Summary
Den här artikeln beskriver förfaranden för utförande av en grundläggande obduktion undersökning av en mus eller råtta, och insamlingen av grundläggande organ, liksom mer utmanande typer prov från för histologisk, mikrobiologiska, och PCR utvärdering.
Abstract
Det finns flera provtyper som kan samlas in från ett avlivas djur för att hjälpa till att diagnostisera eller upptäcka smittämnen i ett djur koloni. Korrekt insamling av vävnader för vidare histologisk bearbetning kan påverka kvaliteten på testresultaten. Denna artikel beskriver genomförandet av en grundläggande grov undersökning inklusive identifiering av hjärta, lever, lungor, njurar och mjälte, samt hur man samlar in dessa organ. Dessutom fyra av de svårare vävnaden / provtagning tekniker demonstreras. Lung insamling och perfusion kan vara särskilt utmanande eftersom vävnaden måste rätt lufttryck med ett fixativ för att insidan av vävnad för att fixa rätt sätt och för att möjliggöra noggrann histologisk utvärdering. Den här artikeln visar steg för steg metod för att ta bort lungorna och blåsa det med fixativ för att uppnå optimal fixering av vävnaden inom 24 timmar. Brain samlingen kan vara lika utmanande eftersom vävnaden är mjuk och skadas lätt. Den här artikeln visar steg för steg metod för att avslöja och ta bort hjärnan från skallen med minimal skada på vävnaden. Den kröslymfknutor nod är ett bra exempel typ som att upptäcka många vanliga smittämnen som magsaftresistenta virus kvar längre i lymfkörtlar än de fälls i avföring. Den här artikeln visar steg för steg för att lokalisera och aseptiskt bort kröslymfknutor noden. Slutligen kan identifiering av smittämnen i luftvägarna utföras av bakteriekultur eller PCR-testning av nasal och / eller bronkial vätska aspirat tas vid obduktion. Denna procedur beskriver erhålla och förbereda luftvägarna aspirera prov för bakterieodling och PCR-testning.
Protocol
1. Förberedelse för obduktion
- Viktiga delar av all grov obduktion undersökning (obduktion) är historien om djur och beskrivningen av resultaten.
- En veterinär patolog läsa din histopatologi bilderna kanske inte har sett djuret och är beroende av dig för bakgrundsinformation.
- Beskriv exakt vad du ser framför dig euthanize djuret. Till exempel, "kvinnlig mus, en av fem i buren, C57BL/6N, huvudet lutat åt höger" eller "bruna hanråtta, stam okänd, djuret kliar, det finns fläckvis håravfall på dorsum, nära svansen och huvudet ".
- Använd tydlig, beskrivande, objektiv språk. Modifierare som "mild", "måttlig" och "svår" kan vara användbart om cutoffs mellan nivåerna är tydligt avgränsade. Beskriva saker i form av mat eller hushållsföremål rekommenderas generellt inte.
- Vägning och mätning av djur, fynd eller organ är ofta användbart. En "stor mjälte" för dig kan vara en normal mjälte till en annan observatör. Att säga att mjälten åtgärder 3cm x 1,5 cm ger mer objektiv information.
- Photodocumentation kan vara ovärderliga.
- Följ alla relevanta hälsa och personlig skyddsutrustning som krävs för att arbeta med levande djur, potentiellt smittsamma slaktkroppar, eller kemikalier såsom formalin.
2. Gross obduktion plats och undersökning av hjärta, lungor, lever, njurar och mjälte
- Samla nödvändiga förnödenheter innan avlivning av djuret. Minimalt, bör detta innehålla en dissektion styrelse eller liknande arbete yta, pincett, sax, etiketter för containrar, fixativ, och alla medier eller rör insamling / koppar som eventuellt kan behövas.
- Kortfattat bedöma tillstånd, beteende och förflyttning av djur. Observera och notera andningsmönster (t.ex., snabb, ytlig) samt ambulerande förmåga och gång (t.ex. haltande, cirklande, darrningar).
- Euthanize djuret enligt gällande rutiner på din institution, alltid fastnat på AVMA riktlinjer.
- Bedöma djurets kropp förutsättning för hud och päls avvikelser, avmagring, eller uttorkning. Anteckna några konstgjorda manipulationer, implantat eller kirurgiska ärrbildning.
- Undersök alla externa öppningar (öron, ögon, näsa, anus, genitala öppningar och munhåla). Användning av en dissekera utrymme rekommenderas för närmare undersökning.
- Lägg euthanized mus eller råtta stommen i rygg VILA på en ren dissektion board eller liknande arbetsyta.
- Använda sax, incisionsfilm huden fulla längd ventrum från anus till hakan, vilket återspeglar huden och öppning av bukväggen, utsätta buken inälvor, saliv och preputiala / klitoris körtlar, och livmoderhalscancer och armhålan lymfkörtlar. Skär bröstkorgen för att avslöja och utreda bröstkorgens inälvor genom att göra två snitt i sidled upp varje sida av bröstkorgen, sedan en över, på toppen av bröstbenet, att öppna ett utrymme stort nog för att grundligt granska alla lober i lungan.
- Undersök utseende muskuloskeletala struktur.
- Utvärdera alla organ för avvikelser. Specifikt hitta och identifiera hjärtat och lungorna i brösthålan. Specifikt hitta och identifiera de lever, njurar och mjälte i bukhålan. Notera vilken färg som helst förändringar, skillnader storlek och saknade eller mislocated organ. Notera överensstämmelsen mellan ytor, eventuella ytterligare vävnad (t.ex. massor), fickor vätska, eller förekomst av vätska i buken / bröstkorg hålrum.
- Observera mag-tarmkanalen för innehåll, eller brist på innehåll, med särskild uppmärksamhet för förtjockade väggar, massor, och / eller blödning. Incise njurarna (vänster längdsnitt, höger-tvärsnitt, på mittlinjen, men off-center) med en skalpell eller rakblad för att läsa parenkymet för något onormalt. Kolla krös för förstorade lymfkörtlar och / eller massorna.
- Undersök det urogenitala systemet, letar efter blockeringar, fickor vätska, blödningar eller andra avvikelser.
3. Obduktion samling av hjärta, lever, njurar och mjälte för histopatologi
- Samla lagom stora, märkt behållare (s) fylld med en lämplig mängd av 10% neutral buffrad formalin (NBF). Justera mängden 10% NBF för att få en 20:01 förhållandet fixativ till vävnad.
- Placera musen eller råttan stommen i dorsal VILA på en ren dissektion board eller liknande arbetsyta och exponera vävnad av intresse.
- Ta bort vävnad från stommen med hjälp av pincett och sax.
- Vävnad bör vara nära trimmas för att avlägsna fett och onödiga bindväv. Vävnad bör vara rena från blod, använda vanliga (eller fysiologisk) koksaltlösning) för att skölja efter behov. Använd aldrig destillerat eller kranvatten för att skölja vävnader.
- Placera vävnaden in i behållaren på 10% NBF.
- Samla lagom stora, märkt behållare (s) fylld med en lämplig mängd på 10% NBF. Justera mängden 10% NBF för att få en 20:01 förhållandet fixativ till vävnad.
- Placera musen eller råttan stommen i rygg VILA på en ren dissektion board eller liknande arbetsyta.
- Exponera luftstrupe, hjärta och lungor.
- Använda sax och pincett bort hud och muskler överliggande den ventrala bröstkorg och hals-regioner.
- Använda sax och pincett, ta bort bröstkorgen utsätta hjärtat och lungorna genom att göra två snitt i sidled upp varje sida av bröstkorgen, sedan en i närheten av nyckelbenet att öppna ett utrymme stort nog för att grundligt granska alla lober i lungan.
- Klipp bort nackmusklerna som sträcker sig från bröstbenet och revbenen till käken, inklusive de överliggande luftstrupen.
- Sätt in en sax under främre kanten av bröstkorgen och gör två snitt, ett på vardera sidan, för att ta bort den del av benet överliggande luftstrupen.
- Ta tag i luftstrupen nära käken med pincett och skär helt igenom luftstrupen med en sax placeras ovanför pincett
- Försiktigt ryck luftstrupen uppåt med hjälp av pincett, snipping ventrala vävnad förbindelser med sax tills hela uppsättningen bröstkorg vävnader (luftstrupe, lungor och hjärta, detta kallas ibland "plockar") har tagits bort från kroppen.
- Lägg lungorna platt på arbetsytan.
- Löst knyta en bit av suturmaterial eller kök snöre runt luftstrupen noga med att inte dra hårt.
- Fyll en spruta med fixativ och bifoga en nål som är tillräckligt liten för att komma in i luftstrupen. För möss fungerar en 1 ml eller 3 ml spruta med 26 gauge nål väl. För råttor, arbetar en 5 ml spruta med en 18 gauge spruta väl.
- Stick in nålen i öppningen av luftstrupe och använda pincett för att hålla luftstrupen omger nålen. Börja långsamt fylla lungorna med fixativ.
- Fyll i lungorna tills den är helt uppblåst. Inte över-eller underinflate. Den mängd fixativ som behövs för att till fullo blåsa upp lungorna varierar beroende på ålder, stam, och hälsa djuret.
- Över-inflationen upptäcks av vätska sipprar och skummande från lungvävnad.
- Underinflation upptäcks av lungorna visas plant och inte fullt ut i alla områden.
- Ta bort nålen från luftstrupen.
- Dra åt suturmaterial eller snöre runt luftstrupen för att förhindra backflöde av fixeringsmedel ut ur lungorna.
- Placera uppblåsta lungorna till fixativ med en ungefärlig 20:01 fixativ till vävnad förhållande.
5. Obduktion samling av hjärnan
- Samla lagom stora, märkt behållare (s) fylld med en lämplig mängd på 10% NBF. Justera mängden 10% NBF för att få en 20:01 förhållandet fixativ till vävnad.
- Placera euthanized mus eller råtta stommen i ventrala VILA på en ren dissektion board eller liknande arbetsyta.
- Använda sax och pincett, ta bort hud och muskler som ligger över calvaria.
- Använda sax bort huvudet helt från stommen.
- Använda en liten sax sätta ner bladet i foramen magnum, öppningen där skallen öppnas i ryggmärgskanalen och hålla sax tips pekade uppåt, börjar såga direkt upp och genom en mittlinje calvaria.
- Använd pincett, reflektera tillbaka båda halvorna av calvaria utsätta hjärnan.
1. Om möjligt, placera utsätts hjärnan i fixativ samtidigt i skallen. Detta gör att vävnaden blir fast innan det tas ut från skallen, om det krävs. Många patologer föredrar att delar skärs ut från hjärnan samtidigt i skallen.
- Vänd försiktigt skallen så att gravitationen hjälper vävnaden faller från skallen.
- Använda böjd pincett, skjut försiktigt pincetten längs den yttre kanten av hjärnan och i hjärnan börjar vid lukt loberna, flyttar under storhjärnan och mot lillhjärnan. Nyp försiktigt tag med pincetten någon bindväv eller nerver som hämmar hjärnan från att falla ur skallen.
- Placera hjärnan i fixativ med en ungefärlig 20:01 förhållandet vävnad till fixativ.
6. Obduktion samling av kröslymfknutor (MLN)
- Mjukpapper kollektion för PCR-analys bör göras med aseptisk teknik. Flame steriliserat, autoklaveras eller ekvivalent steriliserade instrument bör användas.
- Montera sterila Eppendorf-rör och steril sax och pincett.
- Placera euthanized mus eller råtta stommen i rygg VILA på en ren dissektion board eller liknande arbetsyta.
- Använda steriliserad sax och pincett incisionsfilm den ventrala bukväggen från underlivet till basen på bröstkorgen, Ta bort både hud och muskler och utsätta tarmen.
- Den MLN ligger i bukhålan i mesenteriala vävnaden längs tjocktarmen, i omedelbar anslutning till blindtarmen.
- För att hitta MLN, först lokalisera blindtarmen, som är den stora, komma formade delen av tarmen. Tjocktarmen sträcker sig från blindtarmen och det kan ofta identifieras genom närvaron av fekal pellets. Den MLN finns i tarmkäxet längs tjocktarmen intill blindtarmen. Det kan identifieras som en gul, ovala eller sfäriska liten klump av vävnad i den vita mesenteriala vävnaden och är ofta något tjockare och fastare i konsistensen än den omgivande tarmkäx och fett. Använd böcker anatomi text som behövs för orientering.
- Använd aseptisk teknik och sterila instrument ta bort MLN och placera i ett Eppendorf-rör märkta med identifierande information.
7. Obduktion samling av andningsskydd aspirera
- Montera nödvändiga förnödenheter - steril pipett, steril sax och pincett, sterila lösningar som skall spolas genom luftvägarna, och en ren dissekera board eller liknande arbetsyta.
- Lägg euthanized mus eller råtta stommen i rygg VILA på dissekera ombord.
- För bronkial aspirera på råttor, öppna luftvägarna genom luftstrupen. För nasal aspirera på råttor, tillgång till antingen genom luftstrupen eller genom nasofaryngealt meatus. För luftrören eller nasal aspirat hos möss, öppna luftvägarna genom nasofaryngealt meatus.
- Om både näsan och bronkerna aspirat behövs, utföra bronkial aspirera först. Utför nasal aspirera med en ny steril pipett.
- Luftrör tillgång (rekommenderad metod för råttor):
- Reflektera huden från cervikala området för att exponera subkutan vävnad.
- Ta bort spottkörtlar och halsmusklerna att exponera luftstrupen.
- Använda sterila instrument, incisionsfilm luftstrupen för att ge tillgång till lumen. Behåll aseptik hela samlingen (Gå till steg 7,7).
- Nasofaryngealt meatus tillgång (nasal Aspirera och bronkial aspirera, rekommenderad metod för möss på grund av den mindre storleken av luftstrupen):
- Detta förfarande kan göras för både nasala Aspirera och bronkial aspirera.
- Använda flam-steriliseras eller autoklaveras instrument, bryta temporomandibular (käke) gemensamt och spegla underkäken bort från överkäke, exponerar nasofaryngealt meatus. Behåll aseptik hela samlingen (Gå till steg 7,7).
- Rita cirka 1 ml provtagning vätska i en steril pipett. Detta kan vara vanlig koksaltlösning, buffrad fosfat saltlösning eller trypticase soja buljong. (Gå till steg 7,8 eller 7,9, beroende på vilken aspirera du samlar in.)
- Bronkial aspirera:
1. Aseptiskt in pipetten i luftrör lumen, regisserad caudally, och långsamt injicera provtagning vätska in i luftrören och lungorna. Dra provtagning vätska från bronker och lungor i pipetten och avlägsna pipetten från luftstrupen. Inte alla av vätskan kommer tillbaka i pipetten. Upprepa om mer vätska till provet.
- Nasal aspirera:
- Aseptiskt in pipetten i nasofaryngealt meatus (möss) eller luftrör lumen (råtta), regisserad cranially, och långsamt injicera provtagning vätska i näshålan.
- Se till att näshålan nås genom kontakt med näsans gommen med pipettspetsen eller genom observation av vätska tvingas in i hålrummet, ses som menisker som bildas i näsans öppning (näsborrarna) eller som vätska syns genom den genomskinliga muntliga gommen. Fluid bör inte ses spännande genom munnen. Om så är fallet, omorientera pipetten.
- Dra provtagning vätska från näshålan i pipetten och avlägsna pipett ur meatus och luftstrupen.
- Överför aseptiskt prov till lämpliga media eller behållare för test.
8. Representativa resultat
Figur 1. Buken och bröstkorg organ i musen. Dessa organ är oftast synliga när ett djur första gången öppnas (ingen av de organ som har flyttats till utsätta andra organ också i bukhålan). A) bräss, b) hjärta, c) lungor, d) membran, e) lever , f) små tarmar, g) blindtarmen, h) urinblåsan.
Figur 2. Mag-och retroperitoneala organ i musen. Om tarmen och levern lyfts och flyttas (eller tas bort), dessa organ Kalifornienn ses. a) lever (som referens), b) tarmarna (för referens), c) magen, d) mjälte, e) njurar, f) fallande kolon, g) livmodern.
Figur 3. Manliga reproduktionsorganen. Dessa kan vara större i större, könsmogna hanar. A) sädesblåsorna och koagulering körtlar, b) testiklar (skjuts in i bukhålan från pungen via ljumskarna, som fortfarande är öppna i möss och råttor), c) urinblåsan, d) preputiala körtlar, e) bitestikeln.
Figur 4. Kvinnliga fortplantningsorgan. A) icke-gravid livmoder (möss och råttor har en bicornuate livmodern) b) äggstock, begravd i en äggstockarna fett pad, c) urinblåsa, d) klitoris körtlar (analogt med den manliga preputiala körtlar) .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Datainsamling vid slutet av en studie kan kräva en obduktion undersökning av djur. Beskriv också vad som ses och kom ihåg att undersöka alla vävnader. Dessa procedurer har utformats främst för att optimera obduktion och provtagning för infektionssjukdomar övervakning, men de flesta är lätt anpassas till riktade undersökningar av misstänkt sjukdom incidenter eller utbrott där kanske endast en delmängd av de förfaranden som skulle användas. Många av de förfaranden som är relevanta även för obduktion oftare utförs i slutet av forskarstudier som en del av en övergripande morfologiska utvärdering tillsammans med insamling av studie-specifika prover för senare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna är alla anställda av Charles River laboratorium gnagare diagnostiska labb, där dessa tjänster erbjuds kommersiellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5" length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5" |
| Large scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6826, G65" | 6.25" |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5", serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS--8160 | Rat tooth |
| Flame sterilizer | Oxford Labware | Bacti-Cinerator #5889-001007 | |
| Scalpel | Cancer Diagnostics, Inc. | Finger Scalpels #60, Cat#FS0060 | |
| Pipettes | VWR international | Pasteur Pipet 5 3/4", Cat#14672-400 | |
| Autoclave bags | Propper Manufacturing Company | Sterilizer Bag Paper Pouches Cat#021002(3100923)E09110 | For Pasteur pipettes |
| Pipette bulb | VWR international | Cat#56310-240 | |
| Eppendorf tubes | Sarstedt Ltd | SafeSeal microtube 2mL, Ref#72.695 | |
| Eppendorf tubes | Argos | 5mL microtube Cat#T20765-C | |
| Syringe | BD Biosciences | 1ml-309602 3 ml-300910 5ml-309603 10mL Cat#309604 20mL Cat#309661 | |
| Needles | BD Biosciences | 26G-309625 18G-305195 | |
| Neutral buffered formalin | VWR international | 20L 10% NBF, Cat#16004-128 | |
| Saline | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Buffered Blood Bank Saline, Cat#23-309-178 | |
| Trypticase soy broth | BD Biosciences | TSB: Dehydrated, Cat#211825 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | HA Buffer, Cat#P3813-10PAK | |
| Formalin cups | VWR international | 4oz Cat#36318-852 8oz Cat#36318-860 16oz Cat#36318-858 | |
| Large formalin cups | OakRidge Products | 32oz container Cat#0432-1100 | |
| Extra large formalin cup | VWR international | HDPE Multipurpose 160oz container Cat#89038-282 | |
| Suture material | Henry Schein | Braided silk surgical suture, Ref#100-5000, M766750 | For mouse lung inflation |
| Twine | Staples | Cat#QUA-46173 | For rat lung inflation |
References
- AVMA. AVMA Guidelines on Euthanasia. , (2007).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the rabbit. , CRC Press. (1988).
- King, J. M., Dodd, D. C., Roth, L. The Necropsy Book. , 4th edn, C.L. Davis Foundation. (2006).
- Kittel, B. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
- Fox, J. G. Chapter 1. The Mouse in Biomedical Research. , Elsevier. Vol. 3: Normative biology, husbandry, and models 1-22 (2007).
- Morawietz, G. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
- Popesko, P., Raijtová, V., Horák, J. Colour Atlas of Anatomy of Small Laboratory Animals. 2, 1st edn, Saunders. vol. 2: Rat, mouse, hamster 91-106 (2002).
- Ruehl-Fehlert, C. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
