שבבי microfluidic מבוקרת עם מערכים Microvalve אלסטומרי

Summary

אנו מדגימים פרוטוקולים לייצור מיכון אלסטומרי polydimethylsiloxane (PDMS) מבוססי מערכים microvalve כי אין צורך אנרגיה נוספת כדי לסגור תכונה כרכים מדויק מוגדר photolithographically. מיקסר במקביל subnanoliter נפח ומערכת משולבת זלוף microfluidic מוצגים.

Abstract

מערכות microfluidic מיניאטורי לספק פתרונות פשוטים ויעילים עבור עלות נמוכה נקודה של טיפול אבחון תפוקה גבוהה מבחני ביו. בקרת זרימה יציבה ואמצעי אחסון fluidic מדויק שתי דרישות קריטיות עבור יישומים אלה. פיתחנו שבבי microfluidic שמציעות אלסטומרי polydimethylsiloxane (PDMS) מערכים microvalve כי: 1) אין צורך במקור אנרגיה נוספת כדי לסגור את נתיב fluidic, ומכאן את המכשיר טעון הוא נייד מאוד, ו 2) לאפשר microfabricating עמוק (עד 1 מ"מ) ערוצים עם הצדדיים אנכי וכתוצאה מכך תכונות מאוד מדויק.

Microvalves מכשירים מבוססי PDMS מורכב משלוש שכבות: שכבה המכילה fluidic נתיבים fluidic ו microchambers בגדלים שונים, שכבה מלאה המכילה את microchannels צורך להפעיל את נתיב fluidic עם microvalves, וכן קרום דק באמצע PDMS כי הוא חייב לשלוט השכבה. שכבת Fluidic שכבות לשלוט מבוצעים על ידי דפוס העתק של PDMS מ SU-8 אדונים photoresist, ואת קרום דק PDMS נעשית על ידי ספינינג PDMS בגבהים שצוינו. שכבת השליטה הוא קשור קרום דק PDMS לאחר הפעלת חמצן של שניהם, אז התאספו עם שכבת fluidic. Microvalves סגורים במנוחה ניתן לפתוח על ידי הפעלת לחץ שלילי (למשל, אבק בית). סגירת ופתיחת Microvalve הם אוטומטיים דרך שסתומים סולנואיד נשלט על ידי תוכנת מחשב.

כאן, אנו ממחיש שני microvalve מבוססי שבבי microfluidic עבור שני יישומים שונים. השבב הראשון מאפשר לאחסון ערבוב מדויק משנה nanoliter כרכים של תמיסות מימיות על יחסי ערבוב שונים. השבב מאפשר second זלוף מבוקרת מחשב של תרביות תאים microfluidic.

המכשירים קל לפברק ופשוטה לשליטה. בשל biocompatibility של PDMS, שבבים אלה יכול להיות יישומים רחב מבחני אבחון מיניאטורי, כמו גם מחקרים בסיסיים בביולוגיה התא.

Protocol

למכשיר עיצוב Microfluidic CorelDraw או באמצעות תוכנת AutoCAD

עקרון PDMS microvalves מכשירים מבוססי: מכשירים מורכבים משלוש שכבות: שכבה המכילה fluidic microchambers בגדלים שונים, מעין "שכבת שליטה" המכיל את microchannels צורך להפעיל את נתיב fluidic עם microvalves, וכן קרום דק באמצע PDMS כי הוא מחויב את שכבת שליטה. במנוחה, עקב התאימות ואת hydrophobicity של PDMS, את החותמות קרום (הפיך) כנגד המושב שלו, ולפיכך לתאי להישאר מבודדים אחד מהשני ללא השקעת אנרגיה. שסתומים ניתן לפתוח על ידי הפעלת לחץ שלילי (למשל, אבק הבית), כך הממברנה PDMS מסיט את ומפריד מפני השטח שתומך הקיר בין שני חדרי fluidic, ובכך לחבר את נתיב fluidic. סגירת Valve יכולה להיות מושגת על ידי החלפת ההגדרה הלחץ ואקום בלחץ אטמוספרי.

שכבת Fluidic שכבת דפוסי השליטה נועדו CorelDraw או באמצעות תוכנת AutoCAD. מסכות המכיל עיצובים אלה הודפסו ברזולוציה גבוהה (8,000 עד 20,000 dpi) על סרטים שקיפות באמצעות שירותים מסחריים (CAD / אמנות שירותים, Bandon, OR) (מסכות לא מוצג).

המצאה של אדונים סיליקון באמצעות photolithography סטנדרטי SU-8

1. תקן SU-8 שיטות photolithography שימשו כדי ליצור SU-8 "אדונים" (SU-8 2050, MicroChem, ניוטון, MA) עבור שכבת microfluidic והשליטה שסתום שכבה cleanroom (לא רואים בסרט הזה).
   
   
2. כדי להקל על שחרורו, לפני שכפול PDMS SU-8, אדונים היו silanized ידי חשיפה לאדים של fluorosilane ((tridecafluoro-1, 1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (TFOCS)), תוך צנצנת ייבוש (ללא ייבוש כדורי) המחובר למקור ואקום. החדר ייבוש חייב להיות ממוקם בתוך מכסה המנוע עקב עשן כימי אופי מאכל של אדים TFOCS.
   
   
3. המקום חלק קטן מגבת נייר סופג בתוך החדר ייבוש. הוסף ירידה של TFOCS אל מגבת נייר ולפנות את האוויר מן החדר. החל ואקום 1 דקות ומכבים. סגירת ואקום לאפשר 30 דקות להפקדה. שמור את המאסטרים במיכלים סגורים לשימוש עתידי.

Replica דפוס של PDMS מן המאסטרים

1. השכבה fluidic ואת השכבה מלאה מיוצרים על ידי דפוס העתק של PDMS מ SU-8 אדונים.
   
   
2. PDMS ערבוב ביסודיות מראש פולימר צולבות מקשר (10:01 wt. Ratio), דה בועה ייבוש למשך 10-15 דקות עד בועות ברור.
   
   
3. חותכים צינורות סיליקון לתוך 1-2 חתיכות ס"מ. בחרו את הגודל המתאים של צינורות לפי בקשה. אנו משתמשים tubings 1.14 מ"מ מזהה כאן חיבור קל צינורות OD 1 / 16 אינץ מאוחר יותר.
   
   
4. השתמש מלט דוקו ® כדי צינורות דבק על האזורים מפרצון של המאסטר SU-8 של שכבת שליטה. היזהר שלא להשתמש בדבק יותר מדי, כמו צינורות סיליקון עשוי מרכיבים כמו PDMS, ואת צינורות יהיה מוטבע לתוך המכשיר PDMS microfluidic, יצירת האוויר פתחי הכניסה הדוק fluidic / שקעים.
   
   
5. במכשיר שלנו, אזורים כניסת נועדו על המסכות של fluidic והן שכבות שליטה, אבל צינורות פתחי הכניסה סיליקון הם רק יצוק לתוך שכבה אחת (לדוגמה, שכבת שליטה) של המכשיר. כדי ליצור פתחי הכניסה לשכבה fluidic, אנו להסיר באופן ידני או לנקב את סעיפים אחדים של קרום זה מכסה את האזורים מפרצון. לכן, לאחר יישור והרכבה, כל microchannels (אלה שנושאים לזרום כמו גם אלה השולטים שסתומים) נגישים מהחלק העליון של המכשיר, כך את פני השטח התחתונה היא מישוריים, המאפשר הדמיה של המכשיר על הבמה מיקרוסקופ רגיל.
   
   
6. יוצקים בזהירות דה מבעבע PDMS על שני אדונים, סביב צינור יחידת שליטה ב-השכבה. De-הבועה שוב ייבוש. אחרי דה מבעבע תושלם, להכניס לתנור 65 ° C למשך שעה 1> בריפוי.
   
   
7. הסר נרפא PDMS מכוסה אדונים מהתנור.
   
   
8. גזור מכשירים בודדים המאסטרים (אב אחד מכיל שלושה מכשירים זהים) לסירוגין לקלף.
   
   
9. הסרת דבק מאזורי מפרצון באמצעות מחט או זוג מלקחיים.
   
   
10. קח את השליטה שכבת PDMS לתוך חדר נקי.

ייצור רזה PDMS ממברנה

1. כפי עקרונית את המכשיר, את השכבה האמצעית מורכבת קרום PDMS ~ 12 מיקרומטר עבה.
   
   
2. מערבבים 10:01 wt. יחס של PDMS prepolymer / תערובת סוכן ריפוי עם הקסאן (03:01 wt. היחס) על ידי vortexing.
   
   
3. מעבר לחדר נקי. (סביבה ללא אבק הוא קריטי על מנת להבטיח כי ממברנות PDMS נקייה מפגמים; חלקיקי אבק עלול לגרום ממברנות המכיל חורים ו / או פגום מחויב לעצב את העתק).
   
   
4. שים silanized 3 אינץ בקוטר רקיק עללזרוק את הוואקום של הצנטריפוגה Solitec. רקיק צריך להיות silanized (derivatized עם fluorosilane) לפני PDMS ספינינג כדי להקל על שחרורו של PDMS ממשטחי הסיליקון. קערת טפלון מחוץ צ'אק היה עטוף בסרט פלסטיק לניקוי קל.
   
   
5. לוותר על 2-3 מ"ל של תערובת PDMS / הקסאן על גבי פרוסות סיליקון באמצעות מחט מזרק 18-מד (למזעור בועות).
   
   
6. הגדרת פרמטרים ספין. ספין בסל"ד 7000 למשך 30 שניות, והתוצאה היא סרט PDMS בעובי 12 מיקרומטר ~.
   
   
7. מחממים את פרוסות סיליקון ב 85 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות על פלטה חשמלית כדי לרפא את הסרט PDMS.

מליטה Multilayer PDMS מכשיר והרכבה

1. שים את השכבה מלאה של קרום PDMS לתוך תא פלזמה חמצן. הפעל פלזמה במשך 30 שניות (30 psi לחץ חמצן, קצב הזרימה 3-5 SCFH, 550W). תביאו את השכבה לשלוט במגע עם קרום PDMS מיד (תוך 5 דקות) לאחר הפעלת חמצן. הפרמטרים של המערכת, כגון לחץ חמצן, קצב הזרימה, כוח פלזמה זמן הטיפול, מוגדרים באופן אמפירי לפי יישומים שונים.
   
   
2. המתן 5 דקות, ולהסיר את השכבה מלאה של פרוסות סיליקון יחד עם הממברנה.
   
   
3. הסר ממברנות על שטחי פתחי הכניסה כך ששני מלאה שכבות fluidic נגישים מלמעלה באמצעות צינורות.
   
   
4. יישר את השכבה מלאה (עם tubings כמו פתחי הכניסה) עם שכבת fluidic (מישורי) תחת stereoscope. מכיוון PDMS חותמות על PDMS, מליטה לא קבע נדרשת.

המחשב שבשליטת פתיחה וסגירה של microvalves PDMS ידי ואקום או לחץ

1. לאחר יישור מכשיר והרכבה, להוסיף 1 / 16 אינץ OD (1 / 32 מזהה אינץ') צינורות Tygon לתוך פתחי הכניסה מזהה 1.14 מ"מ סיליקון ולחבר את פתחי הכניסה למקורות הלחץ או מאגרי fluidic.
   
   
2. עבור פתיחת וסגירת השסתומים, לחצים נשלטים על ידי קו ואקום קו לחץ האוויר מחובר דרך שני הרגולטורים לחץ מערך של שלוש דרך שסתומים מיניאטוריים סולנואיד.
   
   
3. שסתומים סולנואיד מחוברים חומרה הלאומי נתונים רכישת מכשירים נשלט באמצעות תוכנת LabVIEW.
   
   
4. מבצע ההתקנים סטיה הממברנה הם דמיינו עם צבע מצלמת CCD (SPOT RT, כלי אבחון, סטרלינג הייטס, MI).

במקביל ערבוב של שני צבעים צבע שונה שונה כרכים nanoliter מוגדר

אנו מדגימים את פעולת המיקסר מקביל המאפשר אחסון ערבוב מדויק משנה nanoliter כרכים של תמיסות מימיות על יחסי ערבוב שונים:

1. שכבת fluidic מכיל שני מערכים של microchambers: לאורך מערך, גודל microchambers פוחתת, החל השמאלי, מתוך 200 מיקרומטר x 400 מיקרומטר עד 200 מיקרומטר x 40 מיקרומטר; ₁₀ הוא 500 x 40 מיקרומטר קאמרית מיקרומטר והוא השתמשו רק עבור החיבור fluidic במערך; בצד ימין של תא ₁₀ היא קבוצה של תאים סימטרי הגדלת בגדלים. בתאי B של מערך נועדו כזה נפח נוסף של כל שני חדרים סמוכים בשורות שונות שווה תמיד. _{0, 10r 0r 10} ו-B, B נועדו כפקדי בהתאמה פתרונות A ו-B ללא ערבוב.
   
   
2. השכבה מלאה יש שתי עצמאי שבשליטת סטים של שסתומים. סט של ברזים V _{1} משמש לחיבור שני מערכים קאמרית עם פתחי הכניסה שלהם, ואילו קבוצה שנייה של שסתומים _{2} V משמש לחיבור כל זוג חדרים בשני מערכים.
   
   
3. מלאו את microchambers ידי פתיחת שסתום להגדיר V _{1} כדי לאפשר זרימה של שני פתרונות כדי לצבוע מערכים A ו-B, בהתאמה. זרימה של פתרונות ניתן להשיג גם על ידי היד או על ידי משיכת ואקום מבוקר עם שסתומי סולנואיד. אם בועות אוויר הטופס microchambers, הפתרון יכול להיות יותר דחף להוציא את בועות, או את המכשיר אפשר להשאיר למשך דקות ספורות ובועות ייעלמו בשל חדירות האוויר של PDMS.
   
   
4. סגור את שסתום להגדיר V _{1} לבודד כל תא במערכים שניהם.
   
   
5. שסתום להגדיר פתח V _{2} כדי לאפשר נוזל ערבוב בין החדרים הסמוכים מערכים שונים. ערבוב לוקח רק ~ 1-2 דקות כדי להשלים את הכרכים האלה.
   
   
6. סגור V _{2} כדי לדחוף את הנוזלים חזרה אל החדר כל fluidic ותאי לעוות חזרה לצורה המקורית שלהם. מאז שני מערכים fluidic נועדו עם לשכות 11 בגדלים שונים, 11 יחסי ערבוב שונים מיוצרים בשלב ערבוב אחד.

מערכת microfluidic משולב זלוף מבוקרת מחשב של תרביות תאים microfluidic

אנו מדגימים מערכת microfluidic כי הוא מסוגל זלוף האוטומטי של פתרונות מרובים תא תא בודד תרבות.פתחי הכניסה נשלטים על ידי microvalves, אשר יכול להיות מופעל בכל רצף של פתחי הכניסה יחידה, שילובים שונים, או בבת אחת. המכשיר מסוגל לייצר הדרגתיים או תערובות של פתרונות שונים.

גם מכשיר זה מורכב משלוש שכבות: שכבת fluidic, שכבת שליטה, קרום דק באמצע PDMS.

ייצור שלבים חלופיים עבור התקן זה:

1. כניסה ויציאות של ערוצי fluidic ערוצי שליטה הם "אגרוף" באמצעות 1.2 מ"מ בקוטר האריס Micro-Punch (טד פלה, Inc). Tubing מחובר פתחי הכניסה באמצעות הקהה 18 מחטים מד אשר מוכנסים אל PDMS דרך שכבת שליטה. זה מאפשר אריזה צפופה של פתחי הכניסה מאשר צינורות הסיליקון. הציות של PDMS מספק חותמת הדוק סביב המחטים ביעילות לספק נוזלים או לחץ פנאומטי.
   
   
2. כפי שתואר קודם לכן, מליטה של ​​קרום דק PDMS לשכבה השליטה מושגת באמצעות חשיפה פלזמה חמצן.
   
   
3. השכבה fluidic הוא הוכן על ידי דפוס עם העתק PDMS מראש פולימר צולבות מקשר ביחס של 5:01 ו חלקית ריפוי במשך 25 דקות ב 60 ° C בתנור הסעה. בשלב זה, את השכבה fluidic נרפא חלקית עדיין דביק, אך ניתן להסיר מן האדון.
   
   
4. השכבה fluidic מיושר באופן ידני כדי לשלוט מראש כינס את שכבות קרום באמצעות stereoscope. המכשיר התאספו מושם אז במשך 5 דקות על פלטה חמה ב 80 º C. בשלב הבא, לשלוט על קווי שסתום מחוברים בקר אוטומטיות השסתומים הם actuated עד הממברנה מתנתק מן השכבה fluidic בכלל המושבים שסתום על ידי יישום ואקום. אחרי "ניתוק" השסתומים, בקר את המחשב מוגדר מחזור השסתומים תוך המכשיר לרפא עוד לפחות שעה 1 על פלטה חשמלית ב 80 מעלות צלזיוס.
   

התכונות של מערכת משולבת microfluidic שלנו: המכשיר מסוגל זלוף אוטומטי של 16 פתרונות שונים לחדר תא התרבות באמצעות תוכנית valving multiplexed. העיצוב ערוץ מבטיחה עמידות של כל פתחי הכניסה היא מאוזנת. עיצוב microvalve שלנו מבודד פתרונות בקרות שטיפה בערוצים משולבת להסרת מהירה של נוזל, אשר מגביל צולבות זיהום. מיקסר אדרה משולב יכול להיות מופעל כדי לייצר תערובות של פתחי הכניסה שונה. בנוסף, ישנם ארבעה ערוצי התנגדות משתנה כי יכול להיות מופעל כדי לשנות את קצב הזרימה.

Discussion

היתרונות העיקריים של תכנון microvalve שלנו:

1. אין מקור אנרגיה נוסף נדרש כדי לסגור את נתיב fluidic, ומכאן את המכשיר טעון הוא נייד מאוד, ו
2. המכשיר יכול להיות בנוי על ידי העתקים מן PDMS photolithographically בדוגמת SU-8 תבניות, המאפשר microfabricating עמוק (עד 1 מ"מ) עם הערוצים הצדדיים אנכי (כלומר את גובה התכונות ניתן לציין בנפרד רוחב שלהם) וכתוצאה מכך מאוד תכונות מדויק.

היתרונות של מערבל מקבילים:

1. קל לפברק ופשוטה לשליטה.
2. כרכים מוגדרים photolithographically, ולכן, מאוד מדויק.
3. נוזלים ריאגנטים ניתן לאחסן microdevice במשך כמה ימים, המאפשר מבחני ניידים מאוד.
4. יש לציין, PDMS היא ביולוגית, ולכן המכשיר יש תחולה רחבה מבחני אבחון מיניאטורי, כמו גם בתא מבוססי מבחני כגון הקרנת סמים אנזים מבוססי זיהוי biomolecule.

יתרונות תא זלוף משולבת microfluidic:

1. הוא מסוגל זלוף האוטומטי של פתרונות כימיקלים מרובים תא תא בודד תרבות.
2. פתחי הכניסה נשלטים על ידי microvalves, אשר יכול להיות מופעל בכל רצף של פתחי הכניסה יחידה, שילובים שונים, או בבת אחת.
3. המכשיר מסוגל לייצר הדרגתיים או תערובות של פתרונות שונים.

ראשי מזהיר עבור תהליכי ייצור:

1. סביבה ללא אבק הוא קריטי במהלך ייצור קרום PDMS, אשר מבטיח כי הקרומים נקייה מפגמים.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Clean silicon wafers	Supplies	Silicon Sense Inc.	3P0110TEST	3-inch diameter, P/Boron
"Master" wafers containing SU-8 patterns	Supplies			Fabricated in house using standard photolithography procedures
Desiccators (2)	Equipment	VWR international	24987-048	One for silanization, one for PDMS de-bubbling.
Balance	Equipment	OHAUS Corp.	SC6010
Oven	Equipment	Sheldon Manufacturing, Inc.	1330GM
MiniVortexer	Equipment	VWR international	58816-121
Spinner	Equipment	Headway Research Inc.	PWM32
Plasma etcher	Equipment	Plasmatic Systems, Inc.	Plasma Preen II-973
Hot Plate	Equipment	Torre Pines Scientific	HP30A
Stereoscope	Microscope	Nikon Instruments	TMZ1500
CCD camera	Equipment	Diagnostic Instruments	SPOT RT
Solenoid valves	Equipment	Lee Company	LHDA0511111H
Data acquisition board	Hardware	National Instruments	PCI 6025E, CB-50LP
LabView	Software	National Instruments	Version 8.0
Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Reagent	United Chemical Technologies	T2492	Silanization must be done in a chemical fume hood.
PDMS prepolymer and crosslinker	Reagent	Dow Corning	Sylgard 184
Hexane	Reagent	EMD Millipore	HX0295-6
Color Dyes	Reagent	Spectrum Chemical Mfg. Corp.	FD&C 110, 135, 150	Blue #1, Yellow #5, Red #3.
3 ml disposable transfer pipets	Supplies	Fisher Scientific	13-711-20
Kimwipes	Supplies	Kimberly-Clark Corporation	34155
Weighing boats	Supplies	VWR international	12577-027
Tongue depressor	Supplies	Fisher Scientific	11-700-555
P100 dishes	Supplies	Fisher Scientific	08-772E
Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.))	Supplies	Cole-Parmer	07625-30
Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in)	Supplies	Cole-Parmer	06418-02
Duco Cement	Supplies	Devcon Inc.	6245
Razor blade	Tools	VWR international	55411-050
Needles	Tools	Fisher Scientific	0053482 (25 Gauge)
#5 Forceps	Tools	Fine Science Tools	11251-20
50 ml centrifuge tube	Supplies	Fisher Scientific	05-526B
Seal wrap film	Supplies	AEP Industries Inc.	0153877
1.5 ml microcentrifuge tubes	Supplies	Fisher Scientific	05-406-16
15 ml centrifuge tubes	Supplies	BD Biosciences	352097
Purple nitrile power-free gloves	Supplies	VWR international	40101-348
1.2 mm Harris biopsy punch	Tools	Ted Pella, Inc.	15074