Stimulation de tranches de cerveau utilisant un réseau microfluidique et de chambre de perfusion standard

Summary

Nous démontrons la fabrication d'un dispositif simple microfluidique qui peuvent être intégrés avec les configurations standard de l'électrophysiologie pour exposer les surfaces micro d'une tranche du cerveau d'une manière bien contrôlée pour différents neurotransmetteurs.

Abstract

Nous avons démontré la fabrication d'un dispositif à deux niveaux microfluidique qui peuvent être facilement intégrés avec les configurations existantes électrophysiologie. Le dispositif à deux niveaux microfluidique est fabriqué en utilisant une norme en deux étapes négative résister à ^une processus de lithographie. Le premier niveau contient des microcanaux avec des orifices d'entrée et de sortie à chaque extrémité. Le deuxième niveau contient micro trous circulaires situées à mi-chemin de la longueur de canal et centré le long avec une largeur de canal. Passif méthode de pompage est utilisée pour pomper des liquides à partir du port d'entrée au port de sortie ^2. Le dispositif microfluidique est intégré à off-the-shelf chambres de perfusion et permet une intégration transparente avec l'installation d'électrophysiologie. Les fluides introduits à l'entrée des ports le débit à travers les microcanaux vers les ports de sortie et aussi s'échapper à travers les ouvertures circulaires situées sur le dessus des microcanaux dans le bain de la perfusion. Ainsi, la surface inférieure de la tranche de cerveau placé dans le bain et la chambre de perfusion au-dessus du dispositif microfluidique peut être exposé à différents neurotransmetteurs. L'épaisseur microscopique du dispositif microfluidique et la nature des matériaux transparents [verre lamelle et PDMS (polydiméthylsiloxane)] utilisé pour rendre le dispositif microfluidique permet de microscopie de la tranche de cerveau. Le dispositif microfluidique permet une modulation (à la fois spatiale et temporelle) des stimuli chimiques introduits à l'microenvironnements tranche de cerveau.

Protocol

SU-8 de fabrication du moule

Préparation de Maître

1. Le maître SU-8 sur le substrat de plaquette de silicium est préparé en utilisant une norme en deux étapes de lithographie processus négatif résister.
2. Les marques d'alignement sur la plaquette de silicium sont enlevés à l'aide d'une lame de rasoir que la hauteur de ces structures (situé le long de la périphérie extérieure de la plaquette) est plus que les structures périphérique réel.
3. La plaquette de silicium est ensuite nettoyé à l'alcool isopropylique et séché dans un courant _de N2. Piliers de soutien faite de bandes d'une épaisseur inférieure à la plus haute structure dispositif de remplacer les marques d'alignement sur les quatre côtés de la plaquette.
   
   Remarque: Si la hauteur de l'appui des piliers est plus que les structures plus haut appareil, les trous à travers ne sont pas formées dans le moule PDMS.
   
   
4. La plaquette de silicium master est placé sur une plaque chauffante à la température ambiante.

Préparation de la solution PDMS

1. Quatre grammes de polydiméthylsiloxane (PDMS) solution est préparée en mélangeant soigneusement 10 parties d'élastomère de silicone avec 1 partie d'agent de durcissement.
   
   Remarque: Assurez-vous que les deux solutions sont mélangées uniformément pour obtenir des propriétés physiques similaires à travers le moule PDMS.
   
   
2. Les bulles générées dans la solution PDMS pendant le processus de mixage sont retirés en utilisant un dessiccateur à vide.

PDMS de revêtement et de séchage

1. La bulle sans solution de PDMS est lentement distribué sur le maître SU-8 en s'assurant que les bulles ne sont pas générées pendant le processus de distribution.
2. Une extrémité d'un film transparent en écriture est alors placé sur la sur la plaque chauffante et lentement placé sur la solution d'une répartition régulière PDMS PDMS sur le SU-8 maître. Toute bulles générées au cours de ce processus doivent être retirés à l'aide d'une sonde.
   
   [Note: Ne soulevez pas la transparence pour éviter la génération de plus de bulles.]
   
   
3. Une dalle Borofloat est placé en haut de la feuille de transparence pour appliquer une pression uniforme. Une légère pression est appliquée sur la surface supérieure de la plus haute des structures circulaires (situé à mi-chemin de la longueur de canal et centré le long de la largeur des canaux) telle qu'il ya peu ou pas de PDMS en sandwich entre la transparence et le SU-8 de surface de la circulaire structures.
4. Trois dalles Borofloat plus sont placés sur des plaquettes de silicium-Borofloat sandwichs dalle à appliquer une pression constante sur la surface supérieure de l'ouverture circulaire structures avant et pendant le processus de durcissement.
5. La température de la plaque chaude est ensuite augmentée à 75 ° C et le PDMS est guéri à cette température pendant 1 heure. La plaque chauffante est portée à une température de 50 ° C.
6. Les dalles sont enlevés et la transparence est doucement retiré laissant derrière le maître et la mince feuille PDMS enduit sur le dessus.

La construction du dispositif microfluidique

Retrait de feuille de PDMS de maître

1. La limite extérieure de la chambre de perfusion est taillé sur la feuille de PDMS en utilisant une lame de rasoir après alignement des ports de la chambre de perfusion avec les ports sur le SU-8 maître.
2. La feuille de PDMS est ensuite délicatement retiré du maître, tirant le long des canaux pour empêcher la déchirure de PDMS. La feuille de PDMS est placé sur une feuille de transparence avec la surface du réseau microfluidique vers le haut.
3. Les orifices d'entrée et de sortie sont alors fait à l'aide d'un perce-bouchon.

Collage de feuilles de verre PDMS à lamelle

1. La surface de collage de la feuille de PDMS (la surface contenant le réseau microfluidique) et une lamelle de verre sont ensuite délicatement nettoyé à l'aide d'un ruban de scotch 3M, placé sur une feuille de transparence, et finalement placé dans la chambre à plasma d'O _2.
2. Les surfaces de collage sont traités avec 165 Watts de plasma pendant 10 s. La surface traitée par un plasma de la lamelle de verre est immédiatement liée à la surface traitée par un plasma de la feuille de PDMS.
   
   Note: Appliquer une légère pression sur la surface du verre pour enlever les bulles d'air emprisonnées entre les surfaces de collage.
   
   
3. Laisser 5 minutes pour obtenir une bonne liaison entre le PDMS et le verre. Après 5 minutes retirez délicatement la transparence sur lequel la feuille PDMS a été placé pour le processus de collage.
4. Le dispositif microfluidique est placé dans le système de plasma d'oxygène pour faire les canaux hydrophiles. Le traitement plasma est fait à 165 Watts pendant 1 minute.

Intégration de dispositif microfluidique et de la chambre de perfusion

Préparation de la chambre de perfusion

1. Une chambre de perfusion off-the-shelf a été ordonnée, et les ports d'entrée et de sortie ont été forés afin que, lorsque le dispositif microfluidique et la chambre sont liés, les ports de la chambre et l'appareil sont alignés. La surface inférieure de la chambre de perfusion est enduit avec PDMS pour obtenir un joint étanche entre la chambre et le dispositif microfluidique.
2. Une écriture sur la feuille de transparence est placé sur une plaque chaude à la température ambiante.
3. Un gramme de PDMS solution est préparée dans un processus similaire à celui décrit précédemment. La bulle sans solution de PDMS est alors lentement distribué sur la génération de feuille de la transparence en évitant des bulles.
4. La chambre de perfusion est ensuite placé sur la solution de PDMS.
5. Une dalle Borofloat est ensuite placé sur le dessus de la chambre d'appliquer une pression uniforme et pour obtenir une fine couche de PDMS sur la surface inférieure de la chambre.
6. La température de la plaque chaude est ensuite augmentée à 75 ° C et le PDMS est guéri à cette température pendant 1 heure.

Collage de dispositif microfluidique et de la chambre de perfusion

1. La dalle est enlevée et la transparence est délicatement retiré laissant derrière la chambre de perfusion et de l'enduit mince feuille de PDMS sur sa surface inférieure. Indésirables PDMS est enlevé en utilisant une lame de rasoir et d'une sonde pointu pour l'enlèvement de PDMS à partir des ports d'accès.
2. La surface de PDMS du dispositif microfluidique et la surface inférieure de la chambre de PDMS sont ensuite délicatement nettoyé à l'aide d'un ruban 3M, placé sur une feuille de transparence, et finalement placé dans la chambre à plasma d'oxygène.
3. Les surfaces sont traitées avec 165 Watts de plasma pendant 10 s. Le PDMS surface revêtue de la chambre est immédiatement liée à la surface de PDMS du dispositif microfluidique.
   
   Note: Appliquer une légère pression sur la surface du verre pour enlever les bulles d'air emprisonnées entre les surfaces de collage.
   
   
4. Immédiatement avant l'utilisation, le dispositif est placé dans le système de plasma d'oxygène pour faire les canaux hydrophiles. Le traitement plasma est fait à 165 Watts pendant 1 minute.

Exposer des tranches de cerveau à l'aide de micro-environnement neurochimique du dispositif microfluidique

1. Les microcanaux hydrophile de la (dispositif microfluidique) - (chambre de perfusion) sont remplis avec la combinaison standard de l'ACSF (Artificial liquide céphalo-rachidien) solution.
2. Distribuer de petites gouttes de solution ACSF dans les ports d'entrée et de permettre à la solution d'être méchant jusqu'à dans les canaux. Retirer les bulles gauche à l'aide d'une seringue par l'orifice de sortie. Verser une grosse goutte de solution de l'ACSF au port de sortie pour permettre aux passifs de pompage de fluides à partir des ports d'entrée à la sortie du dispositif microfluidique.
   
   Remarque: Il faut prendre soin d'enlever toutes les bulles à partir des canaux pour permettre l'écoulement des fluides en utilisant la méthode passive de pompage.
   
   
3. Fixer le (dispositif microfluidique) - (chambre de perfusion) combo dans la plate-forme simple et fixer la plate-forme de plaine dans l'adaptateur de microscope.
4. Connectez l'entrée standard et sortie (d'aspiration) tuyau à la chambre de perfusion pour la perfusion continue de la tranche de cerveau à la norme ACSF solution. La solution est continuellement aspiré ACSF avec 95% d'O2-5% de CO _2.
   
   Note: Ajuster la position du tuyau d'aspiration pour maintenir un niveau constant de l'ACSF dans le bain de la chambre de perfusion.
   
   
5. Une fois la chambre de perfusion est rempli avec une solution ACSF, placer une tranche de cerveau dans la chambre de perfusion en utilisant un compte-gouttes. En utilisant une sonde, la position de la tranche au-dessus du cerveau, des ouvertures circulaires dans le dispositif microfluidique. Une fois la tranche de cerveau est à la position souhaitée sur les ouvertures circulaires, utilisez un point d'ancrage pour immobiliser le morceau de tranches de cerveau.
6. Le dispositif microfluidique peut maintenant être utilisé pour exposer les tranches de cerveau (placé dans la chambre de perfusion et sur le dessus du réseau microfluidique) de divers neurotransmetteurs à l'aide passive de pompage de fluides.

Discussion

Existants macroscopique ou microscopique chambres du cerveau tranche de perfusion sont limitées en termes de la résolution spatiale qu'ils fournissent pour exposer des tranches de cerveau avec des neurotransmetteurs. La technologie dispositif microfluidique démontré ici surmonte cette limitation en utilisant des techniques simples de bioMEMS. Il est prévu que la simplicité dans la fabrication du dispositif microfluidique et de la facilité de son intégration avec les configurations existantes électrophysiologie permettra l'application généralisée de la technologie du dispositif démontrée. Des expériences intéressantes qui n'étaient pas possibles auparavant peut être effectuée avec le dispositif actuel microfluidique. Différents microenvironnements de la tranche de cerveau peut être exposé à différents neurotransmetteurs à différentes échelles temporelles. Le prototype actuel ne comporte que quatre canaux parallèles et les ouvertures circulaires situé à côté de l'autre. Toutefois, cette disposition périphérique peut être facilement changée en mettant en œuvre différents modèles qui ont des ouvertures de différentes formes ou des tailles, ou les microcanaux peut être serpentait dans un mode qui conduirait à le positionnement des ouvertures dans différents microenvironnements des tranches de cerveau.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
RC-26GPL	Tool	Warner Instruments	W2-64-0236	Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber
SHD-26GH/10	Tool	Warner Instruments	W2-64-0253	Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing
PDMS (polydimethylsiloxane)	Reagent	Dow Corning	Sylgard 184	Silicone Elastomer Kit
Plasma Preen-II 862	Tool	Plasmatic Systems, Inc.		Microwave plasma system
Model P-1	Tool	Warner Instruments	W2-64-0277	Series 20 Plain Platform, Model P-1
SA-NIK	Tool	Warner Instruments	W2-64-0291	Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK
Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid)	Reagent			Exact composition will vary with application