Summary
Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.
Abstract
Hızlı büyüyen biyofarmasötik endüstrisi, ilaç temini için artan ihtiyacı karşılamak için, yüksek verimli ve güvenilir üretim sistemlerinin hızlı gelişmesi talep eder. Nesil üretim hücre hatları geleneksel emek-yoğun, düşük verimlilik ve insan hataları açık manuel işlemleri yer vardır. Biz burada, protein terapötikler üretimi için üretim hücre hatlarının geliştirilmesi için entegre bir yüksek verimlilik ve otomatik bir platform raporu.
BD FACS Aria kombinasyonu ™ Hücre Sıralayıcısı CloneSelect ™ Imager ve Tecan Özgürlük EVO ® sıvı taşıma sistemi, yüksek verimlilik ve daha verimli bir hücre hattı geliştirme süreci sağladı. Bu operasyonda, üretim konak hücreleri ilk kez bir seçim aracı ile tedavi takip ilgi 1 gen taşıyan bir ifade vektör ile transfekte. Stably transfekte hücreler daha sonra floresan-etiketli anti-insan IgG ile boyanmış, ve flow sitometri analizi 2-4 sonradan tabidir. Son derece üretken hücrelerin floresan yoğunluğuna göre seçilir ve tek hücreli bir BD FACSAria ™ sıralayarak izole edilir. Tek hücre aşamasından Colony oluşumu mikroskopik olarak tespit edildi ve bir dizi zaman-tur dijital görüntüler, hücre hattı tarihinin belgelere CloneSelect ™ Imager ile alınır. Tek klonlar oluşturduktan sonra, bu klonları bir Tecan Özgürlük EVO yapılan ELISA ile verimlilik ® sıvı taşıma sistemi için tarandı. Yaklaşık 2,000 - 10,000 klonlar, mevcut sistem kurulumu ile çalışma döngüsü başına gösterildi.
Bu entegre yaklaşım, terapötik monoklonal antikor (mAb) yanı sıra füzyon proteini üretimi için yüksek üreten Çin hamsteri over (CHO) hücre hatları oluşturmak için kullanılır olmuştur. Tespit probları farklı türde yardımı ile diğer protein terapötikler geliştirilmesi için, yöntem ya da diğer üretim ana bilgisayar sistemleri uygulanabilir. Geleneksel el yordamı ile karşılaştırıldığında, bu otomatik bir platform önemli ölçüde kapasite artışı sağlanmıştır klonalite, elektronik dokümantasyon ile hücre hattı geçmişi izlenebilirlik ve operatör hatası çok azalır fırsat avantajları gösterdi.
Protocol
1. Host hücre transfeksiyon
- Tohum 2 x 10, 15 ml besi (nükleotidler ve nükleosidlerin MEMA (Gibco, katalog numarası 12.571),% 10 γ-ışınlanmış karakterize fetal sığır serumu (cFBS) (HyClone, ile desteklenmiş T75 Corning hücre kültürü şişesi 6 CHO- DXB11 hücreleri. katalog numarası SH30071.03) ve 10 mL / L% 45 glukoz solüsyonu (Sigma, katalog numarası G8769)) transfeksiyon bir gün önce.
- Transfeksiyon zaman, aşağıdaki gibi transfeksiyon kompleksleri hazırlayın:
- Steril bir mikrosantrifüj boru serum olmadan büyüme orta 800 ul 8 mg DNA sulandırınız. Yavaşça karıştırın.
- Polistiren tüp serum olmadan büyüme orta ul 800 40 ul Lipofectamine ™ (Invitrogan 18.324.012) sulandırınız.
- Seyreltilmiş Lipofectamine ™ seyreltilmiş DNA ekleyin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- T75 hücrelerin büyüme ortamı çıkarın ve büyüme ortamının 6.4 ml serum olmadan yerine. Balona transfeksiyon komplekslerinin 1.6 ml. Plaka sallanan hafifçe karıştırın.
- 6 saat 37 ° C az hücreleri CO 2 inkübatör inkübe edin.
- 37 şişeyi ve inkübe ° C gecede CO 2 inkübatör büyüme orta 8 ml.
- Aspirasyon orta çıkarın ve balona taze besi ekleyin. Bir gecede CO 2 inkübatör 37 ° hücreleri ° C'de inkübe edin.
- (MEMA orta nükleotidler veya nükleosidlerin olmadan (Gibco, katalog numarası 12561)% 10 γ-ışınlanmış diyaliz fetal sığır serumu (dFBS) (HyClone, katalog numarası SH30079.03) ve 10 mL / L 45 ile desteklenmiş, seçim ortamı ile besi değiştirin % glukoz solüsyonu (Sigma, katalog numarası G8769)).
- 2-3 hafta CO 2 inkübatör 37 ° hücreleri ° C'de inkübe edin.
2. Sitometrisi Aktive Hücre sıralama tarafından Klonlama
- 5 dakika boyunca 800 rpm'de santrifüj şişeyi ve hücreleri yerinden oynatın 4 ° C
- 01:20 seyreltme% 2 sığır serum albumin ve floresan etiketli anti-insan IgG ile desteklenmiş seçim ortamda hücrelerin tekrar
- 15-30 dakika buz üzerinde inkübe ve ardından soğuk PBS ile iki kez yıkayın. 1x PBS içinde bir polipropilen tüp hücreleri tekrar
- BD FACSAria ™ aseptik sıralama için hazırlayın. Her kuyuda 200 ul seçim ortamı içeren 96-iyi hücre kültürü plakası hazırlayın.
- Aseptik hücreleri ile tüp yük ve BD FACSAria ™ analiz, sırasıyla, lekeli ve lekesiz hücreler için sonuçları kaydedin.
- 96-plaka (ler) tek hücre içine istenen floresan boyama profil sıralamak için kapıları ve ayarları ayarlayın.
- Transfekte hücreler ilk forward scatter karşı tarafında dağılım dayalı analiz edilir. Canlı hücreler için bir kapı, bir hücrenin karmaşıklığı ya da ayrıntı ölçen bir hücre boyutu ve yan dağılım, ölçer forward scatter, göre yapılır.
- Bu kapıdan giren hücreler daha sonra PE boyama incelenir. PE negatif kapı lekesiz transfekte hücreler ya da lekeli konak hücreleri için ayarlanır. Lekeli transfekte hücreler FACS tarafından incelenir, "Yüksek PE" kapının ardından PE boyanma pozitif olan tüm hücreleri en üst% 5 kapsayacak şekilde tarif.
- Plakalar, iki hafta boyunca 37 ° C inkübatör inkübe edin.
3. CloneSelect ™ Imager koloni oluşumu Dokümantasyon
0. gün, 3. gün, sıralama FACS gün sonra 7 gün 13 CloneSelect Imager ™ 96-kuyucuğu Belge koloni oluşumu. Görüntü belgeleri tek bir hücreden elde edilen klonların seçimi sağlayacaktır. Bu noktada her bir kuyunun sadece bir hücre olmadığı için, bu belgede kritik bir adım, odak düzlemi gün 0 ölçümü için doğru ayarlanmış oluyor. Bu çok önemlidir, bu tek hücre görüntüler odak ve onlara odağı ayarlamak için çalışırken en iyi yanıltıcı olabilir. Odak düzlem plaka markalar arasında önemli farklılıklar ve hatta aynı marka çok çok. Böylece, önceden belirlenmiş bir odak düzlemli kullanılması gerekir. Bu test mikro-boncuk veya kullanılan aynı lottan plakalar üzerinde biriken yüksek yoğunluklu hücreleri odaklanarak yapılabilir. Alternatif olarak, aynı partinin tam olarak yetiştirilen plakaları bu amaç için kullanılıyor olabilir. FACS sıralama sonra, plaka pozisyon 'sabit' olacağını, bu yüzden hücrelerin görüntüleme için en az 2 saat önce razı izin vermek de önemlidir.
4. Tarama ve son derece üretken klonların seçimi
- Alıcı 96-iyi tahlil plakalar Belge örnek konumu.
- 20 ul Tecan Özgürlük EVO 96-iyi tahlil tabak içine supernatant (gerekirse sulandırmak) ® sıvı taşıma sistemi transferi alikotları. Bu esnek ve yetenekli robotic platformu Bu ve diğer otomatik hücre kültürü çalışmaları için adapte edilmiştir. En iyi şekilde yararlanmak ve hücre hattı gelişimi için Özgürlük EVO robotik yeteneklerini geliştirmek için özel programlar yazılmıştır. Buna bir örnek, tek koloniler kuyulardan numune almak için CloneSelect ™ Imager verileri yorumlamak için Tecan ayardır. Diğer programlar gibi ek hücre kültürü görevleri gerçekleştirmek için gerekli yüksek üreten klonlar büyütmek için, gerekirse uygun yorumlamak için alınan numunelerin dilüsyonları, katalog ve örnek manuel olarak işaretlenmiş plakaları, bu programların vb pek çok kolayca 384 tabak gibi orijinal 96 format uygulanır.
- Örneklerinde antikor üretimi Tecan Özgürlük EVO ELISA (Pierce, Rockford, IL) tespit sandviç insan IgG ® sıvı taşıma sistemi tarafından analiz edilir.
- Örnekler ve standart (İnsan miyelom IgG1, kappa) (Sigma, St Louis, MO) kaplı ön Bio Coat Anti-Human IgG Testi Plakalar (BD Biosciences, San Jose, CA) yüklendi.
- Plakalar üç PBS yıkar takiben iki saat oda sıcaklığında inkübe edildi.
- ImmunoPure Keçi Anti-Human IgG (Fc-gama)-HRP (Pierce, Rockford, IL) 1:2000 dilüsyon plaka eklenir ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edildi.
- Plakalar ABTS substrat (Pierce, Rockford, IL) eklemeden önce üç kez PBS ile yıkandı ve algılama için 405 nm'de absorbans kullanarak bir plaka okuyucu okundu.
- Son derece verimli klonlar seçin ve süspansiyon kültüründe verimlilik değerlendirmek. Beslenen-toplu kültür, hücreler 65.578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) 5 g / L, soya hidrolizat (DMV Uluslararası SE50MAF-UF katalog numarası, lot ile desteklenmiş protein ortamın JRH ani avantaj 0.3X106 hücre / mL ekildi sayısı) ve 37 inkübe ° C,% 7.5 CO 2 . Kültür devam etti ve 2 g / L glikoz (Sigma, katalog numarası G8769, lot numarası 098K2329) 2 g / L altında kültür glukoz artı laktat konsantrasyonu ulaştı ve beslenen 2 mM glutamin (Gibco, katalog numarası 25030 ile takviye edilen glutamin düzeylerinin 200 altında ulaştı lot numarası 568.177) mg / L (YSI Bioanalyzer ile ölçülen metabolitleri). Fed-toplu kültürler gün 14 ve antikor üretimini sona ters faz HPLC ile ölçüldü.
- Floresan in situ hibridizasyon (FISH) 5 aday klonlar Genetik karakterizasyonu.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Yüksek verim yöntemi ile klonları gelişen antikor üreten bir örnek Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Transfekte hücre havuzu, floresan etiketli anti-insan IgG (Şekil 1A) ile boyandı analiz ve BD FACSAria ™ (Şekil 1B) üzerinde sıralanır. 96-plaka Colony oluşumu CloneSelect Imager ™ (Şekil 1C) görüntülendi. Hücre kültürü süpernatant tek koloni içeren kuyu örneklenmiş ve Tecan Özgürlük EVO ® sıvı taşıma sistemi (Şekil 1D) ELISA yöntemi ile test edildi. Yüksek verimli klonlar floresan etiketli anti-insan IgG ile boyanarak yansıyan yüksek yüzey antikor düzeyi sergiledi hücrelerden bulundu. Ilk transfekte hücre havuzu iki nüfus, kültür (Şekil 2) gözlendi beslenen-toplu verimliliği büyük bir fark elde edilen klonlar kıyaslarken. Hücre popülasyonu yüksek yüzey antikoru (PE yüksek) ifadesi ile elde edilen en iyi iki klonlar için, özel verimlilik 50-70 arasında değişmektedir pg / hücre / gün. Antikor verimlilik iken ~ 20 pg / hücre / gün hücre popülasyonu düşük yüzey antikoru (PE düşük) ifadesi ile elde edilen en iyi iki klonlar. Ayrıca, FACS sıralama tarafından geliştirilen hücre hatları dışında manuel kireçleme seyreltme (Şekil 3A) aracılığıyla klonlanmış olduğunu antikor üretimi açısından daha istikrarlı. Üst klon özel verimlilik, manuel kireçleme seyreltme tarafından oluşturulan "Clone 1" ~ 30 ~ 10, 80 hücre çiftlenmeler kültür sonra pcd pcd düştü. Öte yandan, "Clone 2" sıralama FACS tarafından oluşturulan üst subclone, en az 100 hücre çiftlenmeler için 20 pcd etrafında belirli bir verimlilik koruyabilmiştir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH), Clone 1 fenotip oluşan karışık bir nüfus olarak göstermiştir (% 85) ve fenotip B (% 15). Gösterdi Buna karşılık, FACS (klon 2) klon sıralanmış olan hücrelerin% 99,5 ile daha homojen bir nüfus olduğunu gösterdi fenotip olarak kanıtlanmıştır (Şekil 3B).
Şekil 1 CHO hücreler monoklonal antikor üretimi için imalat hücre hatlarının geliştirilmesi. A) floresan etiketli anti-insan IgG ile ilk transfekte hücre havuzu Yüzey boyama. B) 96-kuyu plakasına yüksek floresan (PE Yüksek) ve düşük floresan (PE düşük) ile hücre popülasyonunun sıralama. C) koloni BelgelenmesiCloneSelect Imager ™ günden oluşumunu 0 günlük 13 Mesaj tohumlama. D) ELISA yöntemi ile Tarama klonlar.
Şekil 2. Yüzey ilişkili antikor düzeyi hücre antikor verimliliği ile ilişkilidir. Yüksek ve düşük floresan boyama Klonlar hücre hatları geliştirilen ve beslenen toplu kültür değerlendirildi. Volumetrik titresi ve özel verimlilik her nüfusunun üst 2 klonlar arasında karşılaştırıldı.
Şekil 3 daha yüksek genetik homojenlik ve klon kararlılık gösterirler sıralama FACS oluşturulur Klonlar. A) Antikor üretimi istikrar ~ 80 hücre çiftlenmeler kültür geçecek süre için toplu kültür. Δ, klon hücreleri, az 1000 / 2000 hücreleri hücre / kuyu ve 500 hücre / kuyu numaralı seribaşı sınırlayıcı seyreltme yoluyla oluşturulmuştur. 
, Klon 1 hücre / kuyu FACS aracılığıyla oluşturulmuştur. B) CHO hücre kromozom Transgen entegrasyon sitesini Floresan in situ hibridizasyon ile tanımlanır.
Discussion
Klonalite ve klon istikrarı sağlarken, son derece verimli klonlar izolasyonu sağlar ve ortalama bir otomatik üretim hücre hattı geliştirme platformu sundu. FACSAria ™ hücre sıralama takip yüzey antikoru boyanma nişan yüksek antikor verimlilik ile tek klonlar elde etmek için bir anahtardır. Sonuçları ve diğer raporlar 2-4 hücre yüzeyinde geçici olarak görüntülenen antikor düzeyi hücre verimlilik ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Böylece, floresein-konjuge antikor biyolojik membran ilişkili ürünü tanıması ve yüksek üreticilerin izolasyon yardım etmek için kullanılabilir. Alternatif olarak, FACS 6-8 muhabiri genler ve jel microdrop teknoloji Koekspresyon yüksek üreten klonların seçimi kolaylaştırmak için kullanılır olmuştur. FACS üzerinden yüksek üreten klonlar izole yanı sıra, diğer teknolojiler, aynı hedefe ulaşmak için evrildi. Bunlar, son derece verimli klonları tanımlamak ve, yüksek kapasiteli bir floresan antikor algılama sistemi kullanarak üretim hücre hatları tarama gerçekleştirmek Genetix ClonePix FL Teknolojileri ve StemCell ClonaCell EasyPick platformu istenmeyen hücrelerin ortadan kaldırmak için microspere antikor algılama sistemleri ve lazer tarama teknolojisi kullanır Kafes Bioscience CellSpot teknoloji . Biz, kullanım kolaylığı, verimliliği ve klonalite seçicilik birleştirir çünkü yüzey ilişkili antikor düzeyi dayalı FACS klonlama yöntemi uygulamak için seçti.
Istihdam Tecan Özgürlük EVO ® sıvı taşıma sistemi, yüksek verim klonlar için çok daha büyük bir hücre havuzu seçmek için fırsat sağlayan tarama hacmi, önemli ölçüde arttı. HTRF, BioForte Sekizli, HPLC, vb gibi tahlil için enstrümantasyon, yüksek üreticilerin seçilmesi ve düşük üreticileri tarama mümkün olan tüm yollarla. CloneSelect Imager ™ ile klon oluşumu takip ederek, sayısallaştırılmış hücre hattı geçmişi ile klonalite kanıtlamak için gerekli belgeleri oluşturulur. Klonalite genetik kromozom üzerinde tek transgen entegrasyon sitesi karakterize daha teyit edilir. Genellikle klonalite sağlamak için alınan bir subcloning adım, elenecektir. Bu hücre hattı gelişmesi için 4-8 hafta zaman kazandıracak. Özetle, yüksek verimli otomatik platform tarafından oluşturulan kalite hücre hatları, yüksek verimlilik, üretim istikrar ve büyük ölçekli üretim ve akım düzenleyici gereksinimleri için talebi karşılamak gerekir belgelenen hücre hattı geçmişi gösterdi.
Disclosures
Bu makalenin yazarları, memeli hücre hatları protein terapötikler büyük ölçekli üretim için bu yöntemi kullanan çalışanlar, Merck & Co, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Aria™ Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| CloneSelect™ Imager | Genetix | ||
| TECAN Freedom EVO® liquid handling system | Tecan Group Ltd. |
References
- Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization. Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).
- Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity. J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).
- Kromenaker, S. J., Srienc, F. Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study. Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).
- Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry. Cytometry. 11, 498-505 (1990).
- Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing. Cytomery. 43, 101-109 (2001).
- Meng, Y. G. Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells. Gene. 242, 201-207 (2000).
- DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen. Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).
- Weaver, J. C. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells. Nat. Med. 3, 583-585 (1997).
