Summary
Bu makale, bir fare veya sıçan bir temel postmortem muayene yapılması için usul ve toplama temel organlarının yanı sıra, histolojik, mikrobiyolojik ve PCR değerlendirilmesi için daha zorlu örnek türleri açıklanmaktadır.
Abstract
Teşhis veya bir hayvan koloni enfeksiyöz ajanlar keşfetmek yardımcı olmak amacıyla bir ötenazi hayvan toplanan olabilir birden fazla örnek türleri vardır. , Daha fazla histolojik işlem için dokuların doğru toplanması, test sonuçlarının kalitesini etkileyebilir. Bu makale, kalp kimlik, karaciğer, akciğerler, böbrekler, dalak, yanı sıra bu organların nasıl toplamak da dahil olmak üzere temel bir brüt muayene davranış açıklanmıştır. Ayrıca dört daha zor doku / numune toplama teknikleri gösterilmektedir. Doku doku içinde sırayla düzgün bir şekilde düzeltmek için ayrıntılı bir histolojik değerlendirme ve etkinleştirmek için bir fiksatif ile şişirilmiş olması gerekir gibi Akciğer toplama ve perfüzyon özellikle zor olabilir. Bu makale, fiksatif ile akciğer dokusunun en iyi fiksasyon 24 saat içinde ulaşmak için kaldırmak ve şişirmek için adım adım tekniği ile göstermektedir. Beyin dokusu yumuşak ve kolayca zarar toplama benzer zor olabilir. Bu makale, minimal doku hasarı ile kafatası beyin ortaya çıkarmak ve kaldırmak için adım adım tekniği ile göstermektedir. Mezenterik lenf nodu Enterik virüsler lenf nodu onlar dışkı döken daha uzun süre devam ettiği çok yaygın bulaşıcı ajanların algılamak için iyi bir örnek türüdür. Bu makale, bulma ve aseptik mezenterik lenf nodu kaldırılması için adım adım prosedürü göstermektedir. Son olarak, solunum yolu enfeksiyon ajanlarının belirlenmesi, burun ve / veya bronşiyal nekropsi az sıvı alınması aspiratlarda bakteriyel kültür veya PCR testi yapılabilir. Bu prosedür, solunum aspirat örneği almak ve bakteriyel kültür ve PCR testi için hazırlanıyor açıklamaktadır.
Protocol
1. Nekropsi Hazırlık
- Herhangi bir brüt postmortem muayene (brüt nekropsi) önemli parçalarından hayvan tarih ve bulguların açıklama.
- Histopatoloji slaytlar okuma veteriner patolog hayvan gördük ve arka plan bilgileri için size güveniyor.
- Hayvan euthanize önce ne gördüğünüzü tam olarak açıklayınız. Örneğin, "dişi fare, kafese beş C57BL/6N; baş sağa doğru eğik" veya "kahverengi erkek sıçan suşu bilinmeyen; kuyruk yakın sirti yamali saç dökülmesi var, hayvan kaşıma. head ".
- Net, açıklayıcı, nesnel bir dil kullanın. "Ilımlı", "hafif" ve "ciddi" olarak Modifiers düzeyleri arasındaki kesilecek bölgenin sınırları eğer yararlı olabilir. Yiyecek ya da ev eşyaları açısından nitelendiren şeyler genellikle tavsiye edilmez.
- Hayvanlar, bulgular veya organların Tartı ve ölçüm genellikle yararlıdır. Bir "büyük dalak" başka bir gözlemci için normal dalak olabilir. Dalak 3cm x 1.5cm daha objektif bilgi sağlar tedbirler olduğunu söyledi.
- Photodocumentation çok değerli olabilir.
- Ilgili tüm iş sağlığı ve canlı hayvanlar, potansiyel olarak bulaşıcı karkasların veya formalin gibi kimyasal maddeler ile çalışmak için gerekli kişisel koruyucu ekipmanlar dikkat edin.
2. Brüt postmortem konumu ve kalp muayenesi, akciğer, karaciğer, böbrekler, dalak
- Hayvanın ötenazi için önce gerekli malzemeleri toplayın. Minimal, bu bir diseksiyon tahtası ya da benzer bir çalışma yüzeyi, forseps, makas, konteynırlar için etiket, fiksatif ve herhangi bir medya ya da toplama tüpleri / potansiyel gerekli olabilir bardak içermelidir.
- Kısaca durum, davranış, ve hayvan hareketi değerlendirir. Solunum kalıpları (örneğin, hızlı, sığ) yanı sıra ayaktan yeteneği ve yürüme (örneğin, topallama, çizerek, titreme) dikkat edin ve kaydedin.
- AVMA ilkelerine her zaman bağlı kalarak, kurumda standart prosedürlere göre hayvan Euthanize.
- Deri ve tüy anormallikleri, zayıflama, veya dehidrasyon için hayvanın vücut kondisyonu değerlendirin. Herhangi bir yapay manipülasyonlar, implantlar veya cerrahi yara not edin.
- Tüm dış deliklerini (kulaklar, gözler, burun, anüs, genital açıklıklar ve oral kavite) inceleyin. Diseksiyon kapsamı kullanımı daha yakın gözlem için tavsiye edilir.
- Temiz bir diseksiyon kurulu veya benzeri bir çalışma yüzeyi sırt yatma ötenazi fare veya sıçan karkas yatırın.
- Makaslar kullanılarak, cilt yansıtan ve karın duvarı incising, karın iç organları, tükürük ve klitoral / prepusyal bezleri ve servikal ve aksiller lenf düğümleri teşhir, cilt anüs çene ventrum tam uzunlukta insizyon. Sternumun üst akciğer lobları iyice incelemek için yeterince geniş bir alan açmak için, 2 göğüs kafesinin her iki tarafındaki yanal kadar keser, daha sonra üzerinden bir yaparak torasik organlar ortaya çıkarmak ve incelemek için göğüs kafesi kesin.
- Kas-iskelet yapısı görünümünü inceleyin.
- Anormallikleri bütün organları değerlendirin. Özellikle göğüs boşluğunda kalp ve akciğerler bulmak ve tanımlamak. Özellikle bulmak ve karın boşluğunda karaciğer, böbrekler ve dalak belirlemek. Not herhangi bir renk değişiklikleri, büyüklük farklılıkları, ve eksik veya mislocated organları. Yüzeylerin tutarlılık, herhangi bir ek doku (örneğin, kitleler), sıvı cepleri, ya da karın / torasik boşluklarında sıvı varlığında unutmayın.
- Kalınlaşmış duvar, kitleler ve / veya kanama için özel bir dikkat göstererek, gastrointestinal içeriğini sistem, ya da içeriğini eksikliği dikkat edin. Herhangi bir anormallik parankim kontrol etmek için bir neşter veya ustura bıçağı ile böbrekler (orta hat-boyuna sol bölümünde, sağ-kesit, ancak off-center) İnsizyon. Mezenter lenf düğümleri ve / veya kitleler için kontrol edin.
- Tıkanıklıkları, sıvı cepleri, kanama veya diğer anormallikleri arıyorsanız, ürogenital sistem inceleyin.
3. Postmortem toplama, kalp, karaciğer, böbrekler, ve dalak histopatoloji için
- (NBF) tamponlu formalin,% 10 nötr uygun bir miktar dolu etiketli konteyner (ler) uygun boyutta toplayın. 20:01 oranı fiksatif bir doku elde etmek için% 10 NBF miktarını ayarlayın.
- Dorsal yatma fare veya sıçan karkas temiz bir diseksiyon kurulu veya benzer çalışma yüzeyine yerleştirin ve doku ortaya çıkar.
- Doku forseps ve makas kullanılarak karkas çıkarın.
- Doku, yağ ve gereksiz bağ dokusu yakından kaldırmak için kesilmiş olmalıdır. Doku kan temiz olmalı, gerektiğinde durulama normal kullanım (veya fizyolojik) tuzlu su). Dokularda durulama için distile veya musluk suyu asla kullanmayın.
- Doku% 10 NBF konteyner içine yerleştirin.
- % 10 NBF uygun miktarda dolu etiketli konteyner (ler) uygun boyutta toplayın. 20:01 oranı fiksatif bir doku elde etmek için% 10 NBF miktarını ayarlayın.
- Temiz bir diseksiyon kurulu veya benzeri bir çalışma yüzeyi sırt yatma fare veya sıçan karkas yerleştirin.
- Trakea, kalp ve akciğerler Açığa.
- Makas ve forseps kullanma ventral göğüs ve boyun bölgeleri örten deri ve kas çıkarın.
- Makas ve forseps kullanma, göğüs kafesi, akciğer lobları iyice incelemek için yeterince geniş bir alan açmak için 2 göğüs kafesinin her iki tarafındaki yanal kadar keser, daha sonra üzerinde tek bir klavikula yakın yaparak kalp ve akciğerler açığa çıkarın.
- Trakea üzerinde olanlar da dahil olmak üzere, sternum ve kaburga çene kadar uzanan boyun kasları kesip.
- Makas, kaburga kafesinin ön kenar altında takın ve trakea üzerinde kemik bölümü kaldırmak için, her iki tarafta, 2 kesimler yapmak.
- Forseps ile trakea çene yakın tutun ve forseps üzerine yerleştirilen makas ile trakea yoluyla tamamen kesmek
- Tüm torasik dokular hafifçe kadar makas ile ventral doku bağlantıları kırpma, forseps kullanarak trakea yukarı römorkör (trakea, akciğerler, kalp, bu bazen "koparmak" denir) vücut çıkarıldı.
- Akciğerlerin çalışma yüzeyinin düz yatırın.
- Trakea çevresinde sıkı çekin özen dikiş materyali veya mutfak sicim gevşekçe bir parça bağlarlar.
- Bir şırınga fiksatif ile doldurun ve trakea girmek için yeterince küçük bir iğne takılır. Fareler için 26 gauge iğne ile 1 ml veya 3 ml şırınga iyi çalışır. Sıçanlar için 18 gauge bir şırınga ile bir 5ml şırınga iyi çalışır.
- Trakeanın ağzına iğne takın ve iğne çevreleyen trakea tutmak için forseps kullanabilir. Fiksatif ile ciğerlerine doldururken yavaş yavaş başlayın.
- Akciğerleri tam şişirilmiş kadar doldurun. Aşırı ya da underinflate etmeyin. Fiksatif akciğerler tamamen şişirmek için gerekli miktarı, yaş, gerginlik ve hayvan sağlığı ile değişir.
- Aşırı-enflasyon sızan ve akciğer dokusunda köpük sıvı tarafından tespit edilir.
- Underinflation, tüm alanlarda, düz ve dolu değil görünmesini akciğerler tarafından tespit edilmiştir.
- Trakea iğne çıkarın.
- Dikiş materyali veya akciğerlerin fiksatif dışarı akışı önlemek için trakea çevreleyen dize sıkın.
- Doku oranı yaklaşık 20:01 fiksatif kullanarak şişirilmiş akciğerler fiksatif içine yerleştirin.
5. Beynin postmortem toplama
- % 10 NBF uygun miktarda dolu etiketli konteyner (ler) uygun boyutta toplayın. 20:01 oranı fiksatif bir doku elde etmek için% 10 NBF miktarını ayarlayın.
- Temiz bir diseksiyon tahtası ya da benzer bir çalışma yüzeyine ventral yatma ötenazi fare veya sıçan karkas yerleştirin.
- Makas ve forseps kullanma, calvaria örten deri ve kas çıkarın.
- Makaslar kullanılarak karkas tamamen baş kaldırmak.
- , Küçük makas, foramen magnum, kafatası spinal kanal içine açılır açılış alt bıçağının kullanılması ve muhafaza makas ipuçları yukarı çekti, doğrudan ve calvaria orta hat üzerinden kesme başlar.
- Forseps kullanarak, beynin maruz calvaria her iki yarısı da geri yansıtır.
1. Mümkün olduğunda, kafatası ise hala fiksatif içine maruz kalan bir beyin. Bu doku, gerekirse kafatası kaldırılması için önce firma olmayı sağlayacaktır. Birçok patologlar bölümlerde ise hala beyin kafatasının kesilmiş olduğunu tercih ediyor.
- Bu yerçekimi doku kafatası düşmesine yardımcı olacak, böylece kafatası hafifçe çevirin.
- Kavisli bir forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde, beyin kapsamında ve beyincik doğru hareket eden, beynin dış kenarı boyunca ve koku alma lobları başlayan beyin altında forseps slayt. Yavaşça kafatası düşen beyin inhibe forseps herhangi bir bağ dokusu veya sinirlerin tutam.
- Fiksatif için bir doku yaklaşık 20:01 oranını kullanarak beyin fiksatif içine yerleştirin.
6. Postmortem toplama mezenterik lenf düğümleri (MLN)
- PCR analizi için doku toplama aseptik teknik kullanılarak yapılmalıdır. Alev, sterilize otoklav veya eşdeğer steril aletlerin kullanılması gerekir.
- Steril Eppendorf tüpleri ve steril makas ve forseps birleştirin.
- Temiz bir diseksiyon kurulu veya benzeri bir çalışma yüzeyi sırt yatma ötenazi fare veya sıçan karkas yerleştirin.
- Steril makas ve forseps kullanarak göğüs kafesi tabanı, genital bölgede ventral karın duvarı insizyonHem cilt ve kas kaldırma ve bağırsaklarda ortaya.
- MLN çekum hemen bitişiğinde, kolon boyunca mezenterik doku karın boşluğuna bulunmaktadır.
- MLN bulmak için, öncelikle, büyük bağırsak, virgül şeklinde bölümünde çekum bulun. Kolon, çekum uzanan ve genellikle fekal pelet varlığı tespit edilebilir. MLN çekum komşu kolon boyunca mezenter bulunmaktadır. Beyaz mezenterik doku doku sarı, oval veya küresel küçük yumru olarak tanımlanır ve genellikle etrafındaki mezenter ve yağ dokusu daha biraz daha kalın ve sıkı olabilir. Yönlendirme için gerekli anatomi ders kitapları kullanın.
- Aseptik teknik ve steril aletler kullanarak tanımlayıcı bilgiler etiketli bir Eppendorf tüp içine MLN ve yer çıkarın.
7. Postmortem toplama solunum aspirat
- Gerekli malzemeleri birleştirin - steril pipet, steril makas ve forseps, steril solüsyonların kullanımı, solunum yolu ile yıkanmalıdır ve temiz bir diseksiyon kurulu veya benzer bir çalışma yüzeyi.
- Kesme tahtası üzerinde sırt yatma ötenazi fare veya sıçan karkas yatırın.
- Sıçanlarda bronşiyal aspirat, trakea yoluyla solunum yolu erişebilirsiniz. Trakea yoluyla veya nazofarengeal meatus yoluyla sıçan, erişim, burun aspirat. Farelerde bronş ya da burun aspiratlar, nazofarengeal meatus yoluyla solunum yolu erişebilirsiniz.
- Nazal ve bronşial aspiratlar gerekmesi durumunda, ilk olarak bronşiyal aspirat gerçekleştirin. Burun aspirat yeni bir steril pipet kullanarak gerçekleştirin.
- Trakeal erişim (sıçanlar için önerilen yöntem):
- Deri, derialtı dokularda açığa servikal bölgede uzak yansıtmaktadır.
- Tükürük bezleri ve servikal trakea maruz kas çıkarın.
- Lümen erişimine izin vermek için steril aletler kullanarak, trakea insizyon. Toplama boyunca asepsi (adım 7.7) koruyun.
- Nazofaringeal meatus erişimi (burun aspirat ve bronş aspirat, trakea küçük boyutu nedeniyle fareler için önerilen yöntem):
- Bu prosedür, burun aspirat ve bronş aspiratı her ikisi için de yapılabilir.
- Alev sterilize veya otoklava aletleri kullanarak, temporomandibular eklem (çene) sever ve maksillanın uzak mandibula yansıtacak, nazofarengeal meatus açığa. Toplama boyunca asepsi (adım 7.7) koruyun.
- Örnekleme sıvı yaklaşık 1ml steril bir pipet içine çizin. Bu normal tuzlu su, fosfat tamponlu salin ya da Triptikaz Soya suyu. (Toplama aspirat göre, 7.8 veya 7.9 adıma gidin.)
- Bronş aspirat:
1. Aseptik kaudal yönettiği, trakeal lümen içine pipet yerleştirin ve yavaş yavaş, bronş ve akciğer içine örnekleme sıvısı enjekte. Pipet, bronşlar ve akciğerlerden örnekleme sıvı çekiniz ve trakea pipet kaldırmak. Tüm sıvı pipet içine dönecektir. Daha fazla sıvı test için ihtiyaç duyulması halinde tekrarlayın.
- Burun aspirat:
- Aseptik nazofarengeal meatus (fare) veya cranially yönettiği trakeal lümen (sıçan), pipet yerleştirin ve yavaş yavaş, burun boşluğuna örnekleme sıvı enjekte.
- Nazal kavite, pipet ile, ya da zorla, burun orifis (burun) ya da saydam bir ağız damak görünür sıvı olarak menisküs şekillendirme olarak görülen boşluğu, içine sıvı gözlem nazal damak temas ile varılan olduğundan emin olun. Ağız yoluyla sıvı çıkmadan görülmemelidir. Eğer öyleyse, yeniden yönlendirmek pipet.
- Pipet içine nazal kavite örnekleme sıvı çekiniz ve meatus veya trakea pipet kaldırmak.
- Test için uygun ortam veya konteyner aseptik örnek aktarın.
8. Temsilcisi sonuçları
Şekil 1 fare Abdominal ve torasik organlar. Bu organlar, bir hayvan ilk açıldığında (organların hiçbiri, karın boşluğunda da mevcut diğer organların açığa taşındı) tipik olarak görülebilir.) Timus, b) kalp, c) akciğer, d) diyafram, e ) karaciğer , f) küçük bağırsak, g) çekum, h) mesane.
Şekil 2 fare abdominal ve retroperitoneal organlar. Bağırsak ve karaciğer kaldırdı ve (veya kaldırılabilir) taşınır varsa, bu organların ca, kolon azalan, mide n görülmektedir. a) karaciğer (referans için), b) bağırsak (referans için), c), d) dalak, e) böbrekler, f), g) rahim.
Şekil 3. Erkek üreme organları. Bu, daha büyük, cinsel olarak olgun erkeklerde daha büyük olabilir.) Seminal veziküller ve pıhtılaştırma bezleri, b) testis (fare ve sıçanlarda açık kalır kasık yüzük, karın boşluğu ile skrotum içine itti), c) mesane, d) prepusyal bezleri, e) epididim.
Şekil 4 Kadın üreme organları) olmayan gravid rahim (fareler ve sıçanlar bir bicornuat rahim) b), yumurtalık yağ yastığı, c gömülü yumurtalık), mesane, d) klitoral bezleri (erkek prepusyal bezleri benzer) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Veri toplama bir çalışmanın sonunda hayvanların postmortem muayene gerekebilir. Görülen şeyin iyi tanımlamak ve tüm dokularda incelemek unutmayın. Bu prosedürler, öncelikle nekropsi ve örnek toplama bulaşıcı hastalık gözetim için optimize etmek için tasarlanmıştır, ama en kolay prosedürleri belki de yalnızca bir alt kümesini istihdam olacağı hastalık şüphesi olayları ya da salgınlar odaklı araştırmalara uyarlanmıştır. Prosedürlerin çoğu aynı zamanda daha yaygın bir sonraki analiz için özel çalışma örneklerinin koleksiyonu ile birleştiğinde, genel bir morfolojik değerlendirmenin bir parçası olarak araştırma çalışmalarının bitiminde yapılan necropsies ilgili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu hizmetlerin ticari sunulmaktadır Charles River laboratuvar kemirgen teşhis laboratuvarı, tüm çalışanları vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5" length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5" |
| Large scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6826, G65" | 6.25" |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5", serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS--8160 | Rat tooth |
| Flame sterilizer | Oxford Labware | Bacti-Cinerator #5889-001007 | |
| Scalpel | Cancer Diagnostics, Inc. | Finger Scalpels #60, Cat#FS0060 | |
| Pipettes | VWR international | Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400 | |
| Autoclave bags | Propper Manufacturing Company | Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 | For Pasteur pipettes |
| Pipette bulb | VWR international | Cat#56310-240 | |
| Eppendorf tubes | Sarstedt Ltd | SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695 | |
| Eppendorf tubes | Argos | 5mL microtube Cat#T20765-C | |
| Syringe | BD Biosciences | 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661 | |
| Needles | BD Biosciences | 26G-309625 18G-305195 | |
| Neutral buffered formalin | VWR international | 20L 10% NBF, Cat#16004-128 | |
| Saline | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178 | |
| Trypticase soy broth | BD Biosciences | TSB: Dehydrated, Cat#211825 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | HA Buffer, Cat#P3813-10PAK | |
| Formalin cups | VWR international | 4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858 | |
| Large formalin cups | OakRidge Products | 32oz container Cat#0432-1100 | |
| Extra large formalin cup | VWR international | HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282 | |
| Suture material | Henry Schein | Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750 | For mouse lung inflation |
| Twine | Staples | Cat#QUA-46173 | For rat lung inflation |
References
- AVMA. AVMA Guidelines on Euthanasia. , (2007).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the rabbit. , CRC Press. (1988).
- King, J. M., Dodd, D. C., Roth, L. The Necropsy Book. , 4th edn, C.L. Davis Foundation. (2006).
- Kittel, B. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Fox, J. G. Chapter 1. The Mouse in Biomedical Research. , Elsevier. Vol. 3: Normative biology, husbandry, and models 1-22 (2007).
- Morawietz, G. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).
- Ruehl-Fehlert, C. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
