Summary
우리는 탄성 polydimethylsiloxane (PDMS) 기반 photolithographically 정의 정확한 볼륨을 닫고 기능을 더 추가 에너지를 필요가 없다 microvalve 배열을 제조 및 자동화 프로토콜을 보여줍니다. 병렬 subnanoliter 볼륨 믹서와 통합 microfluidic 재관류 시스템을 소개하는 부분이있다.
Abstract
소형 microfluidic 시스템은 저렴한 포인트 - 오브 - 간호 진단 및 높은 처리량 생명 의학 assays를위한 간단하고 효과적인 솔루션을 제공합니다. 강력한 흐름 제어 및 정밀 유체 볼륨이 응용 프로그램의 두 가지 중요한 요구 사항입니다. 우리는 탄성 polydimethylsiloxane (PDMS) microvalve 배열을 갖춘 microfluidic 칩을 개발했다고 1) 유체 경로를 닫습니다 엑스트라 에너지원이 필요 없다, 따라서 로드된 장치는 고도의 이식이며, 2) 깊이 (최대 1mm) 채널을 microfabricating를 허용 수직 측벽과 매우 정확한 기능에 결과.
다양한 크기, microvalves와 유체 경로를 행동시키다하는 데 필요한 microchannels를 포함하는 제어 계층, 그리고 컨트롤에 바인딩하는 가운데 얇은 PDMS 막의 유체 경로와 microchambers를 포함하는 유체 층 : PDMS microvalves 기반 장치는 세 계층으로 구성됩니다 계층. 유체 계층과 제어 계층은 SU - 8 포토 레지스트 마스터에서 PDMS의 복제 성형에 의해 만들어진, 그리고 얇은 PDMS 막 지정 높이에서 PDMS를 회전에 의해 이루어집니다. 제어 계층은 모두의 산소 활성화 후 얇은 PDMS 막에 접착 다음 유체 층과 조립합니다. microvalves는 휴식을 폐쇄하고 부정적인 압력 (예 : 집 진공)을 적용하여 열 수 있습니다. Microvalve 폐쇄와 개방은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 제어되는 솔레노이드 밸브를 통해 자동화되어 있습니다.
여기서 우리는 두 개의 다른 응용 프로그램을위한 두 microvalve 기반 microfluidic 칩을 보여줍니다. 첫 번째 칩은 다양한 혼합 비율에 수성 솔루션의 정확한 하위 nanoliter 볼륨을 저장하고 혼합을 허용합니다. 두 번째 칩은 microfluidic 세포 문화의 컴퓨터 제어를위한 살포 수 있습니다.
디바이스 제어 조작하기 쉽고 간단합니다. PDMS의 biocompatibility로 인해,이 마이크로 칩은 소형 진단 assays뿐만 아니라 기본적인 세포 생물학 연구에 광범위한 애플 리케이션을 수 있습니다.
Protocol
CorelDraw이나 AutoCAD 소프트웨어를 사용 Microfluidic 장치 설계
PDMS microvalves 기반 장치의 원리 : 장치는 세 계층으로 구성됩니다 : 다양한 크기, microvalves와 유체 경로를 행동시키다하는 데 필요한 microchannels를 포함하는 "제어 계층", 그리고 바운드되는 가운데 얇은 PDMS 막의 microchambers을 포함하는 유체 층 제어 계층 수 있습니다. 휴식, 인해 PDMS, 따라서 챔버가 에너지를 입력하지 않고 서로 격리 남아 그 자리에 대한 멤브레인 물개 (reversibly)의 규정 준수 및 소수성 수 있습니다. 밸브는 부정적인 압력 (예 : 집 진공)을 적용하여 연하므로 PDMS 막 따라서 유체 경로를 연결하는 아래로 굴절 두 유체 챔버 사이의 장벽을 지원하는 표면에서 분리 수 있습니다. 밸브 폐쇄는 진공에서 대기압으로 압력 설정을 전환하여 얻을 수 있습니다.
유체 계층과 제어 계층 패턴은 CorelDraw이나 AutoCAD 소프트웨어를 사용하여 설계되었습니다. 이러한 설계를 포함하는 마스크는 상업 서비스 (CAD / 아트 서비스, 밴든, OR)를 통해 투명 필름에서 높은 해상도 (8000 20,000 DPI)에서 인쇄되었다 (마스크 표시되지 않음).
표준 SU - 8 석판술를 사용하여 실리콘 마스터 제작
- 표준 SU는 - 8 석판술 방법은 SU - 8 "마스터"(SU - 8 2050, MicroChem, 뉴턴, MA) microfluidic 레이어 및 청정실에서 밸브 제어 계층 (이 동영상에 표시되지 않음)에 대해.를 만드는 데 사용되었다
- 이전 PDMS 복제 SU - 8, 릴리스를 촉진하기 위해, 마스터는 플루오로 실란 ((tridecafluoro - 1, 1,2,2, - tetrahydrooctyl) - 1 - trichlorosilane (TFOCS))에의 증기에 노출에 의해 silanized되었습니다 진공 소스에 연결된 건조기 병 (알약을 건조하지 않고). 건조기 챔버는 TFOCS 증기의 부식 특성 화학 퓸 후드 때문에 내부에 위치해야합니다.
- 건조기 챔버 내부에 흡수 종이 타월의 일부를 놓으십시오. 종이 타월에 TFOCS 한 방울을 추가하고 챔버에서 공기를 피난. 1 분에 대한 진공을 적용하고 끕니다. 진공 증착을 닫고 30 분 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 닫힌 용기에서 마스터 보관하십시오.
마스터에서 PDMS의 복제 성형
- 유체 계층과 제어 계층은 SU - 8 마스터에서 PDMS의 복제 성형에 의해 만들어집니다.
- 거품 지우지 10-15 분 건조기에서 철저하게 혼합 PDMS 사전 폴리머 및 가교제 (10시 1분 WT. 비율), 데 - 거품.
- 1~2cm 긴 조각으로 실리콘 튜브 컷. 응용 프로그램에 따라 튜브의 적절한 크기를 선택하십시오. 우리는 나중에 16분의 1 인치 OD 튜빙에 쉽게 연결하기위한 여기에 1.14 mm의 ID tubings를 사용합니다.
- 제어 계층의 SU - 8 마스터의 입구 지역에 아교 튜브에 Duco ® 시멘트를 사용하십시오. 실리콘 튜브는 PDMS와 같은 구성 요소로 만들어진이며, 튜브가 공기와 유체 꽉 인레츠 / 콘센트를 만들어, PDMS microfluidic 장치에 포함되므로, 너무 많은 접착제를 사용하지 않도록주의하십시오.
- 우리의 장치에 유입 지역은 유체 및 제어 레이어 모두의 마스크에 설계된지만, 실리콘 튜브의 인레츠는 장치 중 하나 계층 (예를 들어, 제어 레이어)에 성형 수 있습니다. 유체 레이어 인레츠를 만들려면, 우리는 수동으로 유입 지역을 커버 막의 몇 부분을 제거하거나 주사. 바닥 표면은 종래의 현미경의 무대 장치의 영상을 지원, 평면되도록 따라서, 정렬 및 조립 후 모든 microchannels은 (흐름뿐만 아니라 밸브를 제어하는 이들을 수행하시는 분들) 장치의 상단에서 액세스할 수 있습니다.
- 조심스럽게 제어 레이어 마스터의 튜브 주위에 두 주인에 드 부풀어 오른 PDMS 잔. 건조기에 다시 데 - 거품. 드 버블링가 완료되면, 65 경화에 대해> 1 시간 동안 ° C 오븐에 넣어.
- 치료 제거 PDMS 덮인 오븐에서 마스터합니다.
- 마스터 (각 마스터 세 동일한 장치를 포함)와 필 오프에서 개별 장치를 자르고.
- 바늘이나 집게 한 켤레를 사용하여 입구 지역에서 접착제를 제거합니다.
- 청정실로 제어 계층 PDMS를 가져가라.
씬 PDMS 막 제조
- 와 같은 장치의 원리에 나타난 중간 계층 ~ 12 μm의 두께 PDMS 막으로 구성되어 있습니다.
- 10시 1분 WT를 섞습니다. vortexing하여 헥산 (3시 1분 WT. 비율)와 PDMS 예비 중합체 / 치료 에이전트 혼합의 비율.
- 깨끗한 방으로 이동합니다. (먼지없는 환경은 PDMS의 점막이 결함 무료 것을 보장을위한 중요합니다, 먼지 입자는 구멍 및 / 또는 defectively 복제 금형에 바인딩을 포함하는 점막이 발생할 수 있습니다.)
- silanized 3 인치 직경 웨이퍼를 써Solitec의 회전자의 진공 척 수 있습니다. 웨이퍼는 PDMS 이전에 실리콘 표면에서 PDMS의 석방을 촉진하기 위하여 회전 (플루오로 실란 함께 derivatized) silanized 수 있습니다. 척 이외의 테플론 그릇은 쉽게 청소 플라스틱 필름으로 포장했다.
- 18 게이지 주사기 바늘을 (거품을 최소화)을 사용하여 웨이퍼 위에 PDMS / 헥산 혼합물로부터 2-3 ML 하는걸.
- 스핀 매개 변수를 설정합니다. ~ 12 μm의 두께의 PDMS 필름의 결과, 30 초에 대한 7,000 rpm으로 회전.
- 85에서 웨이퍼를 가열 ° C PDMS 필름을 치료하기 위해 철판 4 분.
다층 PDMS 장치 결합 및 조립
- 제어 레이어와 산소 플라즈마 챔버에 PDMS 막 넣고. 30 초 (산소 압력 30 PSI, 유량 3-5 SCFH, 550W)의 플라즈마를 켭니다. 산소 활성화 직후 PDMS 막 (5 분 이내)와 접촉하게 제어 레이어를 가져와. 이러한 산소 압력, 유량 및 플라즈마 전원 및 치료 시간과 같은 시스템 매개 변수, 경험적으로 서로 다른 애플 리케이션에 따라 구성됩니다.
- 5 분 기다립니다, 그리고 멤브레인와 함께 웨이퍼에서 제어 레이어를 제거합니다.
- 제어 및 유체 레이어 모두 튜브를 통해 위로부터 접근할 수 있도록 인레츠 분야에서 세포막을 제거합니다.
- 입체경 아래 유체 층 (평면)과 제어 계층 (인레츠 같은 tubings)를 맞춥니다. 때문에 PDMS에 PDMS 물개는 더 영구적인 결합이 필요하지 않습니다.
컴퓨터 제어 열고 진공 또는 압력에 의해 PDMS의 microvalves의 폐쇄
- 장치 정렬 및 조립 후, 1.14 mm의 ID의 실리콘 인레츠에 16분의 1 인치 OD (32분의 1 인치 ID) Tygon 튜빙를 삽입하고 압력 소스 또는 유체 저수지에 인레츠를 연결합니다.
- 밸브를 열고 닫는 경우, 압력은 진공 라인과 미니 세 방향 솔레노이드 밸브의 배열에 두 압력 조절기를 통해 연결된 공기압 라인에 의해 제어됩니다.
- 솔레노이드 밸브는 Labview 소프트웨어를 통해 제어 내쇼날 인스 트루먼 트의 데이터 수집 하드웨어로 연결됩니다.
- 장치 운영 및 막 편향은 컬러 CCD 카메라 (SPOT RT, 진단 계측기, 스털링 헤이츠, MI)과 시각 수 있습니다.
병렬 다른 정의 nanoliter 볼륨에서 두 개의 서로 다른 색상의 염료의 혼합
우리는 다양한 혼합 비율에 수성 솔루션의 정확한 하위 nanoliter 볼륨을 저장하고 믹싱을 허용 병렬 믹서의 작동을 보여줍니다 :
- 유체 층 microchambers 두 배열이 포함되어 있습니다 : 배열면서, microchambers의 크기는 200 μm의에서 X 400 μm의 200 μm의 X 40 μm의로, 왼쪽부터, 감소, 10 500 μm의 X 40 μm의 챔버하고 있습니다 단지 배열에 유체 연결에 사용, 챔버 10의 오른쪽에 대칭 크기 증가 챔버의 집합입니다. 배열 B의 여왕님 같은 설계는 것을 항상 같은 다른 행을 두 개의 인접 실의 추가 볼륨. 0, 0r와 B 10, B 10r은 혼합하지 않고 솔루션을 A와 B에 대한 각각의 컨트롤로 설계되었습니다.
- 제어 계층은 밸브의 두 독립적으로 제어 세트가 있습니다. 밸브 {2} V의 두 번째 세트는 두 배열의 챔버의 각 쌍을 연결하는 데 사용되는 반면, 밸브 V {1}의 집합은 각각 인레츠 두 개의 챔버 배열을 연결하는 데 사용됩니다.
- A와 B, 각각 배열 두 염료 솔루션의 흐름을 허용하는 밸브 세트 {V 1} 열어 microchambers를 입력합니다. 솔루션의 흐름은 손으로 또는 진공을 통해 얻을 수있는 솔레노이드 밸브로 제어 이겠지. 공기 방울이 microchambers 형태면, 더 많은 솔루션은 거품을 제거하는 강요 수있다, 또는 장치는 PDMS의 공기 투과성으로 인해 사라지는 몇 분 거품이 남아 있습니다.
- 두 배열의 각 챔버를 분리하는 밸브 세트 {V 1} 닫습니다.
- 다른 배열의 인접 챔버 사이에 액체가 혼합 수 있도록 오픈 밸브 세트 {V 2}. 혼합이 볼륨에 완료 ~ 1-2 분 밖에 걸리지 않습니다.
- 각 유체 챔버로 다시 유체를 밀어 {2} V 닫고 챔버 스는 원래 형태로 다시 변형. 두 유체 배열이 11 다양한 크기의 챔버 설계되기 때문에, 11 다른 혼합 비율은 단일 혼합 단계에서 생산됩니다.
microfluidic 세포 문화의 컴퓨터 제어 재관류를위한 통합 microfluidic 시스템
우리는 하나의 세포 배양 챔버에 여러 솔루션의 자동 재관류 수있는 microfluidic 시스템을 보여줍니다.인레츠은 단일 인레츠, 각종 조합, 또는 한번에 모두의 순서로 활성화할 수 있습니다 microvalves에 의해 제어됩니다. 이 장치는 기울기 또는 다양한 솔루션의 혼합물을 생산이 가능합니다.
유체 계층, 제어 계층, 그리고 중간 얇은 PDMS 막 :이 장치는 세 계층으로 구성되어 있습니다.
이 장치에 대한 대체 제조 단계 :
- 유체 채널과 제어 채널에 대한 유입 포트 사용 "펀치"입니다 1.2 mm 직경 해리스 마이크로 펀치 (테드 펠라 주식 회사). 튜빙은 제어 계층을 통해 PDMS에 삽입 무딘 18 게이지 바늘을 사용하여 인레츠에 연결되어 있습니다. 이것은 실리콘 튜브보다 인레츠의 밀도 포장을 허용합니다. PDMS의 준수 효과적으로 액체 또는 공기 압력을 전달하기 위해 바늘 주위에 단단히 인장을 제공합니다.
- 이전에 설명한 바와 같이, 제어 계층에 얇은 PDMS 막의 결합은 산소 플라즈마에 노출을 사용하여 수행됩니다.
- 유체 계층은 5시 1분의 비율로 PDMS 사전 폴리머와 가교제와 함께 복제 성형에 의해 준비하고 부분적으로 60 ° C 대류 오븐에서 25 분간 경화입니다. 이 시점에서, 부분적으로 치료 유체 층은 여전히 촌스러운, 아직은 마스터에서 제거할 수 있습니다.
- 유체 계층은 수동으로 입체경를 사용하여 미리 조립 제어 및 멤브레인 레이어에 정렬됩니다. 조립 장치는 다음 80 º C.에서 5 분 열판에 위치 다음, 밸브 제어 라인은 자동화 컨트롤러에 연결되어 있고 멤브레인 진공을 적용하여 모든 밸브 시트에 유체 층에서 분리 때까지 밸브는 actuated 있습니다. 장치가 추가로 최소한 1 시간 동안 80 º C에서 열판에 치료하는 동안 밸브를 '분리'후 컴퓨터 컨트롤러에 대한 순환 밸브를 끌으로 설정됩니다.
우리의 통합 microfluidic 시스템의 기능 : 장치가 다중 valving 방식을 사용하여 세포 배양 챔버 16 가지 솔루션의 자동 재관류이 가능합니다. 채널 디자인은 모든 인레츠의 저항이 균형을 보장합니다. 우리 microvalve 디자인은 교차 오염을 제한 유체의 신속한 제거를위한 통합 채널을 통해 rinsing 솔루션과 제어를 분리합니다. 통합 고기뼈 믹서는 여러 인레츠의 혼합물을 생산하기 위해 활성화할 수 있습니다. 또한 유량을 변경 활성화될 수있는 4 가지 다양한 저항 채널이 있습니다.
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Discussion
우리 microvalve 디자인의 주요 장점 :
- 엑스트라 에너지원이 유체 경로를 가까이에 필요하지 않다, 그러니 로드된 장치는 고도의 이식 및
- 장치는 수직 측벽과 깊이 (최대 1mm) 채널 (예 : 기능의 높이가 독립적으로 그들의 너비를 지정할 수 있습니다) microfabricating 매우 그 결과에 대한 있도록 photolithographically - 패턴 SU - 8 금형에서 PDMS 복제에 의해 만들 수 있습니다 정확한 있습니다.
병렬 믹서의 장점 :
- 그것은 제어 조작하기 쉽고 간단하다.
- 볼륨 photolithographically, 따라서 매우 정확한 정의되고 있습니다.
- 유체 및 시약은 높은 휴대 assays 수있게 몇 일 동안 microdevice에 저장할 수 있습니다.
- 특히, PDMS 너무 장치가 소형 진단 assays에서뿐만 아니라 약물 검사 및 효소 기반 생분자 감지와 같은 셀 기반 assays의 광범위한 응용을 가지고, biocompatible 수 있습니다.
통합 microfluidic 재관류 챔버의 장점 :
- 그것은 하나의 세포 배양 챔버에 여러 화학 솔루션의 자동 재관류이 가능합니다.
- 인레츠은 단일 인레츠, 각종 조합, 또는 한번에 모두의 순서로 활성화할 수 있습니다 microvalves에 의해 제어됩니다.
- 이 장치는 기울기 또는 다양한 솔루션의 혼합물을 생산이 가능합니다.
메인은 제조 공정에 대한주의 :
- 먼지없는 환경은 점막이 결함 무료입니다 보장 PDMS 막 제조 동안 중요합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 부여 # EB003307 국립 연구소 및 AF에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Clean silicon wafers | Supplies | Silicon Sense Inc. | 3P0110TEST | 3-inch diameter, P/Boron |
| "Master" wafers containing SU-8 patterns | Supplies | Fabricated in house using standard photolithography procedures | ||
| Desiccators (2) | Equipment | VWR international | 24987-048 | One for silanization, one for PDMS de-bubbling. |
| Balance | Equipment | OHAUS Corp. | SC6010 | |
| Oven | Equipment | Sheldon Manufacturing, Inc. | 1330GM | |
| MiniVortexer | Equipment | VWR international | 58816-121 | |
| Spinner | Equipment | Headway Research Inc. | PWM32 | |
| Plasma etcher | Equipment | Plasmatic Systems, Inc. | Plasma Preen II-973 | |
| Hot Plate | Equipment | Torre Pines Scientific | HP30A | |
| Stereoscope | Microscope | Nikon Instruments | TMZ1500 | |
| CCD camera | Equipment | Diagnostic Instruments | SPOT RT | |
| Solenoid valves | Equipment | Lee Company | LHDA0511111H | |
| Data acquisition board | Hardware | National Instruments | PCI 6025E, CB-50LP | |
| LabView | Software | National Instruments | Version 8.0 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Reagent | United Chemical Technologies | T2492 | Silanization must be done in a chemical fume hood. |
| PDMS prepolymer and crosslinker | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Hexane | Reagent | EMD Millipore | HX0295-6 | |
| Color Dyes | Reagent | Spectrum Chemical Mfg. Corp. | FD&C 110, 135, 150 | Blue #1, Yellow #5, Red #3. |
| 3 ml disposable transfer pipets | Supplies | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Kimwipes | Supplies | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| Weighing boats | Supplies | VWR international | 12577-027 | |
| Tongue depressor | Supplies | Fisher Scientific | 11-700-555 | |
| P100 dishes | Supplies | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.)) | Supplies | Cole-Parmer | 07625-30 | |
| Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in) | Supplies | Cole-Parmer | 06418-02 | |
| Duco Cement | Supplies | Devcon Inc. | 6245 | |
| Razor blade | Tools | VWR international | 55411-050 | |
| Needles | Tools | Fisher Scientific | 0053482 (25 Gauge) | |
| #5 Forceps | Tools | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 50 ml centrifuge tube | Supplies | Fisher Scientific | 05-526B | |
| Seal wrap film | Supplies | AEP Industries Inc. | 0153877 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Supplies | Fisher Scientific | 05-406-16 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Supplies | BD Biosciences | 352097 | |
| Purple nitrile power-free gloves | Supplies | VWR international | 40101-348 | |
| 1.2 mm Harris biopsy punch | Tools | Ted Pella, Inc. | 15074 |
References
- Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays. Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
