Высокая пропускная способность автоматизированной платформы для развития производства клеточных линий для белка терапии

Summary

Высокой пропускной способностью, автоматизированная платформа изготовления развития клеточной линии для производства белка терапии описано. Реализация BD FACS Сортировщик сотовый Ария, CloneSelect Imager и Tecan Свобода EVO жидкостной системой обработки продемонстрировал значительно увеличили производительность обработки в ячейке развития соответствии с улучшенным качеством клеточной линии и высокую воспроизводимость.

Abstract

Быстрорастущих биофармацевтической промышленности требует ускоренного развития высокоэффективных и надежных систем производства для удовлетворения растущих требований к поставках лекарств. Поколение производственных линий ячейка традиционно участвуют ручных операций, которые являются трудоемкими, низкая пропускная способность и уязвимы для человеческой ошибки. Мы сообщаем здесь интегрированной высокой пропускной способностью и автоматизированной платформы для развития производства клеточных линий для производства белка терапии.

Сочетание BD FACS Aria ™ сотовый Сортировщик, CloneSelect ™ Imager и Tecan Свобода EVO ® жидкостной системой обработки позволило высокой пропускной способностью и более эффективной клеточной линии процесса развития. В этой операции, клетки рабочих узлов, прежде трансфицированных выражением вектора, несущего ген интересов ^1, после чего лечение выбора агента. Стабильно-трансфекции клетки затем окрашивали флюоресценции меченных анти-человеческого антитела IgG, и впоследствии подлежат проточной цитометрии анализа ^2-4. Высокопродуктивные клетки выбирается в зависимости от интенсивности флуоресценции и изолированы от одноклеточных сортировка по BD FACSAria ™. Колония образования из одного-клеточной стадии был обнаружен микроскопически и ряд временных кругов цифровых изображений принимаются CloneSelect ™ Imager для документации клеточной линии истории. После одного клона образовались эти клоны были обследованы на производительность с помощью ИФА осуществляется на Tecan Свобода EVO ® жидкостной системой управления. Примерно 2000 - 10000 клонов может быть обследованы на операцию цикла с текущей настройки системы.

Такой комплексный подход был использован для создания высокопродуктивных яичника китайского хомячка (СНО) клеточных линий для производства лечебных моноклональных антител (МКА), а также их белков слияния. С помощью различных типов обнаружения зондов, метод может быть использован для разработки других терапии белка или быть применены в других хост-систем производства. По сравнению с традиционной процедуры по эксплуатации, это автоматизированная платформа продемонстрировала преимущества значительно увеличила потенциал, обеспечить клональности, прослеживаемости в клеточной линии истории с электронной документацией и многое уменьшается возможность в ошибки оператора.

Protocol

1. Трансфекции клетки-хозяина

1. Семенной 2 х 10 ⁶ CHO-клеток в DXB11 T75 Corning культуре клеток колбу на 15 мл ростовой среды (МЕМА с нуклеотидов и нуклеозидов (Gibco, каталожный номер 12571) с добавлением 10% γ-облученных характеризуется эмбриональной телячьей сыворотки (cFBS) (Hyclone, каталожный номер SH30071.03) и 10 мл / л 45% раствора глюкозы (Sigma, каталожный номер G8769)) за один день до трансфекции.
2. В то время трансфекции, подготовить трансфекции комплексы следующим образом:
   1. Развести 8 мкг ДНК в 800 мкл питательной среде без сыворотки в стерильную пробирку микроцентрифужных. Осторожно перемешать.
   2. Развести 40 мкл Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) в 800 мкл питательной среде без сыворотки в полистирола трубки.
   3. Добавить разбавленный ДНК разбавленный ™ Lipofectamine. Тщательно перемешать и инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
3. Удалить питательную среду из клеток в T75 и заменить 6,4 мл ростовой среды без сыворотки. Добавить 1,6 мл трансфекции комплексов в колбу. Осторожно перемешать путем качания пластины.
4. Инкубируйте клетки при 37 ° C в CO ₂ инкубаторе в течение 6 часов.
5. Добавить 8 мл ростовой среды в колбу и инкубировать при температуре 37 ° C в CO ₂ инкубаторе на ночь.
6. Удалить среде стремление и добавлять свежую среду роста в колбу. Инкубируйте клетки при 37 ° C в CO ₂ инкубаторе на ночь.
7. Замените ростовую среду с выбором среды (МЕМА среды без нуклеотидов или нуклеозиды (Gibco, каталожный номер 12561) с добавлением 10% γ-облученных диализу эмбриональной телячьей сыворотки (DFB) (Hyclone, номер по каталогу SH30079.03) и 10 мл / л 45 % раствора глюкозы (Sigma, каталожный номер G8769)).
8. Инкубируйте клетки при 37 ° C в CO ₂ инкубаторе в течение 2-3 недель.

2. Клонирование с помощью проточной цитометрии Активированный сортировки сотовых

1. Выбить клеток из колбы и центрифуге при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4 ° C.
2. Ресуспендируют клеток в выборе среды с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина и флуоресцентно-меченные анти-человеческий IgG антител в 1:20 разбавления.
3. Инкубировать на льду в течение 15-30 минут и затем промыть в два раза с холодным PBS. Ресуспендируют клеток в 1x PBS в полипропиленовые трубы.
4. Подготовка к асептической сортировать по BD FACSAria ™. Подготовка 96-луночного планшета для культуры ячейку, содержащую 200 мкл среды отбора в каждую лунку.
5. Асептических условиях нагрузки трубки с клетками и анализировать на BD FACSAria ™, записывать результаты для окрашенных и неокрашенных клеток, соответственно.
6. Установить ворота и настройки для сортировки одной клетки нужный профиль окрашивания флуоресценции в 96-луночного планшета (ы).
   1. Трансфицированных клеток сначала анализируются на основе рассеяния вперед по сравнению стороне разброс. Ворота для живых клеток производится на основе рассеяния вперед, который измеряет размер ячейки, и боковые разброс, который измеряет сложность ячейки или детализации.
   2. Клетки, которые входят в эти ворота изучаются для окрашивания полиэтилена. PE отрицательный строб установлен для неокрашенных трансфекции клеток или окрашенных клеток хозяина. Как окрашенных трансфекции клетки рассматриваются СУИМ, "Высокие ЧП" Ворота затем очерчены, чтобы охватить топ 5% от всех клеток, которые являются положительными для окрашивания полиэтилена.
7. Инкубируйте плит в 37 ° C инкубатора в течение двух недель.

3. Документация по образованию колоний CloneSelect ™ Imager

Документ образование колоний в 96-луночных на CloneSelect Imager ™ в день 0, день 3, 7-й день и 13-й день после FACS сортировки. Изображение документации будет обеспечивать отбор клонов, полученных из одной ячейки. Важным шагом в этой документации становится фокальной плоскости установлены правильно в течение дня 0 измерений, так как есть только одна ячейка в каждую лунку в этой точке. Очень важно, что образы эти отдельные клетки находятся в фокусе и попытке настроить фокус на них может ввести в заблуждение в лучшем случае. Фокальной плоскости могут существенно различаться между марками пластин и, возможно, даже от партии к партии одного и того же бренда. Таким образом заранее определенной фокальной плоскости должна быть использована. Это может быть достигнуто путем сосредоточения внимания на тест микрошарики или высокой плотности клетки осаждается на пластинах из той же партии используется. Кроме того, взрослый плит из той же партии могут быть использованы для этой цели. После FACS сортировки, также важно, чтобы клетки согласиться на минимум за 2 часа до обработки изображений, так что они будут "фиксированных" в положении на тарелку.

4. Скрининг и отбор высокопродуктивных клонов

1. Документ положения образца в получении 96-луночных анализа.
2. Передача аликвоты 20 мкл надосадочной жидкости (разбавленные при необходимости) в 96-луночных анализа по Tecan Свобода EVO ® жидкостной системой управления. Этот гибкий и способный роботмикросхемы платформы была приспособлена для этого и других автоматизированных работу клеточной культуры. Специальные программы были написаны, чтобы оптимальным образом использовать и повышения Свобода EVO роботов возможности для развития клеток линии. Примером этого является установление Tecan интерпретировать CloneSelect ™ Imager данных для отбора проб скважин с одной колонии. Другие программы, необходимые для выполнения дополнительных задач, культуры клеток, что делает соответствующие разведения проб, интерпретировать, каталог и образцы вручную отмечены пластин при необходимости, для расширения высокопродуктивных клонов, и т.д. Многие из этих программ может быть легко применяется до 384 луночный, а также оригинальные 96-луночного формата.
3. Получение антител в пробах анализируется бутерброд человеческий IgG ELISA обнаружения (Pierce, Rockford, IL) на Tecan Свобода EVO ® жидкостной системой управления.
   1. Образцы и стандартные (Human миелома IgG1, каппа) (Sigma, Сент-Луис, Миссури) были погружены на предварительно покрытых Био Пальто античеловеческие IgG Пробирной Плиты (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).
   2. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение двух часов следуют три моет PBS.
   3. ImmunoPure козьего анти-человеческий IgG (Fc-гамма)-HRP (Pierce, Rockford, IL) был добавлен в пластине при разведении 1:2000 и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре.
   4. Пластины промывают три раза PBS перед добавлением ABTS подложки (Pierce, Rockford, IL) и читались на ридер использованием оптической плотности при 405 нм для обнаружения.
4. Выберите высокопроизводительные клоны и оценки производительности в суспензии культуры. Для кормили-периодической культуры, клетки были привиты на 0.3X106 клеток / мл в среде без белка JRH НЕМЕДЛЕННОГО ADVANTAGE 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) с добавлением 5 г / л соевого гидролизата (DMV International, каталожный номер SE50MAF-UF, много номер) и инкубировали при 37 ° C с 7,5% CO _2. Культуры продолжалось и были дополнены 2 г / л глюкозы (Sigma, каталожный номер G8769, номер партии 098K2329), когда глюкоза плюс концентрация лактата в культура достигла уровня ниже 2 г / л, и кормили 2 мМ глютамина (Gibco, каталожный номер 25030, номер партии 568 177), когда уровень глютамина достигла ниже 200 мг / л (метаболиты измеряются YSI Bioanalyzer). ФРС-партии культур были прекращены на 14 день и выработку антител была измерена с помощью обратного фазовой ВЭЖХ.
5. Генетическая характеристика кандидата клонов флуоресценции в гибридизация (FISH) ^5.

5. Представитель Результаты:

Примером развивающихся продуцирующих антитела клонов с высокой пропускной способ показан на рисунке 1 и рисунке 2. Трансфицированных бассейн ячейки окрашивали флуоресцентно-меченные анти-человеческий IgG антител (рис. 1А), анализируются и сортируются по BD FACSAria ™ (рис. 1В). Колония образование в 96-луночного планшета был отображается на CloneSelect Imager ™ (рис. 1в). Супернатант культуры клеток отбирали пробы из колодцев, которые содержат одну колонию и анализировали с помощью ИФА на Tecan Свобода EVO ® жидкостной системой обработки (рис. 1D). Высокопроизводительные клоны были найдены из клеток, которые выставлены более высокий уровень антител поверхности отражается окрашивания с люминесцентными меченых анти-человеческий IgG. При сравнении клонов генерируется из двух популяций начальной трансфицированных бассейн клетки, огромная разница в производительности в FED-периодической культуры не наблюдалось (рис. 2). Для первых двух клонов генерируется из клеточной популяции с высокой экспрессией антител поверхности (PE высокий), удельная производительность составляла от 50-70 пг / клетка / сут. В то время как антитела производительность составляла ~ 20 пг / клетка / сут в течение первых двух клонов генерируется из клеточной популяции с низкой экспрессией антител поверхности (PE низкий). Кроме того, клеточные линии, разработанной сортировкой FACS более устойчивы по отношению к выработку антител, чем те, которые были клонированы с помощью ручного разведения известкования (рис. 3А). Удельная производительность топ клон, "Клон 1", порожденных ручной разбавления известкования упала с ~ 30 PCD до ~ 10 PCD после культивирования в течение 80 удвоений клеток. С другой стороны, в верхней субклон порожденных FACS сортировка, "Клон 2", удалось сохранить удельную производительность около 20 PCD по меньшей мере 100 удвоений клеток. По флуоресцентные в гибридизация (FISH), мы показали клонов 1, показал, как смешанное население фенотипа (85%) и фенотипом B (15%). В отличие от этого, FACS отсортированы клон (клон 2) показал, чтобы быть более однородным населением, с 99,5% клеток оказалось фенотип (рис. 3В).

Рисунок 1. Развитие производства клеточных линий для производства моноклональных антител из клеток СНО. ) Поверхностные окрашивания начальной трансфицированных бассейн ячейки с флуоресцентно-меченные анти-человеческого антитела IgG. Б) Сортировка клеточной популяции с высокой интенсивности флуоресценции (PE высокая) и низкой интенсивности флуоресценции (PE низкий) в 96-луночного планшета. С) Документирование колонииобразование с первого дня от 0 до 13-й день после посева на CloneSelect Imager ™. D) Скрининг клонов методом ИФА.

Рисунок 2. Поверхность связанных антител коррелирует с уровнем антител продуктивность клеток. Клоны с высоким и низким флуоресцентного окрашивания оба были разработаны в клеточных линиях и оценивается в FED-периодической культуры. Объемный титр и удельную производительность сравнивались между верхней 2 клонов каждой популяции.

Рисунок 3. Клоны полученные от FACS сортировки выставку повышенной генетической однородности и клон стабильности. А) Получение антител стабильности в периодической культуры в течение ~ 80 удвоений ячейка культуры пройти время. Δ, клон был создан путем ограничения разбавления, где клетки были посеяны на 2000 клеток / лунку, 1000 клеток / лунку и 500 клеток / лунку. , Клон был создан путем FACS на 1 клетку / лунку. Б) Трансгенные интеграции сайта в хромосоме клетка СНО определяется Флуоресцентный в гибридизация.

Discussion

Мы представили автоматизированное производство клеточной линии платформу разработки, которая позволяет изоляции высокопродуктивных клонов, а в среднем в то время как обеспечивает клональности и клонировать стабильности. Взаимодействие поверхностных меченых антител следует FACSAria сортировки ячейки ™ является ключом к получению одного клонов с высокой производительностью антител. Наши результаты и другие отчеты ^2-4 показывают, что уровень антител временно отображаются на клеточной поверхности, хорошо коррелирует с производительностью клетки. Таким образом, флуоресцеин конъюгированных антител может быть использован для признать мембраны связанных продуктов и помощи изоляции высоким производителей. Кроме того, коэкспрессия репортер генов и технологии гель микрокапельной были использованы для облегчения выбора высокопродуктивных клонов FACS ^6-8. В дополнение к изоляции высокопродуктивных клонов через FACS, другие технологии развились до достижения той же цели. К ним относятся решетчатым Bioscience технологии CellSpot который использует microspere антител системы обнаружения и лазерных технологий скрининга для выявления высокопроизводительные клоны и устранения нежелательных клеток, Genetix ClonePix FL и StemCell Технологии ClonaCell EasyPick платформы, которые выполняют высокопроизводительного скрининга производства клеточных линий использованием флуоресцентных системы обнаружения антител . Мы выбрали для реализации FACS метод клонирования основаны на поверхности соответствующего уровня антител, поскольку она сочетает в себе простоту в эксплуатации, избирательность на производительность и клональности.

Занятости Tecan Свобода EVO ® жидкостной системой обработки значительно увеличили скрининга, которые дают возможность выбрать для высокого выхода из клонов намного больше клетка бассейн. Другие приборы для анализа, таких как HTRF, Bioforte Октет, ВЭЖХ, и т.д., все возможные средства выбора высокой производителей и отсеивание низкой производителей. Отслеживая клон образование с CloneSelect Imager ™, мы получили необходимую документацию, чтобы доказать клональности с оцифрованными истории клеточной линии. Клональности подтверждается еще и генетически характеризуют одного сайта интеграции трансгена на хромосоме. Субклонирования шаг, который, как правило, принимаются для обеспечения клональности, таким образом, может быть устранена. Это позволит сэкономить 4-8 недель времени для развития клеток линии. В целом, качество клеточных линий порожденные высокой пропускной автоматизированная платформа показали высокую производительность, стабильность производства и документально истории клеточной линии, которая должна удовлетворить спрос на крупном производстве и действующих нормативных требований.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACS Aria™ Cell Sorter	BD Biosciences
CloneSelect™ Imager	Genetix
TECAN Freedom EVO® liquid handling system	Tecan Group Ltd.