Estimulação cerebral Slice Usando uma Rede microfluídicos e da Câmara de Perfusão padrão

Summary

Nós demonstramos a fabricação de um dispositivo simples microfluídicos que podem ser integrados com configurações padrão eletrofisiologia para expor superfícies microescala de uma fatia do cérebro de uma maneira bem controlada para diferentes neurotransmissores.

Abstract

Nós demonstramos a fabricação de um dispositivo de dois níveis microfluídicos que pode ser facilmente integrado com instalações existentes eletrofisiologia. O dispositivo de dois níveis de microfluídica é fabricado usando um padrão de duas etapas negativas resistir ^um processo de litografia. O primeiro nível contém microcanais com admissão e de escape em cada extremidade. O segundo nível contém micro furos circular localizado a meio caminho do comprimento do canal e centrado, juntamente com a largura do canal. Método de bombeamento passivo é usado para bombear fluidos da porta de entrada para a porta de saída ^2. O dispositivo micro é integrada com off-the-shelf câmaras de perfusão e permite uma integração perfeita com a configuração de eletrofisiologia. Os fluidos introduzido no fluxo de portas de entrada através dos microcanais para os portos de saída e também fugir através das aberturas circular localizado na parte superior dos microcanais para o banho da perfusão. Assim, a superfície inferior da fatia do cérebro colocado no banho de câmara de perfusão e acima do dispositivo micro podem ser expostos com diferentes neurotransmissores. A espessura microescala do dispositivo micro ea transparência dos materiais [lamela de vidro e PDMS (polidimetilsiloxano)] usado para fazer o dispositivo micro permitir microscopia da fatia do cérebro. O dispositivo micro permite a modulação (espacial e temporal) dos estímulos químicos introduzidos no microambientes fatia do cérebro.

Protocol

SU-8 de fabricação de moldes

Preparação mestre

1. O mestre SU-8 em silício substrato wafer é preparado usando um dois-passo processo de litografia padrão negativo resistir.
2. As marcas de alinhamento no wafer de silício são removidas utilizando uma lâmina de barbear como a altura destas estruturas (localizado ao longo da periferia do wafer) é mais do que as estruturas dispositivo real.
3. O wafer de silício é então limpo usando álcool isopropílico e seca em um fluxo de N _2. Pilares de sustentação feita de fita com espessura menor do que a mais alta estrutura do dispositivo substituir as marcas de alinhamento em quatro lados da bolacha.
   
   Nota: Se o apoio de altura pilares é mais do que as estruturas mais altas do dispositivo, os buracos não são formadas através no molde PDMS.
   
   
4. O wafer de silício mestre é colocado em uma placa quente à temperatura ambiente.

PDMS preparação da solução

1. Quatro gramas de polidimetilsiloxano solução (PDMS) é preparado através de uma profunda mistura de 10 partes de elastômero de silicone com 1 parte de agente de cura.
   
   Nota: Certifique-se que as duas soluções são misturadas uniformemente para obter propriedades físicas semelhantes em todo o molde PDMS.
   
   
2. As bolhas geradas na solução PDMS durante o processo de mistura são removidas usando um exsicador de vácuo.

PDMS revestimento e cura

1. A bolha sem solução PDMS é lentamente dispensada na mestre SU-8 certificando-se que as bolhas não são gerados durante o processo de distribuição.
2. Uma extremidade de um filme de transparência escrever-on é então colocado sobre a chapa quente e, lentamente, colocado na solução PDMS para espalhar uniformemente o PDMS para o mestre-8 SU. As bolhas geradas durante esse processo precisa ser removido através de uma sonda.
   
   [Nota: Não levante a transparência para evitar a geração de bolhas mais.]
   
   
3. Uma laje Borofloat é colocado em cima da folha de transparência para aplicar pressão uniforme. Uma leve pressão é aplicada sobre a superfície superior das mais altas estruturas circulares (localizado a meio caminho dos comprimentos de canal e centrada ao longo da largura dos canais) de tal forma que há pouca ou nenhuma PDMS imprensado entre a transparência ea superfície SU-8 da circular estruturas.
4. Três lajes mais Borofloat são colocados em cima do sanduíche de silício wafer Borofloat-laje para aplicar pressão constante sobre a superfície superior das estruturas abertura circular antes e durante o processo de cura.
5. A temperatura da placa quente é então aumentada para 75 ° C ea PDMS é curado a esta temperatura por 1 hora. A placa quente é levado a uma temperatura de 50 ° C.
6. As lajes são removidos ea transparência é suavemente retirada deixando para trás o mestre ea folha de PDMS fina revestido em cima dela.

Construção do dispositivo micro

Remoção da folha de PDMS de mestre

1. O limite exterior da câmara de perfusão é esculpido na folha de PDMS utilizando uma lâmina de barbear após o alinhamento dos portos na câmara de perfusão com as portas do SU-8 master.
2. A folha de PDMS é então delicadamente removidos do mestre, puxando ao longo do comprimento dos canais para evitar rompimento do PDMS. A folha de PDMS é colocado sobre uma folha de transparência com a superfície da rede microfluídicos para cima.
3. As portas de entrada e saída são, então, feito com uma sonda.

Colagem de folhas de vidro para PDMS lamela

1. A superfície de colagem da folha de PDMS (a superfície contendo a rede microfluídicos) e uma lamela de vidro são, então, suavemente limpo com uma fita adesiva 3M, colocado sobre uma folha de transparência, e, finalmente, colocado na câmara O plasma _2.
2. As superfícies de ligação são tratados com 165 Watts de plasma de 10 s. A superfície tratada plasma da lamela de vidro é imediatamente colado à superfície tratada plasma da folha de PDMS.
   
   Nota: Aplique uma leve pressão na superfície do vidro para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas entre as superfícies de ligação.
   
   
3. Permitir 5 minutos para obter uma boa ligação entre o PDMS e vidro. Após 5 minutos retire cuidadosamente a transparência em que a folha de PDMS foi colocado para o processo de colagem.
4. O dispositivo micro é colocado no sistema de plasma de oxigênio para fazer os canais hidrofílicos. O tratamento de plasma é feito em 165 Watts por 1 minuto.

Integração do dispositivo micro e câmara de perfusão

Preparação da câmara de perfusão

1. Uma câmara de perfusão off-the-shelf foi ordenado, e as portas de entrada e saída foram perfurados de modo que quando o dispositivo micro ea câmara estão ligados, as portas da câmara e do dispositivo estão alinhados. A superfície inferior da câmara de perfusão é revestido com PDMS para obter uma boa vedação entre a câmara eo dispositivo micro.
2. A gravação na folha de transparência é colocada sobre uma placa quente à temperatura ambiente.
3. Um grama PDMS solução é preparada em um processo semelhante ao descrito anteriormente. A bolha sem solução PDMS é depois, lentamente, dispensada na geração de folha de transparência evitando bolhas.
4. A câmara de perfusão é então colocado sobre a solução PDMS.
5. Uma laje Borofloat é então colocada em cima da câmara para aplicar pressão uniforme e para obter uma fina camada de PDMS na superfície inferior da câmara.
6. A temperatura da placa quente é então aumentada para 75 ° C ea PDMS é curado a esta temperatura por 1 hora.

Colagem de dispositivo micro e câmara de perfusão

1. A laje é removido ea transparência é suavemente retirada deixando para trás a câmara de perfusão e revestido folha fina PDMS em sua superfície inferior. PDMS indesejada é removida com uma lâmina de barbear e uma sonda de ponta afiada para PDMS remoção das portas de acesso.
2. A superfície de PDMS do dispositivo micro e PDMS na superfície inferior da câmara são, então, suavemente limpo com uma fita da 3M, colocado sobre uma folha de transparência, e, finalmente, colocado na câmara de plasma de oxigênio.
3. As superfícies são tratadas com 165 Watts de plasma de 10 s. A superfície de PDMS revestido da câmara é imediatamente colado à superfície do PDMS dispositivo micro.
   
   Nota: Aplique uma leve pressão na superfície do vidro para remover quaisquer bolhas de ar aprisionadas entre as superfícies de ligação.
   
   
4. Imediatamente antes do uso, o dispositivo é colocado no sistema de plasma de oxigênio para fazer os canais hidrofílicos. O tratamento de plasma é feito em 165 Watts por 1 minuto.

Expondo fatias do cérebro para microambiente neuroquímicos usando o dispositivo micro

1. Os microcanais hidrofílica do (dispositivo micro) - (câmara de perfusão) combinação são preenchidos com padrão ACSF (Fluid Cerebral Artificial Spinal) solução.
2. Dispense pequenas gotas de solução ACSF nos portos de entrada e deixe a solução a ser perverso até para os canais. Remover quaisquer bolhas de esquerda usando uma seringa da porta de saída. Dispense uma grande queda de solução ACSF na porta de saída para permitir passiva bombeamento de fluidos entre a entrada para as portas de saída do dispositivo micro.
   
   Nota: Cuidados devem ser tomados para remover todas as bolhas dos canais para permitir o fluxo de fluidos e utilizando o método de bombeamento passivo.
   
   
3. Corrigir o (dispositivo micro) - (câmara de perfusão) de combinação na plataforma simples e corrigir a plataforma comum na placa do microscópio.
4. Conecte a entrada padrão e saída (sucção) tubos para a câmara de perfusão para a perfusão contínua da fatia do cérebro com solução padrão ACSF. A solução é continuamente aspirado ACSF com 95% de O2-5% CO _2.
   
   Nota: Ajuste a posição da tubulação de sucção para manter o nível constante de ACSF no banho da câmara de perfusão.
   
   
5. Uma vez que a câmara de perfusão é preenchido com solução ACSF, coloque uma fatia do cérebro na câmara de perfusão com um conta-gotas. Usando uma sonda, posição a fatia do cérebro acima das aberturas circulares no dispositivo micro. Uma vez que a fatia do cérebro é na posição desejada sobre as aberturas circulares, use uma âncora para imobilizar fatia a fatia do cérebro.
6. O dispositivo microfluídicos agora pode ser usada para expor as fatias de cérebro (colocado na câmara de perfusão e em cima da rede microfluídicos) para vários neurotransmissores usando passiva bombeamento de líquidos.

Discussion

Macroescala existentes ou micro câmaras de perfusão cerebral fatia são limitados em termos da resolução espacial que eles fornecem para expor fatias de cérebro com neurotransmissores. A tecnologia de dispositivos microfluídicos demonstrado aqui supera esta limitação utilizando técnicas simples bioMEMS. Prevê-se que a simplicidade na fabricação do dispositivo micro ea facilidade de integração com as configurações existentes eletrofisiologia permitirá a aplicação generalizada da tecnologia de dispositivos demonstrados. Experiências interessantes que não eram possíveis anteriormente pode ser realizada com o dispositivo atual microfluídicos. Microambientes diferentes da fatia do cérebro podem ser expostos a diferentes neurotransmissores em diferentes escalas de tempo. O dispositivo protótipo atual é composto por apenas quatro canais paralelos e as aberturas circular localizado ao lado do outro. No entanto, este layout do dispositivo pode ser facilmente alterada através da implementação de projetos diferentes que têm aberturas de diferentes formas ou tamanhos, ou os microcanais podem ser meandered de uma forma que levaria para o posicionamento das aberturas em diferentes microambientes de fatias de cérebro.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
RC-26GPL	Tool	Warner Instruments	W2-64-0236	Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber
SHD-26GH/10	Tool	Warner Instruments	W2-64-0253	Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing
PDMS (polydimethylsiloxane)	Reagent	Dow Corning	Sylgard 184	Silicone Elastomer Kit
Plasma Preen-II 862	Tool	Plasmatic Systems, Inc.		Microwave plasma system
Model P-1	Tool	Warner Instruments	W2-64-0277	Series 20 Plain Platform, Model P-1
SA-NIK	Tool	Warner Instruments	W2-64-0291	Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK
Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid)	Reagent			Exact composition will vary with application