция обнаруживается жидкость просачивается и вспенивание из легких тканей.
- Недостаточное давление обнаруживается легких появляются плоские и не полное во всех областях.
- Удалите иглу из трахеи.
- Затяните шовный материал или строки окружающие трахею для предотвращения обратного потока фиксатор из легких.
- Место завышенным легких в использовании фиксатора приблизительный 20:01 фиксатора на ткань отношение.
5. Посмертные коллекция мозга
- Соберите соответствующего размера, маркированный контейнер (ы), наполненный подходящим размере 10% NBF. Отрегулируйте размере 10% NBF с целью получения 20:01 Отношение фиксатором для ткани.
- Место эвтаназии мыши или крысы тушу с брюшной лежачее положение на чистую борту рассечение или аналогичных рабочей поверхности.
- Использование ножницы и щипцы, удалить кожу и мышцы вышележащих черепа.
- Использование ножниц удалить голову полностью от туши.
- Использование маленькие ножницы вставки нижней лезвие в затылочное отверстие, открытие которой череп открывается в спинномозговой канал, и держать ножницеобразный советы указал вверх, начните вырезать прямо вверх и через среднюю линию черепа.
- Использование щипцов, отражают назад обе половины черепа подвергая головной мозг.
1. Если возможно, поместите подвергается мозг в фиксатор в то же время в черепе. Это позволит ткани, чтобы стать фирмой до снятия с черепом, если это требуется. Многие предпочитают патологи, что разделы вырезаны из мозга в то же время в черепе.
- Аккуратно переверните черепа так, что гравитация поможет ткани выпасть из черепа.
- Использование изогнутых щипцов, тщательно слайд пинцетом вдоль внешнего края головного мозга и в головном мозге, начиная с обонятельных долей, транспортируемых в головном мозге и в сторону мозжечка. Аккуратно шнура с пинцетом любой соединительной ткани и нервов, которые препятствуют мозга от падения с черепом.
- Место мозг в фиксатор использованием приближенных 20:01 Отношение ткани фиксатором.
6. Посмертные коллекция брыжеечных лимфатических узлов (МЛН)
- Ткани коллекции для ПЦР-анализа должны быть сделано с использованием асептических условиях. Пламя стерилизовать, автоклаве или, что эквивалентно стерилизовать инструменты должны быть использованы.
- Соберите стерильные пробирки Эппендорф и стерильные ножницы и пинцет.
- Место эвтаназии мыши или крысы тушу в спинных лежачее положение на чистую борту рассечение или аналогичных рабочей поверхности.
- Использование стерилизованные ножницы и щипцы надрезать вентральной брюшной стенки от области половых органов до основания грудной клетки, Удаление кожи и мышц и подвергая кишечника.
- МЛН расположены в брюшной полости в брыжеечной ткани вдоль толстой кишки, в непосредственной близости от слепой кишки.
- Чтобы найти МЛН, сначала найти слепой кишки, который является большим, запятая образный кишечника. Толстой кишки простирается от слепой кишки и его часто можно определить наличие фекальных шариков. МЛН расположены в брыжейке по толстой кишке, прилегающих к слепой кишки. Она может быть определена как желтые, овальные или сферические небольшой кусок ткани в белую ткань брыжеечной и часто немного толще и тверже в текстуре, чем окружающие брыжейки и жира. Использование книги анатомии текста, сколько необходимо для ориентации.
- Использование асептических и стерильных инструментов удалить МЛН и поместить в пробирку Эппендорфа помечены идентификационной информации.
7. Посмертные коллекция дыхательных аспирата
- Соберите необходимые материалы - стерильные пипетки, стерильные ножницы и пинцет, стерильные растворы, чтобы быть сброшены через дыхательные пути, а чистая рассекает платы или аналогичных рабочей поверхности.
- Положите эвтаназии мыши или крысы тушу в спинных лежачее положение на вскрытии борту.
- Для бронхиальной аспирации у крыс, доступ дыхательных путей путем трахеи. Для носовых аспирата у крыс, доступ либо через трахею или через носоглотки проход. Для бронхиальной или носовой всасывает у мышей, доступ в дыхательные пути через носоглотки проход.
- Если оба носовой и бронхиальной аспиратов необходимо выполнить бронхиальной аспирации в первую очередь. Выполните носовой аспирата с использованием новой стерильной пипеткой.
- Трахеи доступа (рекомендуемый метод для крыс):
- Отражение кожу от шейной области подвергать подкожных тканей.
- Удаление слюнных желез и шейки мускулатуры подвергать трахеи.
- Использование стерильных инструментов, надрезать трахеи для обеспечения доступа к просвет. Поддерживать асептики всей коллекции (Перейдите к шагу 7.7).
- Носоглотки доступ прохода (носовые аспирации и бронхиальной аспирации, рекомендуемый метод для мышей, из-за меньшего размера трахеи):
- Эта процедура может быть выполнена как для аспирации носовой и бронхиальной аспирации.
- Использование пламени стерилизации или автоклавного инструментов, разорвать височно (челюсть) сустава и отражают челюсти от верхней челюсти, выставляя носоглотки проход. Поддерживать асептики всей коллекции (Перейдите к шагу 7.7).
- Нарисуйте примерно 1 мл отбор проб жидкости в стерильные пипетки. Это может быть физиологический раствор, фосфатным буферным раствором, или Trypticase соевый бульон. (Перейдите к шагу 7.8 или 7.9, в зависимости от аспирации вы собираете.)
- Бронхиальная аспирации:
1. Асептических вставлять пипетки в просвет трахеи, направленной каудально и медленно вводят отбор проб жидкости в бронхах и легких. Вывод выборки жидкости из бронхов и легких в пипетку и удалять пипеткой из трахеи. Не все жидкости вернется в пипетку. Повторите, если больше жидкости необходимо для тестирования.
- Носовые аспирации:
- Асептических вставлять пипетки в носоглотки прохода (мыши) или трахеи просвет (крысы), режиссер краниально, и медленно вводят отбор проб жидкости в полости носа.
- Убедитесь, что полость носа достигается при контакте носовых неба кончиком пипетки или путем наблюдения жидкости вынуждены полости, который рассматривается как менисков, образующихся на носовые отверстия (ноздри) или в виде жидкости видно через полупрозрачные устной неба. Жидкость не должна рассматриваться выходят через рот. Если это так, переориентировать пипетки.
- Вывод выборки жидкости из полости носа в пипетку и удалить из пипетки прохода или трахеи.
- Асептических условиях передачи образца соответствующие средства или контейнера для тестирования.
8. Представитель результаты
Рисунок 1. Пресса и органов грудной клетки в мышь. Эти органы, как правило, видны при животное в первый раз открыл (ни один из органов были перемещены подвергать других органов также присутствует в брюшной полости).) Вилочковой железы, б) сердце, в) легкие, г) диафрагма, е), печени , е) тонкий кишечник, г) слепой кишки, ч) мочевого пузыря.
Рисунок 2. Брюшной полости и забрюшинного органов в мышь. Если кишечник и печень поднимать и перемещать (или удалить), эти органы окн не было видно.) печени (для справки), б) кишечник (для справки), в) желудка, г) селезенки, е), почек, е) нисходящей ободочной кишки, г) матки.
Рисунок 3. Мужских половых органов. Они могут быть больше, в крупных и половозрелых самцов.) Семенных пузырьков и коагулирующих желез, б) яичка (втолкнули в брюшную полость от мошонки через паховые кольца, которые остаются открытыми для мышей и крыс), в) мочевого пузыря, г) препуциальный желез, е), придатка яичка.
Рисунок 4. Женских половых органов.) Не беременной матки (мышей и крыс двурогий матки) б) яичников, похоронен в жировой ткани яичников, в) мочевого пузыря, г) клиторальный желез (аналог мужской препуциальный желез) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сбор данных в конце исследования могут потребовать вскрытии животных. Опишите также то, что видел и помню, чтобы изучить все ткани. Эти процедуры предназначены прежде всего для оптимизации вскрытия и отбора образцов для эпиднадзора за инфекционными болезнями, но большинство из них легко адаптируются к сосредоточены исследования подозреваемых случаев заболевания или вспышки, в которых, возможно, только часть процедуры могли бы быть использованы. Многие процедуры, также имеют отношение к necropsies чаще осуществляется по окончании исследовательских работ в рамках общей морфологической оценки в сочетании с коллекцией исследовании конкретных образцов для последующего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы всех сотрудников лаборатории грызунов Чарльз реки диагностической лаборатории, где эти услуги предоставляются на коммерческой основе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5" length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5" |
| Large scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6826, G65" | 6.25" |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5", serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS--8160 | Rat tooth |
| Flame sterilizer | Oxford Labware | Bacti-Cinerator #5889-001007 | |
| Scalpel | Cancer Diagnostics, Inc. | Finger Scalpels #60, Cat#FS0060 | |
| Pipettes | VWR international | Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400 | |
| Autoclave bags | Propper Manufacturing Company | Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 | For Pasteur pipettes |
| Pipette bulb | VWR international | Cat#56310-240 | |
| Eppendorf tubes | Sarstedt Ltd | SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695 | |
| Eppendorf tubes | Argos | 5mL microtube Cat#T20765-C | |
| Syringe | BD Biosciences | 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661 | |
| Needles | BD Biosciences | 26G-309625 18G-305195 | |
| Neutral buffered formalin | VWR international | 20L 10% NBF, Cat#16004-128 | |
| Saline | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178 | |
| Trypticase soy broth | BD Biosciences | TSB: Dehydrated, Cat#211825 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | HA Buffer, Cat#P3813-10PAK | |
| Formalin cups | VWR international | 4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858 | |
| Large formalin cups | OakRidge Products | 32oz container Cat#0432-1100 | |
| Extra large formalin cup | VWR international | HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282 | |
| Suture material | Henry Schein | Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750 | For mouse lung inflation |
| Twine | Staples | Cat#QUA-46173 | For rat lung inflation |
References
- AVMA. AVMA Guidelines on Euthanasia. , (2007).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the rabbit. , CRC Press. (1988).
- King, J. M., Dodd, D. C., Roth, L. The Necropsy Book. , 4th edn, C.L. Davis Foundation. (2006).
- Kittel, B. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Fox, J. G. Chapter 1. The Mouse in Biomedical Research. , Elsevier. Vol. 3: Normative biology, husbandry, and models 1-22 (2007).
- Morawietz, G. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).
- Ruehl-Fehlert, C. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
