La necropsia de diagnóstico y selecta colección de tejidos y muestras en ratas y ratones

Summary

En este artículo se describen los procedimientos para la realización de un examen post-mortem básicos de un ratón o una rata, y el conjunto de órganos de base, así como más tipos de muestras reto de la evaluación histológica, microbiológicos y PCR.

Abstract

Hay varios tipos de muestras que pueden ser recogidos a partir de un animal sacrificado con el fin de ayudar a diagnosticar o descubrir los agentes infecciosos en una colonia de animales. Recolección adecuada de los tejidos para su procesamiento histológico más puede afectar la calidad de los resultados de las pruebas. Este artículo describe la realización de un examen básico bruto incluyendo la identificación de corazón, hígado, pulmones, riñones y bazo, así como la forma de recoger esos órganos. Además cuatro de las técnicas de recolección más difícil del tejido / muestra se demuestran. Colección de pulmón y de la perfusión puede ser particularmente difícil ya que el tejido tiene que ser debidamente infladas con un fijador para que el interior de los tejidos para fijar correctamente y para permitir la evaluación histológica completa. En este artículo se demuestra el paso a paso la técnica para extirpar el pulmón y se inflan con el fijador con el fin de lograr una fijación óptima del tejido dentro de las 24 horas. Colección del cerebro puede ser igualmente un reto ya que el tejido es suave y se dañan fácilmente. En este artículo se demuestra el paso a paso la técnica para exponer y extraer el cerebro del cráneo con el mínimo daño a los tejidos. El ganglio linfático mesentérico es un tipo buena muestra de que muchos de detectar agentes infecciosos comunes como los virus entéricos persisten por más tiempo en los ganglios linfáticos de lo que se eliminan en las heces. En este artículo se demuestra el procedimiento paso a paso para localizar y aséptica retirar los nódulos linfáticos mesentéricos. Finalmente, la identificación de agentes infecciosos de las vías respiratorias se puede realizar por cultivo bacteriano o la prueba de PCR de la nariz y / o bronquial líquido aspirado tomadas en la necropsia. Este procedimiento describe la obtención y preparación de la muestra de aspirado de las vías respiratorias para cultivo bacteriano y PCR.

Protocol

1. Preparación para la necropsia

1. Partes importantes de cualquier examen post-mortem bruto (bruto necropsia) es la historia de los animales y la descripción de los hallazgos.
2. Un patólogo veterinario de leer las diapositivas histopatología no haber visto al animal y confía en que la información de fondo.
3. Describir exactamente lo que se ve antes de sacrificar al animal. Por ejemplo, "ratón hembra, una de las cinco de la jaula; C57BL/6N, la cabeza inclinada hacia la derecha" o "rata macho marrón; cepa desconocida, animal se rasca, se produce una pérdida parcial del cabello en el dorso, cerca de la cola y la cabeza ".
4. Use un lenguaje claro, descriptivo y objetivo. Modificadores tales como "suave", "moderada" y "severa" puede ser útil si los puntos de corte entre los niveles están claramente delimitados. Describir las cosas en términos de alimentos u objetos del hogar generalmente no se recomienda.
5. Pesar y medir los animales, los resultados o los órganos a menudo es útil. A "el bazo grande" para usted puede ser que un bazo normal a otro observador. Decir que el bazo medidas 3 cm x 1,5 cm ofrece una información más objetiva.
6. Fotodocumentación puede ser muy valiosa.
7. Observe todos los profesionales de salud pertinentes y equipo de protección personal necesarios para trabajar con animales vivos, las canales potencialmente infecciosos o productos químicos como el formol.

2. Ubicación postmortem bruto y el examen de corazón, los pulmones, el hígado, los riñones y el bazo

1. Reúna los suministros necesarios antes de la eutanasia del animal. Como mínimo, esto debe incluir una tabla de disección o superficie de trabajo similar, pinzas, tijeras, etiquetas para envases, de fijación, y cualquier medio de comunicación o los tubos de recogida / cups que potencialmente puede ser necesaria.
2. Brevemente evalúe el estado, comportamiento y movimiento del animal. Observar y registrar los patrones de respiración (por ejemplo, rápida y superficial), así como la capacidad ambulatoria y de la marcha (por ejemplo, cojeando, dando vueltas, temblores).
3. La eutanasia de los animales según los procedimientos habituales en su institución, siempre siguiendo las pautas AVMA.
4. Evaluar la condición corporal del animal para detectar anomalías piel y el pelo, adelgazamiento, o deshidratación. Tome nota de cualquier manipulaciones artificiales, implantes, cirugía o cicatrices.
5. Examinar todos los orificios externos (orejas, ojos, nariz, ano, orificios genitales, y la cavidad oral). El uso de un microscopio de disección se recomienda para una observación más cercana.
6. Coloque el ratón o la eutanasia cadáver de rata en decúbito dorsal sobre una tabla de disección limpia o superficie de trabajo similar.
7. Con la tijera, cortar la piel toda la longitud de la ventrum desde el ano hasta la barbilla, lo que refleja la piel y la incisión de la pared abdominal, la exposición de las vísceras abdominales, glándulas salivales y prepuciales / del clítoris y de los ganglios linfáticos cervicales y axilares. Cortar las costillas para exponer y examinar las vísceras torácicas, haciendo dos cortes laterales a cada lado de la caja torácica, a continuación, a través de una, en la parte superior del esternón, para abrir un espacio lo suficientemente amplio para examinar a fondo todos los lóbulos del pulmón.
8. Observar el aspecto de la estructura músculo-esquelética.
9. Evaluar todos los órganos para detectar anomalías. Específicamente encontrar e identificar el corazón y los pulmones en la cavidad torácica. Específicamente encontrar e identificar el hígado, los riñones y el bazo en la cavidad abdominal. Tenga en cuenta cualquier cambio de color, las diferencias de tamaño, y órganos perdidos o mislocated. Tenga en cuenta la consistencia de las superficies, cualquier tejido adicional (por ejemplo, las masas), bolsas de líquidos, o la presencia de líquido en la cavidad abdominal / torácico.
10. Observe el tracto gastrointestinal de los contenidos, o la falta de contenido, prestando especial atención a engrosamiento de las paredes, las masas, y / o hemorragia. Incisión de los riñones (de izquierda a la sección longitudinal, haga la sección transversal, en la línea media, pero fuera del centro) con un escalpelo o rasuradora para comprobar parénquima de cualquier anomalía. Compruebe el mesenterio de los ganglios linfáticos y / o masas.
11. Examinar el sistema urogenital, en busca de los bloqueos, las bolsas de líquidos, hemorragia u otras anomalías.

3. Postmortem colección de corazón, el hígado, los riñones y el bazo para histopatología

1. Se reúnen de tamaño adecuado, envase con etiqueta (s) lleno de una cantidad adecuada de 10% de formalina neutra tamponada (MNB). Ajustar la cantidad de 10% NBF con el fin de obtener una proporción de 20:1 de fijador en el tejido.
2. Coloque el ratón o la rata cadáver en decúbito dorsal sobre una tabla de disección limpia o superficie de trabajo similares y exponer el tejido de interés.
3. Eliminar el tejido de la canal con pinzas y tijeras.
4. Tejidos deben ser cuidadosamente recortadas para eliminar la grasa del tejido conectivo e innecesario. Tejidos deben estar limpias de sangre, el uso normal (o fisiológica) de solución salina) para aclarar si es necesario. Nunca utilice agua destilada o del grifo para lavar los tejidos.
5. Coloque el tejido en el contenedor de 10% del MNB.

1. Se reúnen de tamaño adecuado, envase con etiqueta (s) lleno de una cantidad adecuada de un 10% del MNB. Ajustar la cantidad de 10% NBF con el fin de obtener una proporción de 20:1 de fijador en el tejido.
2. Coloque el ratón o la rata cadáver en decúbito dorsal sobre una tabla de disección limpia o superficie de trabajo similar.
3. Exponer la tráquea, el corazón y los pulmones.
4. El uso de tijeras y pinzas de quitar la piel y el músculo que cubre las regiones ventral dorsal y cervical.
5. El uso de tijeras y pinzas, retire la caja torácica exponer el corazón y los pulmones, haciendo dos cortes laterales a cada lado de la caja torácica, a continuación, a través de una cerca de la clavícula para abrir un espacio lo suficientemente amplio para examinar a fondo todos los lóbulos del pulmón.
6. Cortar los músculos del cuello que se extiende desde el esternón y las costillas a la mandíbula, incluidos los que cubre la tráquea.
7. Introduzca las tijeras debajo del borde anterior de la caja torácica y hacer 2 cortes, uno a cada lado, para eliminar la parte del hueso que recubre la tráquea.
8. Sujete la tráquea, cerca de la mandíbula con una pinza y corta completamente a través de la tráquea con una tijera colocado por encima del fórceps
9. Tire suavemente hacia arriba la tráquea con el fórceps, cortando conexiones ventral tejido con unas tijeras hasta que todo el conjunto de los tejidos del tórax (tráquea, los pulmones y el corazón, lo que es a veces llamado el "arrancar") ha sido eliminado del cuerpo.
10. Coloque los pulmones plana en la superficie de trabajo.
11. Vagamente atar un trozo de material de sutura o hilo de cocina alrededor de la tráquea con cuidado de no tire fuerte.
12. Llene una jeringa con fijador y conecte una aguja que es lo suficientemente pequeño para entrar en la tráquea. En los ratones, una jeringa de 1 ml o 3 ml con una aguja de calibre 26 que funciona bien. Para las ratas, una jeringa de 5 ml con una jeringa de calibre 18 que funciona bien.
13. Insertar la aguja en el orificio de la tráquea y el uso de fórceps para mantener la tráquea que rodea la aguja. Comience lentamente llenando los pulmones con el fijador.
14. Llenar los pulmones hasta que esté completamente inflado. No sobre-o underinflate. La cantidad de fijador necesaria para inflar los pulmones por completo varía según la edad, raza, y la salud del animal.
    1. Sobre la inflación es detectado por el líquido se filtra y la formación de espuma en el tejido pulmonar.
    2. Inflado insuficiente es detectado por los pulmones con apariencia plana y completo, no en todas las áreas.
15. Retire la aguja de la tráquea.
16. Apriete el material de sutura o una cadena alrededor de la tráquea para evitar el reflujo de las fijador de los pulmones.
17. Coloque los pulmones inflados en el fijador con un aproximado de 20:01 fijador relación tejido.

5. Post-mortem del cerebro de la colección

1. Se reúnen de tamaño adecuado, envase con etiqueta (s) lleno de una cantidad adecuada de un 10% del MNB. Ajustar la cantidad de 10% NBF con el fin de obtener una proporción de 20:1 de fijador en el tejido.
2. Coloque el ratón o la eutanasia cadáver de rata en decúbito ventral sobre una tabla de disección limpia o superficie de trabajo similar.
3. El uso de tijeras y pinzas, retire la piel y el músculo que recubre la bóveda craneal.
4. Con la tijera eliminar por completo la cabeza del cadáver.
5. El uso de tijeras pequeñas introduzca el extremo inferior en el foramen magnum, la abertura por donde el cráneo se abre en el canal espinal, y mantener puntas de las tijeras apuntando hacia arriba, empezar a cortar directamente y a través de la línea media de la bóveda craneal.
6. Con unas pinzas, trate de recordar las dos mitades de la bóveda craneal exponer el cerebro.

   1. Cuando sea posible, coloque el cerebro expuesto al fijador al mismo tiempo en el cráneo. Esto permitirá que el tejido se firme antes de la remoción de la cabeza, si es necesario. Muchos patólogos prefieren que las secciones se cortan desde el cerebro al mismo tiempo en el cráneo.

7. Invierta suavemente el cráneo para que la gravedad ayudará a que el tejido se caen de la cabeza.
8. El uso de pinzas curvas, deslice con cuidado la pinza a lo largo del borde exterior del cerebro y en el cerebro a partir de los lóbulos olfativos, moviéndose en el cerebro y hacia el cerebelo. Pellizque suavemente con las pinzas de cualquier tejido conectivo o de los nervios que inhiben el cerebro de la caída del cráneo.
9. Lugar del cerebro en fijador utilizando una de aproximadamente 20:1 proporción de tejido de fijador.

6. Post-mortem de recogida de los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN)

1. La colección de tejidos para análisis de PCR se debe hacer utilizando una técnica aséptica. Llama esterilizados, en autoclave o esterilizados de forma equivalente instrumentos deben ser utilizados.
2. Montar tubos Eppendorf estériles y tijeras y pinzas estériles.
3. Coloque el ratón o la eutanasia cadáver de rata en decúbito dorsal sobre una tabla de disección limpia o superficie de trabajo similar.
4. El uso de tijeras y pinzas esterilizadas incisión en la pared abdominal ventral de la zona genital a la base de la caja torácica, La eliminación de la piel y el músculo y la exposición de los intestinos.
5. El MLN se encuentran en la cavidad abdominal en el tejido mesentérico a lo largo del colon, inmediatamente adyacente al ciego.
6. Para localizar el MLN, en primer lugar localizar el ciego que es la sección grande, en forma de coma en el intestino. El colon se extiende desde el ciego y el que a menudo se pueden identificar por la presencia de partículas fecales. El MLN se encuentran en el mesenterio a lo largo del colon adyacente al ciego. Se puede identificar como un bulto amarillo, pequeños ovoides o esféricas de tejido en el tejido mesentérico blanco y es a menudo un poco más grueso y más firme en textura que rodea el mesenterio y la grasa. Use los libros de anatomía texto según sea necesario para la orientación.
7. Utilizando una técnica aséptica e instrumentos estériles quitar el MLN y el lugar en un tubo eppendorf etiquetado con la información de identificación.

7. Postmortem colección de aspirar las vías respiratorias

1. Reúna los suministros necesarios - pipeta estéril, tijeras y pinzas estériles, soluciones estériles que se eliminan a través del tracto respiratorio, y una lámina limpia de disección o superficie de trabajo similar.
2. Coloque el ratón o la eutanasia cadáver de rata en decúbito dorsal en el tablero de disección.
3. De aspirado bronquial en ratas, el acceso a las vías respiratorias a través de la tráquea. De aspirado nasal en ratas, el acceso sea a través de la tráquea o a través del meato nasofaríngeo. Para broncoaspirado o nasal en ratones, el acceso a las vías respiratorias a través del meato nasofaríngeo.
4. Si aspirados nasales y bronquiales son necesarios, realizar el aspirado bronquial en primer lugar. Realizar aspirado nasal con una pipeta estéril.
5. Acceso traqueal (método recomendado para las ratas):
   1. Reflejan en la piel de la zona cervical para exponer los tejidos subcutáneos.
   2. Extirpar las glándulas salivales y la musculatura cervical para exponer la tráquea.
   3. Utilizando instrumentos estériles, haga una incisión en la tráquea para permitir el acceso a la luz. Mantener la asepsia durante la recogida (Vaya al paso 7.7).
6. Acceso meato nasofaríngeo (nariz, aspire y aspirado bronquial, el método recomendado para los ratones debido al menor tamaño de la tráquea):
   1. Este procedimiento se puede realizar tanto para el aspirado nasal y aspirado bronquial.
   2. Con una llama-autoclavable instrumentos, cortar la articulación temporomandibular (la mandíbula) conjunta y reflejar la mandíbula fuera de los maxilares, dejando al descubierto el meato nasofaríngeo. Mantener la asepsia durante la recogida (Vaya al paso 7.7).
7. Dibuje aproximadamente 1 ml de líquido de una muestra en una pipeta estéril. Esto puede ser una solución salina normal, solución salina tamponada o caldo tripticasa de soya. (Vaya al paso 7.8 o 7.9, dependiendo de la aspiración de que están recogiendo.)
8. Aspirado bronquial:

   1. Asépticamente insertar la pipeta en luz traqueal, dirigido caudalmente, e inyecte lentamente el líquido de muestreo en los bronquios y el pulmón. Retirar el líquido de muestreo de los bronquios y los pulmones en la pipeta y retirar la pipeta de la tráquea. No todo el líquido vuelve a la pipeta. Repita si es más fluido que se necesita para la prueba.

9. Aspirado nasal:
   1. Asépticamente insertar la pipeta en el meato nasofaríngeo (ratones) o luz traqueal (ratas), dirigida cranealmente, e inyecte lentamente el líquido de muestreo en la cavidad nasal.
   2. Asegúrese de que la cavidad nasal que se alcanza por el contacto del paladar nasal con la punta de la pipeta, o por la observación del líquido obligó a la cavidad, considerada como la formación de meniscos en el orificio nasal (fosas nasales) o como líquido visible a través del paladar orales translúcido. El líquido no debe ser visto salir por la boca. Si es así, reorientar la pipeta.
   3. Retirar el líquido de muestreo de la cavidad nasal en la pipeta y retirar la pipeta del meato o la tráquea.
10. Transferir asépticamente la muestra a los medios de comunicación o contenedor para su análisis.

8. Los resultados representativos

Figura 1. Abdominal y los órganos torácicos en el ratón. Estos órganos suelen ser visible cuando el animal se abrió por primera vez (ninguno de los órganos se han movido a exponer a otros órganos, también presente en la cavidad abdominal). A) el timo, b) el corazón, c) los pulmones, d) el diafragma, e) del hígado , f) del intestino delgado, g) ciego, h) la vejiga urinaria.

Figura 2. Abdominal y órganos retroperitoneales en el ratón. Si los intestinos y el hígado se levantó y se movió (o eliminar), estos órganos can ser vistos. hígado) (como referencia), b) los intestinos (por referencia), c) del estómago, d) el bazo, e) los riñones, f) el colon descendente, g) del útero.

Figura 3. Los órganos reproductivos masculinos. Estos pueden ser mayores en las grandes, los machos sexualmente maduros. Un vesículas) y las glándulas seminales de coagulación, b) testículo (empujados hacia la cavidad abdominal desde el escroto a través de los anillos inguinales, que permanecerá abierta en ratones y ratas), c) la vejiga urinaria, d) las glándulas del prepucio, e) del epidídimo.

Figura 4. Los órganos reproductores. A) no grávido útero (ratones y las ratas tienen un útero bicorne) b) del ovario, enterrado en una almohadilla de grasa de ovario, c) la vejiga urinaria, d) las glándulas del clítoris (análogo a las glándulas del prepucio masculino) .

Discussion

La recolección de datos al final de un estudio puede requerir un examen post-mortem de los animales. Describen bien lo que se ve y recordar a examinar todos los tejidos. Estos procedimientos están diseñados principalmente para optimizar la necropsia y toma de muestras para la vigilancia de las enfermedades infecciosas, pero la mayoría se adaptan fácilmente a las investigaciones se centraron de los incidentes de sospecha de enfermedad o de brotes en los que sería tal vez sólo un subconjunto de los procedimientos empleados. Muchos de los procedimientos también son relevantes para necropsias más comúnmente realizado en la conclusión de los estudios de investigación como parte de una evaluación global morfológicos, junto con la recogida de muestras específicas de los estudios para su posterior análisis.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting board	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Cat #36114
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5910, G204	23mm blades, 3.5" length, straight
Medium scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6808, G207	5"
Large scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6826, G65"	6.25"
Forceps-Curved	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-8254 (M1/21004)	4.5", serrated, slight curve
Forceps-Microdissecting	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5238	Hudson-(EWALD)
Forceps-Tissue Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS--8160	Rat tooth
Flame sterilizer	Oxford Labware	Bacti-Cinerator #5889-001007
Scalpel	Cancer Diagnostics, Inc.	Finger Scalpels #60, Cat#FS0060
Pipettes	VWR international	Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400
Autoclave bags	Propper Manufacturing Company	Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110	For Pasteur pipettes
Pipette bulb	VWR international	Cat#56310-240
Eppendorf tubes	Sarstedt Ltd	SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695
Eppendorf tubes	Argos	5mL microtube Cat#T20765-C
Syringe	BD Biosciences	1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661
Needles	BD Biosciences	26G-309625 18G-305195
Neutral buffered formalin	VWR international	20L 10% NBF, Cat#16004-128
Saline	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178
Trypticase soy broth	BD Biosciences	TSB: Dehydrated, Cat#211825
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	HA Buffer, Cat#P3813-10PAK
Formalin cups	VWR international	4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858
Large formalin cups	OakRidge Products	32oz container Cat#0432-1100
Extra large formalin cup	VWR international	HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282
Suture material	Henry Schein	Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750	For mouse lung inflation
Twine	Staples	Cat#QUA-46173	For rat lung inflation