Summary
Se demuestra la fabricación de un dispositivo de microfluidos sencillos que pueden ser integrados con el estándar de configuraciones de electrofisiología para exponer las superficies a microescala de un trozo del cerebro de una manera bien controlada para los diferentes neurotransmisores.
Abstract
Hemos demostrado la fabricación de un dispositivo de microfluidos de dos niveles que se pueden integrar fácilmente con las configuraciones existentes de electrofisiología. El dispositivo de microfluidos de dos niveles se fabrica utilizando un estándar de dos etapas negativas resistir un proceso de litografía. El primer nivel contiene microcanales con entrada y salida en cada extremo. El segundo nivel contiene micro orificios circulares situado a medio camino de la longitud del canal y centrado a lo largo con un ancho de canal. Método pasivo de bombeo se utiliza para bombear los líquidos desde el puerto de entrada al puerto de salida 2. El dispositivo de microfluidos está integrado en off-the-shelf cámaras de perfusión y permite una integración perfecta con la configuración de electrofisiología. Los líquidos introducidos en el flujo de entrada de los puertos a través de los microcanales hacia los puertos de salida y escapar a través de las aberturas circulares situados en la parte superior de los microcanales en el baño de la perfusión. Así, la superficie inferior de la parte del cerebro situado en el baño y la cámara de perfusión por encima del dispositivo de microfluidos pueden estar expuestos a diferentes neurotransmisores. El espesor de la microescala dispositivo de microfluidos y el carácter transparente de los materiales [de vidrio cubreobjetos y PDMS (polidimetilsiloxano)] Se utiliza para hacer que el dispositivo de microfluidos permiten microscopía de la rebanada del cerebro. El dispositivo de microfluidos permite la modulación (espacial y temporal) de los estímulos químicos introducidos en el microambiente cerebral rebanada.
Protocol
SU-8 de fabricación de moldes
Maestro de la preparación
- El maestro de SU-8 sobre un sustrato de obleas de silicio se prepara utilizando una de dos etapas estándar negativo resistir proceso de litografía.
- Las marcas de alineación de la oblea de silicio se eliminan utilizando una cuchilla de afeitar como la altura de estas estructuras (que se encuentra a lo largo de la periferia externa de la oblea) es más que la estructura real del dispositivo.
- La oblea de silicio se limpia con alcohol isopropílico y se secan en una corriente de N 2. Pilares de apoyo hechas de cintas con un espesor de menos de la estructura más alta de dispositivos reemplazan a las marcas de alineación en los cuatro lados de la oblea.
Nota: Si la altura del soporte de los pilares es más que la estructura más alta del dispositivo, los agujeros por los que no están formados en el molde de PDMS. - La oblea de silicio maestro se coloca en un plato caliente a la temperatura ambiente.
PDMS preparación de la solución
- Cuatro gramos de polidimetilsiloxano (PDMS) solución se prepara mediante la mezcla de 10 partes de elastómero de silicona con una parte del agente de curado.
Nota: Asegúrese de que las dos soluciones se mezclan de manera uniforme para obtener propiedades físicas similares en todo el molde de PDMS. - Las burbujas generadas en la solución de PDMS durante el proceso de mezcla se eliminan usando un secador de vacío.
PDMS recubrimiento y curado
- La burbuja de una solución libre de PDMS es lenta dispensada en el patrón de SU-8 de asegurarse de que las burbujas no se generan durante el proceso de dispensación.
- Uno de los extremos de una película de transparencia para escribir en ella se coloca en el plato caliente y poco a poco puestos en la solución de PDMS para repartir uniformemente el PDMS en el SU-8 maestro. Las burbujas generadas durante este proceso deben ser eliminadas mediante una sonda.
[Nota: No levante la transparencia para evitar la generación de más burbujas.] - Una losa Borofloat se coloca en la parte superior de la hoja de transparencia para aplicar una presión uniforme. Ejercer presión suave sobre la superficie superior de las estructuras más altas circular (que se encuentra a medio camino de las longitudes de canal y centrado a lo largo de la anchura de los canales) de tal manera que existe una mínima o PDMS no intercalado entre la transparencia y el SU-8 la superficie de la circular estructuras.
- Otros tres losas Borofloat se colocan en la parte superior de la oblea de silicio-Borofloat sándwich losa para aplicar una presión constante sobre la superficie superior de las estructuras de abertura circular antes y durante el proceso de curado.
- La temperatura de la placa caliente se incrementó a 75 ° C y el PDMS se cura a esta temperatura durante 1 hora. La placa caliente es llevado a una temperatura de 50 ° C.
- Las placas se retiran y la transparencia se quita suavemente dejando atrás el maestro y la delgada hoja de PDMS recubierto en la parte superior de la misma.
Construcción del dispositivo de microfluidos
La eliminación de la hoja de PDMS de maestro
- El límite exterior de la cámara de perfusión está tallada en la hoja de PDMS con una cuchilla de afeitar después de alinear los puertos de la cámara de perfusión con los puertos en el SU-8 maestro.
- La hoja de PDMS es suavemente eliminado de la maestra, tirando a lo largo de los canales para evitar la ruptura de PDMS. La hoja de PDMS se coloca sobre una hoja de transparencia con la superficie de la red de microfluidos hacia arriba.
- Los puertos de entrada y salida entonces se hacen mediante una sonda.
Unión de la hoja de vidrio cubreobjetos PDMS
- La superficie de unión de la hoja de PDMS (la superficie que contiene la red de microfluidos) y un cubreobjetos son suavemente limpiar con una cinta adhesiva 3M, colocado sobre una hoja de transparencia, y por último, ponerlas en la cámara de O 2 en plasma.
- Las superficies a unir se tratan con plasma 165 vatios durante 10 s. La superficie de plasma tratado del cubreobjetos está inmediatamente unido a la superficie tratado con plasma de la hoja de PDMS.
Nota: Aplique una presión suave sobre la superficie del vidrio para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada entre las superficies a unir. - Deje pasar 5 minutos para obtener una buena unión entre el PDMS y vidrio. Después de 5 minutos retire con cuidado la transparencia en la que se coloca la hoja de PDMS para el proceso de unión.
- El dispositivo de microfluidos se coloca en el sistema de plasma de oxígeno para que los canales hidrofílicos. El tratamiento de plasma se realiza a 165 vatios durante 1 minuto.
Integración de dispositivos de microfluídica y cámara de perfusión
Preparación de la cámara de perfusión
- Una cámara de perfusión fuera de la plataforma se le ordenó, y los puertos de entrada y salida fueron perforados para que cuando el dispositivo de microfluidos y la cámara están en condiciones de servidumbre, los puertos de la cámara y el dispositivo estén alineados. La superficie inferior de la cámara de perfusión está recubierta con PDMS para obtener un sello hermético entre la cámara y el dispositivo de microfluidos.
- Una escritura en la hoja de transparencia se coloca en un plato caliente a la temperatura ambiente.
- Un gramo PDMS solución se prepara en un proceso similar al descrito anteriormente. La burbuja de una solución libre de PDMS es lentamente dispensado sobre la generación de hoja de transparencia para evitar las burbujas.
- La cámara de perfusión se coloca en la solución de PDMS.
- Una losa Borofloat se coloca en la parte superior de la cámara para aplicar una presión uniforme y para obtener una fina capa de PDMS sobre la superficie inferior de la cámara.
- La temperatura de la placa caliente se incrementó a 75 ° C y el PDMS se cura a esta temperatura durante 1 hora.
Unión de dispositivo de microfluidos y cámara de perfusión
- La losa está eliminado y la transparencia se quita suavemente dejando tras de sí la cámara de perfusión y la delgada hoja de recubrimiento PDMS en su superficie inferior. No deseados PDMS se elimina mediante una cuchilla de afeitar y una sonda de punta afilada para la eliminación de PDMS de puertos de acceso.
- La superficie de PDMS del dispositivo de microfluidos y la superficie inferior de la cámara de PDMS se limpian suavemente con una cinta 3M, colocado sobre una hoja de transparencia, y por último, ponerlas en la cámara de plasma de oxígeno.
- Las superficies se tratan con plasma 165 vatios durante 10 s. La superficie recubierta PDMS de la cámara inmediatamente se adhiere a la superficie PDMS del dispositivo de microfluidos.
Nota: Aplique una presión suave sobre la superficie del vidrio para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada entre las superficies a unir. - Inmediatamente antes del uso, el dispositivo se coloca en el sistema de plasma de oxígeno para que los canales hidrofílicos. El tratamiento de plasma se realiza a 165 vatios durante 1 minuto.
La exposición de las secciones de cerebro de microambiente neuroquímicos utilizando el dispositivo de microfluidos
- Los microcanales hidrofílicos de la (dispositivo de microfluidos) - (cámara de perfusión) combinación se rellenan con el estándar de ACSF (artificial líquido cefalorraquídeo) solución.
- Prescindir de pequeñas gotas de la solución de ACSF en los puertos de entrada y permitir que la solución sea malo hasta en los canales. Eliminar las burbujas de la izquierda con una jeringa en el puerto de salida. Prescindir de una gran gota de solución de ACSF en el puerto de salida para permitir pasiva de bombeo de líquidos desde la entrada a los puertos de salida del dispositivo de microfluidos.
Nota: Se debe tener cuidado de eliminar todas las burbujas de los canales para permitir el flujo de fluidos usando el método pasivo de bombeo. - Fijar el (dispositivo de microfluidos) - (cámara de perfusión) combo en la plataforma simple y fijar la plataforma normal en el adaptador de microscopio.
- Conecte la entrada estándar y la salida (succión) tubo a la cámara de perfusión para la perfusión continua de los cortes de cerebro con el estándar de solución de ACSF. La solución ACSF continuamente aspirado, con un 95% de O2, CO2 al 5%.
Nota: Ajuste la posición del tubo de succión para mantener un nivel constante de ACSF en el baño de la cámara de perfusión. - Una vez que la cámara de perfusión se llena con una solución de ACSF, coloque una rebanada del cerebro en la cámara de perfusión con un gotero. Mediante una sonda, la posición de la parte del cerebro por encima de las aberturas circulares en el dispositivo de microfluidos. Una vez que la parte del cerebro está en la posición deseada sobre las aberturas circulares, use un trozo de anclaje para inmovilizar la parte del cerebro.
- El dispositivo de microfluidos ahora se puede utilizar para exponer las rodajas de cerebro (que se encuentra en la cámara de perfusión y en la parte superior de la red de microfluidos) de varios neurotransmisores con pasivos de bombeo de líquidos.
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Discussion
Existentes macroescala o micro cámaras de perfusión cerebral rebanada son limitados en términos de la resolución espacial que ofrecen a exponer las secciones de cerebro de neurotransmisores. La tecnología de los dispositivos de microfluidos demostrado aquí supera esta limitación utilizando técnicas bioMEMS simple. Se prevé que la simplicidad en la fabricación del dispositivo de microfluidos y la facilidad de integración con las configuraciones existentes de electrofisiología permite la aplicación generalizada de la tecnología de los dispositivos demostrado. Experiencias interesantes que no eran posibles antes se puede realizar con el dispositivo de microfluidos actual. Distintos microambientes de la rebanada del cerebro pueden estar expuestos a diferentes neurotransmisores en diferentes escalas de tiempo. El prototipo actual está formado por cuatro canales paralelos y aberturas circulares situados uno junto al otro. Sin embargo, esta distribución de dispositivos se puede cambiar fácilmente mediante la aplicación de diferentes diseños que tienen aberturas de diferentes formas o tamaños, o los microcanales podría meandros de una manera que conduzca a la colocación de las aberturas de microambientes diferentes secciones de cerebro.
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Disclosures
Los autores están abiertos a colaboraciones involucran la tecnología de microfluidos demostrado en diferentes campos de la biología.
Acknowledgments
El financiamiento fue proporcionado por el NIH MH-64611 y el Premio Joven Investigador NARSAD. Los autores también desean agradecer a Adán Beagley, Dikopf Marcos, y Ben Smith por su asistencia técnica.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
