Summary
Dit artikel beschrijft de procedures voor het uitvoeren van een elementaire post-mortem onderzoek van een muis of rat, en de verzameling van fundamentele organen, maar ook meer uitdagend soorten monsters uit voor histologische, microbiologische en PCR evaluatie.
Abstract
Er zijn meerdere soorten monsters die kunnen worden verzameld uit een ingeslapen dier om te helpen bij de diagnose of besmettelijke stoffen te ontdekken in een dier kolonie. Correcte inning van weefsels voor de verdere histologische verwerking kan invloed hebben op de kwaliteit van de testresultaten. Dit artikel beschrijft het gedrag van een vaste bruto onderzoek inbegrip van de identificatie van het hart, de lever, longen, nieren en milt, maar ook hoe je die organen te verzamelen. Bovendien vier van de moeilijkere weefsel / monsterneming technieken worden gedemonstreerd. Long-collectie en perfusie kan bijzonder uitdagend als het weefsel moet goed worden opgeblazen met een fixeermiddel, zodat de binnenkant van het weefsel goed te repareren en om een grondige histologische evaluatie mogelijk te maken. Dit artikel toont de stap voor stap techniek om de longen te verwijderen en het opblazen met een fixatief om een optimale fixatie van het weefsel te bereiken binnen 24 uur. Brain collectie kan al net zo uitdagend als het weefsel is zacht en gemakkelijk beschadigd. Dit artikel toont de stap voor stap techniek om bloot te leggen en de hersenen uit de schedel met minimale schade aan het weefsel. De mesenteriale lymfeklieren is een goed voorbeeld het type om in te veel voorkomende ziekteverwekkers te detecteren als enterische virussen langer blijven in de lymfklier dan ze zijn schuur in ontlasting. Dit artikel toont de stap voor stap procedure voor het lokaliseren en aseptisch het verwijderen van de mesenteriale lymfeklieren. Tenslotte kan de identificatie van besmettelijke agenten van de luchtwegen worden uitgevoerd door bacteriële cultuur of PCR-test van de neus-en / of bronchiale vloeistof zuigt genomen op autopsie. Deze procedure beschrijft het verkrijgen en het voorbereiden van de luchtwegen aspireren steekproef voor bacteriële cultuur en PCR-test.
Protocol
1. Voorbereiding van de autopsie
- Belangrijke onderdelen van een bruto post mortem onderzoek (bruto obductie) zijn de geschiedenis van het dier en de beschrijving van de bevindingen.
- Een veterinair patholoog het lezen van uw histopathologie dia's misschien niet gezien hebben het dier en is afhankelijk van u voor de achtergrond informatie.
- Beschrijf precies wat je ziet voordat je het dier laten inslapen. Bijvoorbeeld, "vrouwelijke muizen, een van de vijf in de kooi, C57BL/6N, het hoofd schuin naar rechts" of "bruin mannen rat; stam onbekend; dier is krabben, er is fragmentarisch haaruitval op de rug, de buurt van de staart en hoofd ".
- Gebruik heldere, beschrijvende, objectieve taal. Modifiers zoals "mild", "matig" en "ernstig" kan nuttig zijn als de cutoffs tussen de niveaus zijn duidelijk afgebakend. Het beschrijven van zaken op het gebied van voedsel of huishoudelijke voorwerpen wordt over het algemeen niet aanbevolen.
- Wegen en meten dieren, bevindingen, of organen is vaak handig. Een "grote milt" om u misschien een normale milt naar een andere waarnemer te zijn. Zeggen dat de milt maatregelen 3cm x 1,5 cm zorgt voor meer objectieve informatie.
- Photodocumentation kan van onschatbare waarde.
- Neem alle relevante gezondheids-en persoonlijke beschermingsmiddelen die nodig zijn voor het werken met levende dieren, met potentieel infectieuze kadavers, of chemische stoffen, zoals formaline.
2. Gross postmortem locatie en het onderzoek van hart, longen, lever, nieren en milt
- Verzamel de nodige voorraden voorafgaand aan euthanasie van het dier. Minimaal dient hierbij ook een dissectie board of soortgelijk werk oppervlak, tang, schaar, etiketten voor containers, fixatief, en alle media-of verzameling buizen / cups die kan mogelijk nodig zijn.
- Kort beoordelen van de conditie, het gedrag, en de beweging van het dier. Observeren en registreren de ademhaling patronen (bijvoorbeeld, snelle, ondiepe) en ambulante capaciteit en manier van lopen (bijvoorbeeld mank lopen, cirkelende, tremoren).
- Euthanaseren het dier volgens de standaard procedures op uw instelling, altijd vasthouden aan de AVMA richtlijnen.
- Beoordeel het dier lichamelijke conditie van huid en vacht afwijkingen, vermagering, of uitdroging. Noteer kunstmatige manipulaties, implantaten, of chirurgische littekens.
- Onderzoek alle externe lichaamsopeningen (oren, ogen, neus, anus, genitale openingen, en de mondholte). Het gebruik van een ontleding ruimte wordt aanbevolen voor nadere observatie.
- Leg de muis of rat gedood karkas in dorsale decubitus op een schone dissectie board of soortgelijk werk oppervlak.
- Met een schaar, incise de huid de volle lengte van de ventrum van de anus aan de kin, die de huid en incisie van de buikwand, waardoor de buikorganen, speeksel-en preputiale / clitorale klieren, en baarmoederhals-en axillaire lymfeklieren. Snijd de ribbenkast bloot te leggen en de thoracale ingewanden te onderzoeken door het maken van twee sneden zijwaarts tot elke kant van de ribbenkast, dan een over, aan de bovenkant van het borstbeen, een ruimte breed genoeg is om grondig te onderzoeken alle kwabben van de long te openen.
- Onderzoek de verschijning van de spier structuur.
- Evaluatie van alle organen voor afwijkingen. In het bijzonder vinden en identificeren van de hart en de longen in de borstholte. In het bijzonder vinden en identificeren van de lever, nieren en milt in de buikholte. Let op elke kleur verandert, de grootte verschillen, en ontbrekende of mislocated organen. Let op de consistentie van oppervlakken, eventuele extra weefsel (bijvoorbeeld, massa), vloeistof zakken, of de aanwezigheid van vocht in de buik / borstkas holtes.
- Let op het maag-darmkanaal voor de inhoud, of gebrek aan inhoud, met bijzondere aandacht voor de verdikte wanden, massa's, en / of bloeding. Incise de nieren (linker-langsdoorsnede, rechts-doorsnede, op middellijn, maar niet in het midden) met een scalpel of scheermesje op parenchym controleren op eventuele afwijkingen. Controleer het mesenterium voor een vergrote lymfeklieren en / of de massa's.
- Onderzoek de urogenitale systeem, op zoek naar blokkades, vocht zakken, bloedingen of andere afwijkingen.
3. Postmortem collectie van hart, lever, nieren en milt voor histopathologie
- Verzamel de juiste grootte, geëtiketteerde container (s) gevuld met een geschikte hoeveelheid van 10% neutraal gebufferde formaline (NBF). Pas de hoeveelheid van 10% NBF om een 20:1 verhouding van fixatief te verkrijgen weefsel.
- Plaats de muis of rat karkas in dorsale decubitus op een schone dissectie board of soortgelijk werk oppervlak en bloot het weefsel van belang.
- Verwijder het weefsel van het karkas met behulp van pincet en een schaar.
- Weefsel moeten nauwkeurig worden bijgesneden om vet en onnodige bindweefsel te verwijderen. Weefsel moet vrij zijn van bloed, het gebruik normaal (of fysiologische) zout) om te spoelen als dat nodig is. Gebruik nooit gedestilleerd of kraanwater om weefsels te spoelen.
- Leg het weefsel in de container van 10% NBF.
- Verzamel de juiste grootte, geëtiketteerde container (s) gevuld met een geschikte hoeveelheid van 10% NBF. Pas bedrag van 10% NBF om een 20:1 verhouding van fixatief te verkrijgen weefsel.
- Plaats de muis of rat karkas in dorsale decubitus op een schone dissectie board of soortgelijk werk oppervlak.
- Expose de luchtpijp, het hart en de longen.
- Met een schaar en pincet te verwijderen van de huid en de spieren bovenliggende de ventrale thoracale en cervicale regio's.
- Met een schaar en pincet, verwijder de ribbenkast het blootstellen van de hart en de longen door het maken van twee sneden zijwaarts tot elke kant van de ribbenkast, dan een over de buurt van het sleutelbeen naar een ruimte breed genoeg is om grondig te onderzoeken alle kwabben van de long te openen.
- Knip de nekspieren zich uitstrekt van het borstbeen en de ribben aan de kaak, met inbegrip van die bovenliggende de luchtpijp.
- Plaats een schaar onder de voorste rand van de ribbenkast en maak twee delen, een aan elke kant, naar het gedeelte van het bot bedekken de luchtpijp te verwijderen.
- Pak de luchtpijp in de buurt van de kaak met een tang en snijd volledig door de luchtpijp met een schaar boven de tang
- Trek voorzichtig de luchtpijp naar boven met behulp van de tang, afknippen ventrale weefsel verbindingen met een schaar tot de volledige set van de thoracale weefsels (luchtpijp, longen en het hart, dit wordt ook wel het "plukken") is verwijderd uit het lichaam.
- Leg de longen plat op het werkblad.
- Losjes das een stuk hechtmateriaal of keuken touw rond de luchtpijp zorg niet te strak te trekken.
- Vul een spuit met een fixatief en bevestig een naald die klein genoeg is om de luchtpijp te voeren. Voor muizen, een 1 ml of 3 ml spuit met een 26 gauge naald werkt goed. Voor ratten, een 5 ml spuit met een 18 gauge spuit werkt goed.
- Steek de naald in de opening van de luchtpijp en een tang om de luchtpijp rond de naald vast te houden. Begin langzaam vullen van de longen met een fixatief.
- Vul de longen tot volledig opgeblazen. Niet over-of underinflate. De hoeveelheid fixeermiddel die nodig is om volledig te blazen de longen varieert per leeftijd, stam, en de gezondheid van het dier.
- Over-inflatie wordt gedetecteerd door vloeistof sijpelde en schuimvorming van het longweefsel.
- Te lage bandenspanning wordt gedetecteerd door de longen verschijnen vlak en niet volledig op alle gebieden.
- Verwijder de naald uit de luchtpijp.
- Draai de hechtmateriaal of touw rond de luchtpijp om terugstromen van fixatief uit de longen te voorkomen.
- Leg de opgeblazen longen in fixatief met behulp van een benadering 20:1 fixatief om weefsel ratio.
5. Postmortem verzameling van de hersenen
- Verzamel de juiste grootte, geëtiketteerde container (s) gevuld met een geschikte hoeveelheid van 10% NBF. Pas bedrag van 10% NBF om een 20:1 verhouding van fixatief te verkrijgen weefsel.
- Plaats de muis of rat gedood karkas in ventrale decubitus op een schone dissectie board of soortgelijk werk oppervlak.
- Met een schaar en pincet, verwijder de huid en spieren van de bovenliggende Calvaria.
- Met een schaar volledig verwijderen van de kop van het karkas.
- Met behulp van een klein schaartje plaatst het ondermes in het foramen magnum, de opening waar de schedel opent in het wervelkanaal, en het houden van schaar tips wees naar boven, gaan knippen direct omhoog en door de middellijn van het Calvaria.
- Met behulp van een tang, weerspiegelen achter beide helften van de Calvaria het blootstellen van de hersenen.
1. Indien mogelijk, plaats de blootgestelde hersenen in fixatief, terwijl nog in de schedel. Dit zal toelaten het weefsel te worden vast voorafgaand aan de verwijdering uit de schedel, als dat nodig is. Veel pathologen de voorkeur aan dat delen worden gesneden van de hersenen nog in de schedel.
- Keer de schedel, zodat de zwaartekracht zal helpen het weefsel te vallen van de schedel.
- Met behulp van gebogen tang, schuif de tang langs de buitenrand van de hersenen en in de hersenen te beginnen bij de olfactorische kwabben, die zich onder de grote hersenen en naar de kleine hersenen. Knijp met de tang een bindweefsel of zenuwen die de hersenen remmen vallen van de schedel.
- Plaats de hersenen in fixeermiddel met behulp van een bij benadering 20:1 verhouding van het weefsel te fixeermiddel.
6. Postmortale collectie van de mesenteriale lymfeklieren (MLN)
- Weefsel collectie voor PCR-analyse moet worden gedaan met gebruikmaking van aseptische techniek. Vlam gesteriliseerd, geautoclaveerd of equivalent gesteriliseerde instrumenten moeten worden gebruikt.
- Monteer steriel Eppendorf buisjes en steriele schaar en pincet.
- Plaats de muis of rat gedood karkas in dorsale decubitus op een schone dissectie board of soortgelijk werk oppervlak.
- Met behulp van gesteriliseerde schaar en pincet incise de ventrale buikwand van het genitale gebied aan de onderkant van de ribbenkast, Het verwijderen van zowel de huid en de spieren en het blootstellen van de darmen.
- De MLN bevinden zich in de buikholte in de mesenteriale weefsel langs de dikke darm, direct grenzend aan de blindedarm.
- Te vinden van de MLN, eerst het de blindedarm, die de grote, komma vormig deel van de darm. De dubbele punt strekt zich uit van de blindedarm en het kan vaak worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van fecale pellets. De MLN bevinden zich in het mesenterium langs de dikke darm grenzend aan blindedarm. Het kan worden geïdentificeerd als een gele, eivormige of bolvormige kleine brok van weefsel in de witte mesenteriale weefsel en is vaak iets dikker en steviger van structuur dan de omringende mesenterium en vet. Gebruik anatomie tekst boeken als noodzakelijk voor oriëntatie.
- Met behulp van aseptische techniek en steriele instrumenten verwijder de MLN en plaats in een eppendorfbuisje gemerkt met identificerende informatie.
7. Postmortem verzameling van respiratoire aspiraat
- Monteer nodig supplies - steriele pipet, steriele schaar en pincet, steriele oplossingen te worden doorgespoeld de luchtwegen, en een schone ontleedkamer board of soortgelijk werk oppervlak.
- Leg de muis of rat gedood karkas in dorsale decubitus op het ontleden boord.
- Voor de bronchiale aspireren bij ratten, toegang tot de luchtwegen door middel van de luchtpijp. Voor nasale aspireren bij ratten, toegang hetzij via de luchtpijp of via de nasofaryngeale gehoorgang. Voor bronchiale of nasale zuigt bij muizen, toegang tot de luchtwegen door de nasofaryngeale gehoorgang.
- Indien zowel nasale en bronchiale zuigt nodig zijn, voert u eerst de luchtwegen aspireren. Voer neus aspireren met een nieuwe steriele pipet.
- Tracheale toegang (aanbevolen methode voor ratten):
- Reflect de huid weg van het cervicale gebied om onderhuidse weefsel bloot te leggen.
- Verwijder de speekselklieren en de cervicale musculatuur aan de luchtpijp bloot te leggen.
- Met behulp van steriele instrumenten, incise de luchtpijp om de toegang tot het lumen mogelijk te maken. Onderhouden asepsis hele collectie (Ga naar stap 7.7).
- Nasopharyngeal gehoorgang toegang (neus aspireren en bronchiale aspiratie, aanbevolen methode voor muizen te wijten aan de kleinere omvang van de luchtpijp):
- Deze procedure kan worden uitgevoerd voor zowel de nasale en bronchiale aspireren aspireren.
- Met behulp van vlam-gesteriliseerd of geautoclaveerd instrumenten, verbreken van de temporomandibulaire (kaak), gewrichts-en weerspiegelen de onderkaak uit de buurt van de bovenkaak, waardoor de nasofaryngeale gehoorgang. Onderhouden asepsis hele collectie (Ga naar stap 7.7).
- Teken ongeveer 1 ml van de monsterneming vloeistof in een steriele pipet. Dit kan een normale zoutoplossing worden, fosfaat gebufferde zoutoplossing, of trypticasesoja bouillon. (Ga naar 7.8 of 7.9 stap, afhankelijk van welke aspireren u verzamelen.)
- Bronchiale aspireren:
1. Aseptisch invoegen pipet in tracheale lumen, caudaal gericht, en injecteer langzaam de bemonstering vloeistof in de bronchiën en de longen. Trek de bemonstering vloeistof uit de bronchiën en de longen in de pipet en verwijder de pipet uit de luchtpijp. Niet alle van de vloeistof zal terugkeren in de pipet. Herhaal dit als er meer vloeistof nodig is voor het testen.
- Nasale aspireren:
- Aseptisch te voegen pipet in de nasofaryngeale gehoorgang (muizen) of tracheale lumen (ratten), craniaal gericht, en langzaam de bemonstering vloeistof injecteren in de neusholte.
- Zorg ervoor dat de neusholte wordt bereikt door contact van de nasale gehemelte met de pipet tip, of door observatie van vocht gedwongen in de holte, gezien als menisci vormen bij de nasale opening (neusgaten) of als vloeistof zichtbaar door de doorzichtige mondeling gehemelte. Vloeistof mag niet gezien worden verlaten via de mond. Als dat zo is, heroriënteren van de pipet.
- Trek de bemonstering vloeistof uit de neusholte in de pipet en verwijder de pipet uit de gehoorgang of de luchtpijp.
- Steriel monster geschikte media of een container voor het testen.
8. Representatieve resultaten
Figuur 1. Buik-en thoracale organen in de muis. Deze organen zijn meestal zichtbaar als een dier voor het eerst geopend (geen van de organen zijn verplaatst naar andere organen ook aanwezig in de buikholte bloot te leggen). A) thymus, b) het hart, c) longen, d) membraan, e) de lever , f) dunne darm, g) blindedarm, h) urineblaas.
Figuur 2. Buik-en retroperitoneale organen in de muis. Als de darmen en de lever worden opgetild en verplaatst (of verwijderd), deze organen can worden gezien. a) de lever (voor de referentie), b) darmen (als referentie), c), maag, d) milt, e), nieren, f) colon descendens, g) baarmoeder.
Figuur 3. Mannelijke voortplantingsorganen. Deze kunnen groter zijn in grotere, seksueel volwassen mannetjes. A) zaadblaasjes en stollen klieren, b) testis (gedrukt in de buikholte van het scrotum via de lies ringen, die open blijven bij muizen en ratten), c) urineblaas, d) preputiale klieren, e) bijbal.
Figuur 4. Vrouwelijke voortplantingsorganen. A) niet-zwangere baarmoeder (muizen en ratten hebben een bicornuate baarmoeder), b), eierstok, begraven in een ovarium dikke pad, c) urineblaas, d) de clitoris klieren (analoog aan de mannelijke preputiale klieren) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het verzamelen van gegevens op het einde van een studie kan een post mortem onderzoek van dieren. Beschrijf goed wat is gezien en vergeet niet om alle weefsels te onderzoeken. Deze procedures zijn vooral gericht op autopsie en monstername te optimaliseren voor infectieziekten surveillance, maar de meeste zijn gemakkelijk aangepast aan de gerichte onderzoeken van vermoedelijke ziekte incidenten of uitbraken in die misschien slechts een subset van de procedures zou worden gebruikt. Veel van de procedures zijn ook relevant voor necropsies vaker uitgevoerd bij de afsluiting van het onderzoek onderzoeken in het kader van een algemene morfologische evaluatie gekoppeld aan een verzameling van de studie-specifieke monsters voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs zijn alle medewerkers van het laboratorium Charles River's knaagdier diagnostisch lab, waar deze diensten commercieel worden aangeboden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5" length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5" |
| Large scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6826, G65" | 6.25" |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5", serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS--8160 | Rat tooth |
| Flame sterilizer | Oxford Labware | Bacti-Cinerator #5889-001007 | |
| Scalpel | Cancer Diagnostics, Inc. | Finger Scalpels #60, Cat#FS0060 | |
| Pipettes | VWR international | Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400 | |
| Autoclave bags | Propper Manufacturing Company | Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 | For Pasteur pipettes |
| Pipette bulb | VWR international | Cat#56310-240 | |
| Eppendorf tubes | Sarstedt Ltd | SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695 | |
| Eppendorf tubes | Argos | 5mL microtube Cat#T20765-C | |
| Syringe | BD Biosciences | 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661 | |
| Needles | BD Biosciences | 26G-309625 18G-305195 | |
| Neutral buffered formalin | VWR international | 20L 10% NBF, Cat#16004-128 | |
| Saline | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178 | |
| Trypticase soy broth | BD Biosciences | TSB: Dehydrated, Cat#211825 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | HA Buffer, Cat#P3813-10PAK | |
| Formalin cups | VWR international | 4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858 | |
| Large formalin cups | OakRidge Products | 32oz container Cat#0432-1100 | |
| Extra large formalin cup | VWR international | HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282 | |
| Suture material | Henry Schein | Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750 | For mouse lung inflation |
| Twine | Staples | Cat#QUA-46173 | For rat lung inflation |
References
- AVMA. AVMA Guidelines on Euthanasia. , (2007).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the rabbit. , CRC Press. (1988).
- King, J. M., Dodd, D. C., Roth, L. The Necropsy Book. , 4th edn, C.L. Davis Foundation. (2006).
- Kittel, B. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Fox, J. G. Chapter 1. The Mouse in Biomedical Research. , Elsevier. Vol. 3: Normative biology, husbandry, and models 1-22 (2007).
- Morawietz, G. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).
- Ruehl-Fehlert, C. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
