Generación robusta de hepatocitos como las células de las poblaciones humanas células madre embrionarias

Summary

Este artículo se centrará en la generación de endodermo hepático humano de las poblaciones humanas con células madre embrionarias.

Abstract

A pesar de los avances en la toxicidad de modelado humano de los medicamentos, muchos de los compuestos no durante los ensayos clínicos debido a efectos secundarios imprevistos. El costo de los estudios clínicos son importantes, por lo tanto, es esencial que más pantallas toxicología predictiva se desarrollan y despliegan desde el principio en el desarrollo de fármacos (Greenhough et al 2010). Hepatocitos humanos representan el modelo de referencia actual estándar para evaluar la toxicidad del fármaco, pero son un recurso limitado que muestran la función variable. Por lo tanto, el uso de líneas de células inmortalizadas y en modelos animales de tejido se utilizan de forma sistemática debido a su abundancia. Aunque ambas fuentes son de carácter informativo, se ven limitadas por una mala función, variabilidad de las especies y / o la inestabilidad en la cultura (Dalgetty et al 2009). Las células madre pluripotentes (PSC) son una fuente atractiva alternativa de hepatocitos humanos, como las células (HLC) (Medine et al 2010). PSC son capaces de auto-renovación y diferenciación a todos los tipos de células somáticas en el adulto y representa por lo tantouna fuente potencialmente inagotable de células diferenciadas. Hemos desarrollado un procedimiento que es simple, altamente eficiente, susceptibles de automatización y el rendimiento funcional HLC humanos (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 y Hay et al 2011). Creemos que nuestra tecnología dará lugar a la producción escalable de HLC para el descubrimiento de fármacos, la modelización de enfermedades, la construcción de dispositivos extra-corporal y tratamientos basados ​​en la posible trasplante de células.

Protocol

1. Preparación inicial de todas las acciones químicas y utensilios de plástico de revestimiento de la cultura

Todas las medidas que se llevarán a cabo en una campana de cultivo de tejidos en condiciones asépticas.

1. Preparación de factor humano de crecimiento de fibroblastos (hbFGF)
   1. Preparar solución al 10% de BSA en PBS y el filtro a través de un filtro de 0,22 micras.
   2. De la solución al 10% BSA preparar una solución de BSA al 0,2%.
   3. Añadir 10 ml de BSA al 0,2% hbFGF mg solution/100.
   4. Pre-humedezca un 0,22 micras filtro mediante el filtrado de 5 ml solución al 10% de BSA a través del filtro. Desechar los 10 ml BSA lavado.
   5. Filtrar la hbFGF a través del filtro de pre-lavado.
   6. Alícuota del hbFGF en eppendorfs estéril y almacenar a -20 ° C.
2. Preparación de la activina Humanos Una solución de archivo
   1. Añadir 1 ml de BSA al 0,2% en una jeringa y pre filtro húmedo el.
   2. Diluir la activina A en el 0,2% de BSA a una concentración de valores de 100 mg / ml.
   3. Filtro de las activin Una solución y alícuota en eppendorfs estéril, almacenar a -20 ° C.
3. Preparación de la solución del ratón de archivo Wnt3a
   1. Añadir 200 ul de PBS a un vial de 2 mg de Wnt3a a una concentración stock de 10 mg / ml.
   2. Alícuota en eppendorfs estéril y almacenar a -20 ° C.
4. Preparación de la solución de archivo HGF Humanos (1000X)
   1. Diluir el HGF en PBS a una concentración stock de 10 mg / ml.
   2. Filtrar la solución HGF y alícuota en eppendorfs estéril, almacenar a -20 ° C.
5. Preparación de la solución de archivo oncostatina M (1000X)
   1. Diluir la OSM en PBS a una concentración stock de 20 mg / ml.
   2. Filtrar la solución OSM y alícuota en eppendorfs estéril, almacenar a -20 ° C.
6. Recubrimiento de la cultura recipientes de plástico con Matrigel
   1. Descongele la botella de 10 ml de valores de Matrigel la noche a 4 ° C en hielo y luego agregar 10 ml de DMEM-KO. Mezclar bien con pipetas refrigerados y guardar unml alícuotas a -20 ° C.
   2. Descongelar una alícuota de Matrigel a 4 ° C durante al menos 2 horas o durante la noche para evitar la formación de un gel.
   3. Añadir 5 ml de DMEM frío KO-a la matrigel, mezclar bien con una pipeta.
   4. Completar hasta 15 ml con DMEM frío KO-y mezclar con una pipeta.
   5. Añadir matrigel a la plancha o recipiente que va a revestirse (Tabla (i))

Plate / frasco	Volumen / Bueno o frasco
12 y placa	0,5 ml por pozo
6-y las placas	1 mL por pozo
25 cm 2 frasco	2 ml por frasco

Tabla 1. Volúmenes recomendados de matrigel para recipientes de plástico de recubrimiento típico de la cultura células madre.

6. 6. Incubar la placa recubierta o frasco de la noche a 4 ° C o sala detempature durante 1 hora antes de su uso.
   7. Placas o frascos que hayan sido recubiertos con matrigel se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 semana. Estas deben estar claramente etiquetados con la fecha en que se cubrieron. Deseche todos los frascos o placas no se utiliza dentro de una semana.
      1. Antes de usar que el contenedor recubierto cultura para llegar a la temperatura ambiente dentro de una campana de cultivo de tejidos.
      2. Inmediatamente antes de usar aspirar el matrigel y añadir la suspensión celular a la fuente o el frasco.

2. El mantenimiento rutinario de las culturas células madre y la caracterización

1. Reanimación de líneas de células madre
   1. Quitar hESCs de almacenamiento de nitrógeno líquido y descongelación rápida en un baño de agua a 37 ° C.
   2. Transferencia de la suspensión celular con cuidado a un tubo estéril con algunos mililitros de medio caliente.
   3. Que sedimenten las células por centrifugación @ baja velocidad durante 5 minutos (1000 RPM).
   4. Aspirado de la resucitación sobrenadante y muy suavementepend las células en un medio cálido y ES placa sobre una capa de alimentación MEF.
   5. Células realimentación diario con el medio ES fresco y en la sub, las células, las células requieren pases.
2. Mantenimiento de rutina de células madre
   Células madre embrionarias son cultivadas en placas o frascos revestidos con matrigel. Las células deben ser examinados y se alimenta a diario:
   1. Examinar con el microscopio de la morfología celular de contaminación, y la confluencia.
   2. Aspirar el medio empleado.
   3. Añadir un volumen adecuado de ratón fresco embrionarias de fibroblastos medio condicionado (MEF-CM) + humanos bFGF (concentración final de 4 ng / mL) o de otros medios de comunicación libres de suero ^6.
3. Las células de pases con colagenasa
   líneas de células madre (H1, H9 y RCM-1) llegará a la confluencia cada 5-7 días después de los pases en una relación de división de 1:3. HESCs primeros paso en la presencia de estroma crecen más lentamente y el tiempo en el matrigel puede convertirse en un factor importante. CES humanos no se debe dejar más de 14días en el matrigel mismo debido a la degradación de la matriz y en este caso puede ser necesario para el paso de las células en una relación de división 1:1 o 1:2 si las células son subconfluentes.
   
   Enzima de incubación
   1. Todas las medidas que se llevarán a cabo en una campana de cultivo de tejidos en condiciones asépticas.
   2. Asegúrese de que haya un nuevo plato matrigel recubiertos o frasco de preparado de acuerdo con la sección 1.6.
   3. Decidir sobre la relación de división que desee para las células. Una serie de factores están involucrados en la decisión de la relación de división:
      1. Alto nivel de estroma con un bajo número de colonias: puede pasarse de nuevo a un tamaño más pequeño pozo o puede pasarse 01:01 que deshacerse de algunos estroma y aumentar así la colonia relación estroma, la promoción del crecimiento células madre.
      2. Alto nivel de estroma con grandes colonias, dependiendo del número de colonias, puede pasarse 1:1 o 1:2 si hay colonias de células madre lo suficientemente grande.
      3. Típica hESCs en crecimiento con un poco de stroma o estroma no y / o la diferenciación de algunos pasajes puede ser 1:2 o 3.
      4. Aspirar los medios de comunicación desde el pozo o el frasco.
      5. Lavar una vez con 2 ml de PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
      6. Añadir un volumen apropiado de la colagenasa (200 U / mL diluidos en DMEM-KO) y se incuba a 37 ° C durante 2-5 min. De 2 minutos en adelante examinar regularmente bajo el microscopio (intervalos de 1 minuto). En el punto de las células diferenciadas empiezan a despegar y las colonias comienzan a levantar en el borde de las células están listos para ser pasados.
   Raspado y agrupamiento de los hESCs
   3. 6. Aspirar la colagenasa.
      7. Lavar una vez con 2 ml de PBS (-MgCl _{2,-CaCl 2).}
      8. Añadir un volumen adecuado de MEF-CM en función de la relación de división, y el uso de un rascador de células eliminar físicamente las células de la superficie del pozo o recipiente, y luego triturar generaciónTLY pipeteando arriba y abajo 2-3 veces con una pipeta de 10 ml. Es importante que las hESCs se mantienen en grupos de células y no se dividen en células individuales.
   Replating la hESCs
   3. 9. Replate la suspensión celular que resulta en el nuevo frascos matrigel recubiertos o pozos.
      10. Hacer que el volumen de MEF-CM de hasta 4 ml para un pozo de una placa de 6 pocillos.
      11. Al colocar las células en la incubadora de agitar el recipiente de cultivo de tejidos para asegurar lo más uniforme posible, una distribución de las colonias como las colonias tienden a asentarse en el centro de la placa de cultivo de tejidos / botella que afectan replating y diferenciación celular.
4. Caracterización de las poblaciones de células madre de rutina por citometría de flujo
   1. las poblaciones de células madre son examinadas a través de la citometría de flujo una vez al mes para marcadores de células madre como las 3 de octubre / 4, 1-60 y SSEA Tra-4.
   2. células madrelas poblaciones son removidos de su sustrato en forma de suspensiones de células individuales siguiendo un tratamiento de 5 minutos con tripsina / EDTA (Invitrogen).
   3. Resuspender las células individuales de 1x10 ⁶ células / ml en PBS suplementado con BSA 0,1% y 0,1% de azida de sodio.
   4. Incubar las preparaciones de células a 4 ° C con los anticuerpos durante 40 minutos.
   5. Lavar las células dos veces con PBS suplementado con BSA 0,1% y 0,1% de azida de sodio para eliminar el anticuerpo no unido y volver a suspender a un volumen final de 100 L y analizar por citometría de flujo.
   6. Los datos de 30.000-40.000 "en vivo" se adquieren para cada muestra con un citómetro FACS Caliber equipado con un láser de 488 nm y se analizaron utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA). Células sin teñir se incluyen como controles. Las células muertas y apoptosis junto con los desechos fueron excluidos del análisis con una puerta electrónica en vivo en los parámetros de dispersión frontal y lateral de dispersión.

3. Diferenciarción de hESCs a endodermo hepática

1. Preparación de los medios de comunicación para la diferenciación de hESCs a endodermo hepática. Toda la preparación de medios debe llevarse a cabo en una campana de cultivo de tejidos en condiciones asépticas.
   1. Preparación de RPMI: B27 medio de cebado para la diferenciación del endodermo
      1. De RPMI-B27 mediano, mezcle RPMI 1640 (500 ml) y B27 (50 veces, 10 ml)
      2. Agitar para mezclar los componentes.
      3. Agregar todos los componentes de una unidad de filtro y filtrar en vacío, se almacenan a 4 ° C.
   2. Preparación de la SR-DMSO medio para la diferenciación de hepatocitos
      1. Para SR-DMSO mediano, mezcle el 80% KO-DMEM, 20% KO-SR, 0,5% L-glutamina, un 1% no aminoácidos esenciales, 0,1 mM β-mercaptoetanol y DMSO al 1%.
      2. Filtrar la solución al vacio, se almacenan a 4 ° C y la alícuota y almacenar a -20 ° C si es necesario.
      3. Use 4 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos, y 6 ml por frasco T25.
   3. Preparación del medio de maduración L15 de hepamaduración tocyte
      1. Por medio L-15, mezcla de 500 ml Leibovitz medio L-15, triptosa fosfato de caldo (concentración final 8,3%), inactivado por calor suero fetal bovino (concentración final 8,3%), hidrocortisona 10 M 21-hemisuccinato, 1 mM de insulina (páncreas bovino ), 1% de L-glutamina, un 0,2% de ácido ascórbico.
      2. Filtrar la solución al vacio, se almacenan a 4 ° C y la alícuota y almacenar a -20 ° C si es necesario.
   4. Preparación de la final de RPMI: B27 medio de cebado
      1. Dispense el volumen requerido de medio de cebado para el experimento (1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos, y 2 ml por frasco T25).
      2. Añadir activina A a una concentración final de 100 ng / mL.
      3. Añadir Wnt3a recombinante a una concentración final de 50 ng / mL.
      4. Mezclar bien y los medios de comunicación ya está listo para su uso.
      5. Este medio final debe estar compuesta de nuevo cada día.
   5. Preparación del medio de maduración final L-15
      1. Prescindir de la necesariavolumen de medio L-15 para el experimento (4 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos, y 6 ml por frasco T25).
      2. Añadir HGF a una concentración final de 10 ng / mL.
      3. Añade OSM a una concentración final de 20 ng / mL.
      4. Mezclar bien y los medios de comunicación ya está listo para su uso.
      5. Este medio final debe estar compuesta de nuevo cada día.
2. HESCs Preparación para el endodermo definitivo
   1. Cultura hESCs (H1, H9 y RCM-1) y se propagan en matrigel placas recubiertas con fibroblastos embrionarios de ratón MEF-CM complementado con bFGF.
   2. Iniciar la diferenciación hepática cuando hESCs alcanzar un nivel de confluencia de aproximadamente el 30% -60% (dependiendo de la línea de células madre) mediante la sustitución de la MEF-CM con el medio de cebado (RPMI 1640-B27 suplementado con 100 ng / mL activina A y 50 ng / mL Wnt3a.
   3. Las células se cultivan en un medio de cebado durante 3 días (cambiando el medio cada 24 horas), y el medio de cebado final con la activina A y Wnt3a se compone de nuevo cada día.
   4. En el día 8 cultivar las células en medio de maduración y mantenimiento (L-15) complementado con 10 ng / mL y 20 hHGF OSM ng / mL durante 9 días (cambio de medio cada 48 horas). Medio de maduración y de mantenimiento con hHGF y OSM está compuesta de nuevo cada día.
   5. Las células gradualmente presentan cambios morfológicos de una forma puntiaguda / triangular a una morfología característica del hígado mostrando un aspecto poligonal (Figura 2A).
   6. Esquema de hepato-celular de diferenciación:

4. Caracterización de las células madre derivadas del endodermo hepática

1. Inmunotinción
   1. Lávese las células madre derivadas HLC con PBS dos veces, a 1 minuto de cada lavado.
   2. Fijar el HLC con PFA al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente, (la células se pueden almacenar en PBS a 4 ° C y se tiñeron en una fecha posterior). Las células también pueden ser fijadas con metanol helada por 10 minutos a -20 ° C.
   3. Lavar las células dos veces con PBS, 5 minutos cada lavado.
   4. Se incuban las células durante 2 minutos a temperatura ambiente con 100% de etanol para la tinción nuclear (este paso no es necesario si se utiliza la fijación de metanol).
   5. Lavar las células dos veces con PBS, 5 minutos cada lavado.
   6. Bloquear las células con PBS / T (0,1% entre) / 10% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente.
   7. Retire el amortiguador de bloqueo y añadir el anticuerpo primario correspondiente diluido en PBS / T (0,1% entre) / 1% de BSA y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente, o de la noche a 4 ° C con agitación.
   8. Lavar las células 3 veces con PBS / T (0,1% entre) / 1% BSA a temperatura ambiente, a 5 minutos cada lavado.
   9. Añadir la secundaria apropiada Alexa Fluor anticuerpos (1:400) diluido en PBS a las células y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad con agitación. Lavar las células 3 veces con PBS, 5 minutos cada lavado.
   10. Monte cada bien con Mowiol 4-88 y DAPI (1:1000). Tapar el pozo con una hoja de cubierta, al presionar el cubreobjetos con cuidado para garantizar que todas las burbujas de aire y se almacena a 4 ° C en la oscuridad.
2. ARN del aislamiento y extracción de
   1. Lave el HLC células madre derivadas con PBS y se aspira.
   2. Añadir 1 ml de reactivo de TRIZOL e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   3. Raspar las células y el lugar en un eppendorf de 1,5 mL (almacenar a -80 ° C para su uso posterior si es necesario).
   4. Añadir 0,5 ml de cloroformo a la eppendorf y mezclar invirtiendo, asegúrese de que esto se hace en una campana extractora.
   5. Centrifugar la solución a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C.
   6. La fase acuosa y el lugar en un eppendorf limpio, asegúrese de que no hay contaminación de la interfaz.
   7. Añadir 1 ml de isopropanol y mezclar invirtiendo, dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos para precipitacióntar la ARN.
   8. Se centrifuga a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C.
   9. Aspirar el sobrenadante y asegurarse de no perturbar el precipitado de ARN. Lavar con 0,5 ml de etanol al 70% y dejar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   10. Centrifugar a 8000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C.
   11. Aspirar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
   12. Una vez que todo el etanol se ha evaporado, resuspender el precipitado en 30 l de agua desionizada. Guarde el ARN a -80 ° C para su uso posterior.
   13. Cuantificar la concentración de ARN utilizando un nanodrop.
3. PCR con transcripción inversa
   1. Establecer una reacción utilizando previamente aisladas de ARN (200 ng), hexámeros al azar, los nucleótidos (10 mM) de la transcriptasa inversa y la memoria correspondiente en una pared delgada ml eppendorf 0,5.
   2. Establecer un negativo RT, la reacción anterior, sin la transcriptasa inversa.
   3. Coloque los tubos en un termociclador termo, máquina de PCR, y establecer el siguiente programa:
      1. 37 ° C - 5 minutos (1 ciclo)
      2. 42 ° C - 1 hora (1 ciclo)
      3. 95 ° C - 5 minutos (1 ciclo)
   4. Guarde el cDNA a -20 ° C para su uso posterior si es necesario.
4. TAQMAN transcriptasa inversa cuantitativa reacción en cadena de polimerasa de cosecha de las células en diferentes momentos a lo largo de los protocolos de diferenciación. Extraer el ARN y llevar a cabo qPCR transcripción inversa utilizando los siguientes primers y Ensayo sobre la demanda, (Applied Biosystems) protocolo:
   1. 04 de octubre Hs03005111_g1
   2. Nanog Hs02387400_g1
   3. Albúmina Hs00910225_m1
   4. La alfa-fetoproteína Hs00173490_m1

Para el aislamiento de ARN y, por favor referirse a la extracción de la sección 3.3.2

1. La transcripción inversa y PCR cuantitativa TAQMAN
   1. Tomar 1 g de ARN y la transcripción inversa a cDNA utilizando Superíndice Invitrogen transcripción inversa IIIkit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   2. 1 l de la cDNA utilizado en una reacción de 25 l TAQMAN que consta de las imprimaciones adecuadas de Applied Biosystems, primers 18S ribosomal de control y de Invitrogen 2x platino qPCR Supermix UDG con rox y un volumen adecuado de agua.
   3. Mezclar bien y colocar 10 l de cada muestra en dos pozos ya sea de un 96 ó 384 placa qPCR bien.
   4. Una vez que todas las muestras se cargan, además de los controles adecuados), el sello de la placa y analizar en la máquina Aplicada Biosystems 7900HT TAQMAN.
   5. Los resultados se expresan como la expresión relativa a una muestra de control.

5. Análisis funcional de células madre derivadas endodermo hepática del citocromo P450 Ensayos - http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
   1. 17 días incubar células madre que derivó con el sustrato específico durante 5 horas a 37 ° C (n = 3). Uso de los medios de cultivo de tejidos comocontrol negativo e incubar a 37 ° C durante 5 horas.
   2. Recoger el sobrenadante y llevar a cabo el ensayo según las instrucciones del fabricante.
   3. Medir los niveles relativos de la actividad basal y normalizar a mg de proteína por lo determinado por el ensayo de BCA (http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101).

Notas

1. Todos los volúmenes están basados ​​en un formato de placa de 6 pocillos. Ajustar los volúmenes de acuerdo a la placa requerida o frasco.
2. Todos los medio de cebado, la diferenciación y la maduración se filtra al vacío antes de su uso.
3. Medio de cebado, la diferenciación y la maduración se almacena a 4 º C durante no más de 2 semanas. Evaluar hasta qué punto medio es necesario para el experimento y la alícuota de los medios restantes y almacenar a -20 ° C para su uso futuro.
4. Matrigel se compone según las instrucciones del fabricante; alícuotas de 1 ml se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso.
5. Grofactores wth una vez constituido y alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C y cuando se descongelan se pueden almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas.
6. El anticuerpo primario por lo general utilizado para caracterizar células madre derivadas HLC es la albúmina (1:250, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO).

5. Los resultados representativos:

Caracterización de hESCs mantiene antes de la diferenciación hepática

Con el fin de caracterizar el estado de células madre de la H9 hESCs utilizados en el estudio se estudiaron una serie de parámetros. Las células tuvieron una morfología de células madre, células pequeñas, apretadas cada vez mayor en las colonias definidas (Figura 1A) y expresó la madre pluripotentes marcadores de genes de células, Oct-3 / 4 y Nanog (fig. 1B). No se encontró diferencias significativas en la expresión de estos genes en comparación con un control de línea de células madre H7 positivos. Además, el 90,1% de la población hESCs fue positiva para el marcador de células madre SSEA-4 (fig. 1C).

hESC diferenciación endodermo hepática

Las células madre embrionarias pueden diferenciarse de manera eficiente a endodermo hepático in vitro (Hay et al 2008). A los 9 días de diferenciación, las células fueron cosechadas y la diferenciación de células madre de HLC se evaluó. Como se informó anteriormente la hESCs exhibió una serie de profundos cambios morfológicos, y por el día 9, tuvieron una morfología de principios de los hepatocitos el desarrollo de un aspecto poligonal (Figura 2A). Por otra parte, la regulación negativa de octubre-3 / 4 en el transcurso de 9 días de tiempo se observó (Figura 2B). En contraste, el hígado transcripciones de AFP y la albúmina fueron hasta reguladas (Figura 2 C) desde el día 7 en adelante.

Maduración in vitro de endodermo hepática

Endodermo hepática fue madurado in vitro mediante el procedimiento establecido (Hay et al 2008). En el último día de las culturas de diferenciación se realizó la inmunotinción para marcadores de hígado humano AFP albúmina, y E-cadherina. El rendimiento de HLC con nuestros procedimiento suele ser del 90% (Hay et al 2008; Hanoun et al 2010; Payne et al 2011). HLC manchadas positivos para albúmina, alfa-fetoproteína y E-cadherina (figura 3).

Figura 1. Caracterización de hESCs utilizados en este estudio. (A) la microscopía de contraste de fase imágenes representativas de la morfología de células madre observada en la cultura con un aumento de 4x y 10x. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Nikon TE3000 / U microscopio invertido (B) hESCs cultivadas son Octamer (Oct-3 / 4) positivas y Nanog. H7 hESCs se utiliza como control de la pluripotencia niveles de expresión génica. Expresión relativa se refiere a los pliegues de la inducción en comparación con el control de los genes endógenos, β-2-microglobulina. (C) representa FACS muestran células madre superficie de los niveles de expresión de los marcadores, incluyendo la etapa embrionaria de antígenos específicos SSEA 4.

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Figura 2. (A) Fase de imágenes de microscopía de contraste representativa de células madre derivadas de la morfología hepática endodermo en el día 9 de la diferenciación observada en la cultura, a x4 y x10 aumentos. (B) Caracterización de los cambios en la expresión génica. Se extrajo el ARN y el cDNA se analizó mediante la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa, mostrando regulación a la baja progresiva de la expresión génica de células indiferenciadas (Oct-3 / 4) y (C) Regulación al alza de la expresión génica del hepatocito (albúmina y α-fetoproteína). Expresión relativa se refiere a los pliegues de la inducción en comparación con el control de los genes endógenos, β-2-microglobulina en el día 0 de diferenciación. P <0,05 se denota * y P <0,001 se denota *** medida por los estudiantes t-test en comparación con hESCs en el día 0. Las barras de error representan una desviación estándar.

Figura 3. Characterisation de células madre derivadas del endodermo hepática
Inmunocitoquímica muestra la expresión de marcadores de hepatocitos, AFP albúmina, y E-cadherina en células madre (H9) endodermo hepática derivada. Controles negativos se realizaron con la inmunoglobulina correspondiente G (IgG) y los representantes de las imágenes se muestran.

Figura 4. Células madre (H9) HLC derivados presentan una actividad metabólica. En el día 17, H9 diferenciado HLC mostraron actividad CYP3A metabólico (n = 6).

Discussion

Hemos desarrollado un modelo simple, homogéneo y altamente reproducible in vitro para generar niveles escalables de HLC humanos. Nuestro modelo ha sido validado por una serie de laboratorios colaboradores externos. Nosotros habitualmente caracterizan a las células madre derivadas HLC con nuestra caja de herramientas en la casa de las pautas del desarrollo y el hígado específicas ensayos funcionales (la mayoría de los cuales están disponibles en el mercado). Las etapas críticas en nuestro proceso son: el mantenimiento de la pluripotencia de células madre, la capacidad de dirigir la diferenciación de células madre para el endodermo definitivo, la especificación de las culturas homogéneas de endodermo hepática y la capacidad de derivar endodermo hepática maduros exhiben función amplia gama in vitro.

Una de las limitaciones para el despliegue a gran escala de las células madre derivadas HLC tecnología ha sido la función a corto plazo diferenciado de endodermo hepática madura en la cultura (~ 4 días en matrigel). Como tal, hemos analizado un polímerobiblioteca para celular compatible con bio-activa y la novela. Esto ha llevado a la identificación de una novela que mantiene el apoyo de la función hepática por lo menos 15 días. Las direcciones futuras de esta tecnología son inicialmente de aplicación industrial en el proceso de descubrimiento de fármacos (Hay et al 2011). Mediados de ganancias a corto plazo la forma de esta tecnología es probable que sean humanizados extra-corporal dispositivos son compatibles con el hígado para salvar o tratar a los pacientes con enfermedad hepática. Ganancias a largo plazo de esta tecnología podría en la terapia de trasplante de células basa para la enfermedad hepática, sin embargo los datos actuales demuestran que esta estrategia requiere un esfuerzo significativo para que pueda ser utilizado con seguridad en la clínica (Payne et al 2011).

En conclusión, la importancia de nuestra tecnología in vitro es la capacidad de generar culturas homogéneas y sin límites de la alta fidelidad HLC humanos de la biología aplicada.

Materials

Matrigel coating plates and flasks Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK) Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK) hESC Maintenance Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Passaging hESCs with collagenase Confluent well or flask of hESCs. Matrigel coated wells or flasks as appropriate. Phospate buffered saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA). Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA). Differentiation of hESCs to hepatic endoderm RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. β-Mercapt–thanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C. F–tal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK) Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm Immunostaining Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK). Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature. Ethanol Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK). MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution. Primary antibodies Antigen* Type Supplier Dilution ALB Mouse Monoclonal Sigma Aldrich 1/500 E-Cadherin Mouse Monoclonal Millipore 1/100 α-fetoprotein Mouse Monoclonal Sigma 1/500 SSEA-4 FITC Mouse Monoclonal Biolegend 1/100 IgG Mouse Monoclonal DAKO 1/500 Secondary antibodies Anti-mouse FITC conjugate Goat Monoclonal Invitrogen 1/400 Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from. Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein) Cytochrome P450 Assays p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA). White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK). BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)