Summary
我々は生きているの触角葉で匂い誘発カルシウム応答を測定し、分析するための確立された技術を記述する
Abstract
触角葉、昆虫脳内の主要な嗅覚中枢であり、脊椎動物の嗅球1-5の解剖学的および機能的に同等を表しています。外界の嗅覚情報は、それらが表現する特定の嗅覚受容体に応じて糸球体と呼ばれる神経網の異なる領域に分離する嗅細胞（OSNs）によって触角葉に送信されます。ここでは、より高い嗅覚脳領域への嗅覚情報を伝えるため、両方のローカルプロセス多くの異なった糸球体を支配することができます介在（LNS）と、投射ニューロン（PNS）とOSN軸索のシナプス。
触角葉におけるOSNs、LNSとPNの活動の光学的イメージング - 伝統的に合成カルシウム指標（例えば、カルシウム、緑、FURA-2）または電位感受性色素（例えばRH414）を使用して - 長い理解することが重要な技術であった方法嗅覚刺激が空間的および時間的パターンとして表されます。昆虫6-10の多くの種における糸球体の活動。このような蛍光カルシウム指標G-CAMP 11,12とカメレオン13と遺伝的にエンコードされた神経活動の記者の開発、生物発光カルシウム指示薬GFP-エクオリン14,15、またはシナプス伝達のレポーター、synapto-pHluorin 16が行ったショウジョウバエの嗅覚系、神経イメージング、特にアクセスキイロショウジョウバエでは 、その包括的に記述され、分子の電気生理学的および神経解剖学的特性を2,4,17を補完する 。これらの記者は、選択的に臭気誘発方法、高空間分解能と時間分解能で詳細に分析する嗅覚回路内のニューロンの定義された集団でバイナリ転写制御システム（例えばGAL4/UAS 18、LexAの/ LexAop 19,20、Qシステム21）を介して表現することができる神経活動が表現され、変調されたと22から24 <形質転換/>のsup。
ここでは、G-CAMP 25から27を使用して、 ショウジョウバエの触角葉で匂い誘発反応を測定するための準備と分析方法について説明します。動物の準備は低侵襲で、広い視野、蛍光共焦点顕微鏡と二光子顕微鏡を用いたイメージングに適応することができます。
Protocol
1。取り付けブロックアセンブリ
- プレキシガラス取り付けブロック（図1A）は（から入手できます青写真で指定された正確な仕様にすべきである
http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ）簡単な取り付けとハエの解剖を許可します。背面からネジを使ってスレッドがブロックの前を越えて、それらを拡張することはありません、彼らの位置は、動物の準備中に調整されます（2.7を参照）。 - 精密ドリルを使用して、この時点ではブロックの厚さを減らすこと、ハエの体のためのスペースを作るために表面下に掘り、フライ用の円形の容器の上縁にくぼみを作る。
- メス垂直銅グリッドをカットし、 "カラー"を作成するためにスリットの底部に近接しています。これは、ハエの挿入を助けるように、2つの結果のフラップが、レベルであることを確認します。
- 爪楊枝で、フライ用の円形の室上記の取付けブロックの上に瞬間接着剤の小滴を配置します。スリットはブロック（図1A）を中心にされるように、接着剤や位置に銅グリッドを配置します。静かに押し、余分な接着剤を除去します。ピンセットで、それぞれの側にフラップの下に接着剤の小さな滴を追加して、スリットがまっすぐ下向きになるように、ブロックの前面上にグリッドを折る。グリッドの一番上のブロックと同じ高さであることを確認してください。完全に乾燥することができます。
- ワイヤーホルダーをアセンブルします。半分にプラスチックのカバースリップをカットし、 "U"の形を作るために中央部分を削除します。接着剤に "U"の上部に線の部分を蜜蝋を使用します。線があまりにもピンと張ったことはありません。
- 触角シールドを構築する：紙穴パンチが付いているプラスチックカバースリップに穴を開ける。 0.5×0.7 cmにカバースリップの端をトリミングします。接着剤粘着テープにピアスプラスチック製カバースリップした後は、に穴を介して公開され、テープ上のエタノールのドロップを配置接着剤を除去します。
2。動物の準備
- "ドライバ"の所望の組合せを有する、すなわち、アクティビティレポータートランスジーン - - 適切な遺伝子型のハエは1-3週齢でなければなりません。若いハエのキューティクルは、切るには余りにも柔らかいとは困難である。実験では、導入遺伝子の発現レベルを一致させるために、異なる遺伝子型の直接的な比較を必要とする場合、ハエは、加齢に伴う生理的な違いを避けるために、年齢をマッチさせなければなりません。性別が重要でない場合は、我々は、彼らが大きな頭を持っていると操作しやすいので、女性のハエを使用することを好む。
- 氷上で冷却することにより、ハエを麻酔。
- 取り付けブロックに、単一のフライを紹介します。ウィングジョイントでハエを保持し、それがその首（図1B-C）によって中断されるように銅グリッドのスリットに沿って、背側表面には、まずそれをスライドさせます。必要であれば、それがダウンして見ている限り、それを回転させます。
- fの前に細かいサボテンの棘を配置（図1B-C）エスケープからそれを防ぐために、LYの頭。移動するのを防ぐために、長い鼻の前にサボテンの棘を配置します。蜜蝋を使ってブロックにサボテンの棘を修正します。頭のてっぺんは、ブロックの頂部と水平であることを確認してください。
- ロジンの小滴（エタノールに溶解）をブロックにハエの頭を固定します。加湿ボックス内のブロックを置き、約1時間硬化ロジンを許可します。
- アンテナと頭部の間にクチクラ倍で、鉗子を使用して、前方に触角板を引っ張り、ホルダーにワイヤーをドロップする（1.5を参照してください。ワックスサイドアウト）。蜜蝋でのブロックの前にホルダーを固定します。
- ブロックに組み込まれているネジを使用して、静かに触角板とヘッドの間にいくつかのスペースを作成するために前方にワイヤーホルダーを押し込みます。
- 中央に配置穴のハエの頭の上に触角シールド（1.6を参照）を配置します。取り付けブロックの先頭に蜜蝋で固定します。
- ブレード·スプリッタは、cuを使用してシールド上のテープに、TA小さな穴は、アンテナの背後にあるハエの頭のキューティクルを公開しています。穴が漏れるの準備を防ぐために目を超えてはいけません。
- 二成分のシリコンを使用してテープとキューティクルの間に穴をシールします。ハエの頭部の上から余分なシリコンを削除します。
- 頭の上にショウジョウバエリンゲル液生理食塩水（130mMの塩化ナトリウム、5 mMの塩化カリウム、2mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2を 、36 mMのサッカロース、5mMのHEPES、pH7.3）でのドロップを配置します。アンテナは完全に乾燥したままする必要があります。漏れがないことを確認してください。サファイアブレードを使用して、キューティクルに穴をカット。まず、直接アンテナの背後にあるクチクラの折り目に沿って軽く得点してから、背中に目に沿って、単眼横切る。最後に、ゴール端にキューティクルの部分を折ると触角神経を切断することを避けるために下側から切断。
- 慎重に微細なピンセットで腺や気管を削除します。 ショウジョウバエで繰り返しすすぐ
3。匂い刺激の配達
- 臭気シリンジは：バレルの奥深くパッドをプッシュするピペットチップを使用して、適切な溶媒中で、必要に応じて希釈し、（フィルターチップを使用して）その上に清潔なピンセットとピペットで2mlプラスチックシリンジに臭気の20μlをセルロースパッドを挿入する。プラグとキャップシリンジが必要になるまで。少なくとも3ヶ月ごとに（またはそれ以上頻繁に非常に揮発性および/または頻繁に使用される臭気のために）新鮮な臭気の希釈液を準備する必要がありますし、新しいパッドは単にそれぞれのレコーディング·セッションの前に臭気シリンジのために準備する必要があります。臭気濃度が減衰する可能性がありますので、3つ以上の刺激のために臭気パッドを使用しないでください。
- カスタムメイドの嗅覚（図2）：一次空気の流れは（1リットル/分）テフロンチューブ（0.4ミリメートル、内径）を介して指示されています。上流のこの管の出口、二次空気の流れ（1リットル/ minの27センチメートル付加されます）。両方の空気の流れは、膜ポンプによって生成され、流量は、2つの独立した流量計によって規制されています。ケア（すなわち〜60％以上）、過加湿を避けるために注意する必要がありますが、空気の流れは、ガス洗浄瓶に水を通過することにより加湿することができます。二次空気の流れは、臭気シリンジまたは空の注射器のいずれかを介して指示されています。シリンジはプランジャーを貫通注射針（1.2ミリメートル外径）を介して気流に接続されています。バルブコントローラユニット（例えばハーバード装置VC6）を介して制御三方電磁弁は、きれいな空気と匂い刺激を切り替えるために使用されます。
（4）in vivoイメージング
- ここでは20倍の水目標（例えばツァイスW "プラン·アポクロマート" 20X / 1,0 M27 DIC）（図2）を搭載した直立蛍光顕微鏡（例えば、直立固定ステージツァイスアクシオ審査のD1）を使用してイメージングを記述します。 G-CAMP（励起/発光：509分の488 nm）での撮像の場合：450から490 nmの励起フィルター、次のプロパティを持つフィルタ·ブロックを使用ダイクロイックミラー（T495LP）と500から550 nmの発光フィルター（クロマET）。顕微鏡下でハエを含む取り付けブロックを配置します。ハエの触角の前に嗅覚約0.5cmの出口に配置します。
- それはハエの頭の上にリンゲル液に触れるまで目標を下げます。頭部カプセルに穴を中心とし、その境界にフォーカスがあるされるように、明視野照明の下で、位置の準備をビューアで調べましょう。あなたが標識されたニューロン（G-CAMPの基底緑色蛍光から明らかに）表示されるまで、蛍光灯に切り替えて、フォーカスを調整します。
- カメラ（例えばCoolSNAP-HQ2デジタルカメラシステム）が適切な買収のソフトウェア（例えばMetafluor）（図3A）を使用して、顕微鏡に搭載された電荷結合素子（CCD）を使用して画像を取得することで興味のある糸球体にファインフォーカス。撮像された領域に励起光を制限するために、照明光路に絞りを閉じます。
- 録音臭誘発のために活動は、少なくとも12ビットのダイナミック分解能で、1000（任意の単位）よりも下位4 Hzに取得率を設定し、CCDカメラのダイナミックレンジ内での蛍光値を取得するには、露光時間を調整できません。露光時間はG-CAMPの退色を軽減するために、可能であれば、100ミリ秒を超えてはなりません。カメラの空間分解能が許可されている場合は、露出時間を短縮するために（1デジタル画素にビニングされ、チップ上のウェル数）ビニングを増やすことができます。我々は準備で210x135μmまで対応する350x225ピクセル（2x2のビニングを含む）の画像を得る。これらの設定は、漂白レポーターを制限しながら、優れた空間分解能と時間分解能でG-cAMPの糸球体の匂いに誘発される応答をキャプチャすることが最適です。
- 測定パラメータを設定します。我々は一般的に匂い刺激は、通常、取得期間の開始後4秒を開始する（フレーム15）と永続的な1秒（uで、10秒（つまり40フレーム）の記録ntilフレーム19）。フライの準備は、通常、頻繁に退色に起因するレポーターの蛍光シグナルの不可逆的な減少によって制限さ25から30の異なる匂い刺激にしてまでテストすることができます。間刺激間隔が観測された応答の強さと光退色の速度に依存します。感覚適応を避けるために間刺激間隔の適切な長さは、試行実験のポジティブコントロールの臭気（既知の場合）の反復提示により約決定することができます。この匂いを含めるすべての与えられた一連の〜10刺激は準備の継続的な生存率の検証と一貫性のある応答を許可することができます。
5。データ処理と解析
データは、ImageJの（Macのフォトニクスプラグインで、使用して処理されwww.macbiophotonics.ca ）、次のようにMatlabとRのカスタム書かれたプログラム：
- サンプルの動きアーチファクトを補正する。StackReg / TurboRegの"剛体"モード（使用して1つの動物の準備（例えば40フレームごとに30の測定値）に対応するすべてのイメージに合わせbigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg ImageJはでます）。このステップは、測定内および間に取得フレームに対してで標識されたニューロンの位置のずれを削除する必要があります。しかし、これはxy平面の変化を除去するためにのみ可能です。フォーカスの強力な変更が発生した場合、データは破棄されるべきである。
- 個々の10秒（40フレーム）の測定にセグメントスタックを。
- アーティファクト漂白のために正しい：蛍光灯への曝露は、単一の測定10の間に減衰する蛍光の原因となります。いくつかのケースでは、データを分析する前に、この減衰を補正することが重要です。各測定の背景フレームを計算します。これは、刺激開始（例えば、フレーム6-14）の前にいくつかのフレームの平均でなければなりません。このbackgすることにより、各フレームを分割する相対的な蛍光の変化を得るためにラウンドフレーム。 G-CAMPで標識された区域内のすべてのピクセルを平均化することによって、各フレームの平均相対蛍光値を計算します。匂い応答（この例では刺激開始後20フレーム）の時間への刺激とゼロの重みの前にフレームに強力な重量を与えて、平均蛍光曲線の二重指数関数を近似します。各ピクセルの相対的な蛍光曲線から近似曲線を引きます。生データを再取得するための背景フレームにより補正されたフレームを掛けます。信号は、測定終了（抑制または非常に強い興奮性の応答が誘発されている場合など）（図4）ベースラインに戻っていない場合、補正のこの種の反応ダイナミクスの変更につながる可能性があります。漂白アーチファクトの補正は、多くの場合に有用ですが、漂白剤の補正が適用されている場合は、時間的なパラメータの解釈は慎重になされるべきである。
- 蛍光（＆デの相対的な変化を計算します。LTA、F / F 0 * F 0は背景フレーム100、（5.3を参照）、F（F、I-F 0）と各測定のフレームごとに/ F i）のi 番目のフレームの蛍光値測定。
- アクティビティトレース（図5A）を得るために10ピクセルの直径を持つ球体（図3B）への関心の円形領域内の平均値ΔF/ Fを計算します。必要に応じて、ImageJを（図5A）を使用して、ヒートマップにこれらのトレースを変換します。
- 応答のピーク時の4つのフレームの平均値ΔF/ Fからの刺激の前に4フレームの平均値ΔF/ Fを減算することによって応答のピーク振幅を計算します。同じ手順は、空間的な応答パターン（図3Bを参照）説明するために（図5bを参照）ハエ全体の関心のある特定の地域における応答振幅を定量化するために両方を使用されています。ピーク応答は、刺激の時間、またはaveragin中の曲線下の領域を統合することによって定量することができる応答の最大約gはフレーム。
6。代表的な結果
我々はOSNs 29,30のいくつかの異なる集団でアクティブになっている嗅覚共同受容体IR8a、（たとえば、プロモーターの制御下にG-CaMP1.6 28を発現しているハエのプロピオン酸誘発反応を記録し、分析するために、上記のプロトコルを使用図3-5）。 1パーセントプロピオン酸による刺激は、G-CAMPの蛍光の増加を誘発する - 細胞内カルシウムの増加を示す - 2つの球体、DC4とDP1l（図3B）を支配OSNsで。ラインのアクティビティのトレースは、ヒートマップ、ピークレスポンスのバーをプロットする：我々は、図5の複数のハエからのデータを表すさまざまな方法を示しています。プロピオン酸誘発応答はDC4とDP1lで明確なピークの振幅と時間的なダイナミクスを持っています。また、個々の動物の間に応答が一般的に堅牢であるが、ばらつきも糸球体（彼を参照してください。両方で観察することができます図5Aにatmaps）。ピーク応答（図5B）の定量は、動物間で異なる糸球体と異なる匂い物質間の単純な統計的比較を可能にします。しかし、臭い誘発カルシウム応答は、非一様時空のダイナミクスを持つことができ、単一の値とその大きさを定量化すると、この複雑さを無視します。
図1：取り付けブロックの模式フライの導入、クローズアップで（C）トップビュー（31から適応）（）の前と（B）の後。
図2実験セットアップの概略図。
図3のステップ2.8（左パネル）とアンティの生の蛍光画像の後にフライの準備（A）トップビューNNALローブはG-CaMP1.6（;：G-CaMP1.6：IR8aプロモーターUAS GAL4遺伝子型）で標識した。 DC4とDP1l糸球体は、それぞれ、その形態、大きさと位置によって区別することができ、赤と青で表示されています。
プロピオン酸（1％v / v）の反応の（B）に色分けされた画像。画像（これも図5Aを参照）、ステップ5.6で説明したように計算された応答のピークのΔF/ Fに対応しています。左のColorScaleのは、％ΔF/ F値を示します。黒丸は（図5を参照）の応答を定量化するために使用される関心領域の位置とサイズを示しています。
図4蛍光レポーター信号の漂白修正。ステップ5.3で説明されるように漂白剤補正の効果の例を示します。左側のパネルのサンプルデータは、応答の形状に大きな変化がなく、修正することができます。右側のパネルのサンプルデータは、深刻な影響を与えている漂白剤の補正によるED、おそらく信号が低下し、臭気、刺激終了後にベースラインより下に維持されるため。
図5（A）上：糸球体DC4（左）とDP1l（右）プロピオン酸（1％v / v）のカルシウム応答の時空間ダイナミクス。黒のトレースは、8匹の動物間での関心領域（図3Bを参照）内での平均ΔF/ Fの中央値を示しています。灰色の表面は、ディストリビューションの1番目と3番目の四分位数間の範囲を示しています。中央値と四分位数の値のプレゼンテーションでは、平均値と標準誤差よりも観測された応答の変動と分布に関する詳細な情報を提供します。緑とマゼンタボックスは、フレームは図3Bに示すように、図5Bに定量ピーク応答を計算するために平均を示しています。底部：ヒートマップは、ΔF/ F値のreprで、別々の行のすべての個々の動物の応答データを表示するColorScaleの（右端）がesented。水平の黒いバーは、刺激の時間と期間を示しています。 （B）DC4とDP1l糸球体のための8つの動物の間のプロピオン酸に中央ピーク応答。エラーバーは、ディストリビューションの1番目と3番目の四分位数間の範囲を示しています。
Discussion
ここで説明した準備や分析方法は、対応するドライバの導入遺伝子が利用可能である触角葉（OSNs、LNとPNS）の神経細胞のいずれかの集団で臭気誘発応答を分析するために使用することができます。我々は蛍光顕微鏡を使用してアプリケーションを記述しながら、本製剤の光イメージングが均等に焦点または二光子顕微鏡22,32を用いて行うことができる。実際、これらの後者の楽器は、ニューロンExpressの場合は特に、多数のレポーター、画像の解像度を減らすことができる広視野顕微鏡の光散乱問題を軽減する。この製剤は、通常、少なくとも半時間臭気誘発応答の録音を許可しますが、この時間は、記録された測定値の数と長さに応じて各フレーム間の刺激間隔に使用される露光時間大幅に長くしたり短くすることができます。さらに、二光子励起、蛍光repの退色を減らすことができますorterと同様に、細胞の毒性は、長い期間にわたって測定22,32を許可します。
かかわらず、顕微鏡の選択の、頭部カプセル内のハエの脳の動きは時に無傷の動物のイメージング最も再発の問題です。動き補正はマイナーな問題を（ステップ5.1）修正することができますが、それは非常に安定した調製物から録音する方が良いだけです。動きのアーチファクトを低減するための戦略は、（i）適切にサボテンの棘を持つハエの口吻を抑制すること、（ii）エイコサン（前の2.6ステップ）（エイコサンがで溶融させることができるとステージに固定することにより、ハエの脚を固定する〜 37°C;）この目的のためはんだごての先端を拡張し、洗練するために銀線を使用すること、（iii）微細なピンセットを用いて食道を（触角神経の間に表示されます）ニッキング。
ここで使用されるG-CaMP1.6に加えて、G-cAMPおよび他のカルシウム指標の最適化バージョンの数は、ご利用いただけますこれは、それらの信号対雑音比は、ベースラインの蛍光および時間的ダイナミクス12,28,33が異なります。センサの正確な選択は、アカウントにこれらのすべてのプロパティは、ニューロンのタイプを分析すると生物学的な問題が対処されているを取る必要があります。電流センサは、活動電位12,34とかなりよく相関カルシウムの変化を報告し、特定の遺伝子のドライバー·ライン数の増加35と結合し、その更なる向上は、そのままその場で神経活動の光学的イメージングの可能性を強化していきます。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は図1の回路図を使用するための取り付けブロックの青写真とダニエラ·ペルツを描画するためのパブロTraversa、この方法論の開発にジルケSachseとベアテEisermannを認める。私たちは、原稿上のコメントのジルケSachse、パヴァーヌRamdyaとラファエルRytzに感謝しています。 R.ベルは、ベーリンガーインゲルハイム財団博士フェローシップでサポートされています。 R.ベントンの研究室での研究は、独立した研究者グラントとスイス国立科学財団を起動する欧州研究評議会によって運営されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cactus spine | Garden center | ~7mm long thin, not too flexible | |
| Rosin | String instrument shop | ||
| Two component silicon | World Precision Instruments, Inc. | KWIK-SIL | |
| Custom made plexiglass mounting block |  Blueprints available |
||
| Copper grids | Athene Grids | G220-5 | Normally used for electron microscopy samples. |
| Screws | Hardware store | 2 mm diameter | |
| Plastic coverslips | Plano GmbH | L4193 | 22 X 22 mm |
| Soldering iron tips | Conrad Electronics | 830283-62 | |
| Regulated power supply | Conrad Electronics | 511407-62 | |
| Thin wire | Isabellenhütte | Isa-ohm | 0.013 mm |
| Eicosane | Sigma-Aldrich | 21,927-4 | |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioexaminer D1 | |
| CCD camera | Visitron Systems | CoolSnap HQ | |
| Metafluor | Visitron Systems | Acquisition software | |
| Monochromator | Visitron Systems | Visichrome | |
| Breakable blades | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Holder for blade | World Precision Instruments, Inc. | 14134 | |
| Sapphire blade | World Precision Instruments, Inc. | 500314 | Double edged blade 1mm |
| Membrane gas pumps | KNF Neuberger | NMP 830 KVE | |
| Sapphire blade holder | World Precision Instruments, Inc. | 500317 | |
| Three way valve | Lee Company | LFAA1200118H | Configuration E |
| Rotameter 500 ml/min | Analyt-MTC | 112-08SA | |
| Rotameter 5 L/min | Analyt-MTC | 102-08SA | |
| Beeswax | Siladent Technik | 209212 | |
| Cellulose pad | Kettenbach | 31003 | |
| Tweezers | Plano GmbH | T5130 | Dumont biology #5 |
| Syringes | BD Biosciences | 300928 | 2ml, Discardit II, 2pieces |
| Needles | Braun Sterican | 4665120 | 1.2mm OD |
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