Summary
Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.
Abstract
Gelişmekte olan beyin, sinyal molekülleri ve akson rehberlik molekülleri, yerel gen transferi veya knock-out gereklidir dahil olmak üzere belirli bir bölgedeki genlerin işlevini anlamak için. Knock-knock-out hedefleme Gen yerel bölgeye belirli bir zahmetli, masraflı CRE hattı, ve zaman alıcı bir kombinasyonu ile gerçekleştirmek mümkün. Bu nedenle, basit bir transfeksiyon yöntemi, kısa sürede yapılabilir bir utero elektroporasyon tekniği, transgenik hayvanlar 1,2 nesil öncesinde aday genlerin olası fonksiyon testi için kullanışlı olacaktır. Buna ek olarak, in utero elektroporasyon, belirli bir CRE hattı var olan beyin alanları hedef ve embriyonik öldürücülüğü 3,4 sınırlayacaktır . Burada, biz, basit ve kullanışlı bir gen transferi için iki farklı tür elektrotlar birleştirerek gelişmekte olan beyin hedef alanlara utero elektroporasyon bir yöntem mevcut. İlk olarak, benzersiz bir optik fiber optik ışık kablosu kullanarak bir embriyo tutma yöntemi ventriküller ve hedeflenen beyin alanı 5,6 iğne tipi elektrodlar ekleme içine hedeflenen DNA çözüm enjeksiyon için görünür küçük embriyolar (E9.5) yapacaktır . Bu nedenle, kortikal alanı gibi beyin desenlendirme E9.5 bu erken elektroporasyon tüm alanı desenlendirme olayı anlamak için büyük bir katkı yapmak, erken embriyonik aşamada meydana gelir. İkincisi, bir kılcal kesin şeklini kılcal ekleme delik yaparak rahim zarar görmesini engeller. Ayrıca, iğne elektrotlar kesin şeklini tungsten ve platin tel ile oluşturulan ve zımpara kağıdı kullanarak bilenmiş ve tırnak cilası 7, bu protokol çok detaylı olarak açıklanan bir yöntem ile izole edilir. Bu benzersiz tekniği, beynin sınırlı alanlar içine plazmid DNA transfeksiyon sağlar ve küçük embriyolar electroporated olmasını sağlayacak. Bu, çok erken embriyonik aşamada hücre farklılaşması, hücre göçü, akson rehberliği üzerinde çalışıyoruz birçok bilim adamları için yeni bir pencere açmak için yardımcı olacaktır. Ayrıca, bu teknik, bilim adamları, birçok bölgeye özel CRE hatları fonksiyon kazanç (GOF) veya fonksiyon (LOF) analizleri kaybı var talamus ve hipotalamus, beyin gibi gelişmekte olan derin bölüme plazmid DNA transfect sağlayacaktır.
Protocol
1. Kapiller ve DNA çözüm enjeksiyon için hazırlanması
- Maxi-Hazırlık veya dengi yöntemi plazmid DNA arındırın ve 2-3 mg / ml bir final konsantrasyon. Kısım 100 mikrogram, DNA hızlı yeşil boya (% 1 hisse senedi) ve TE 10μl (10mM Tris Üssü, 1mm EDTA Çözüm, pH 8.0) ve enjeksiyon karışımı için son DNA konsantrasyonu 1μg / ul 100 ses seviyesini ayarlamak ul. Plazmid DNA konsantrasyonu değiştirilebilir tek tek test edilmesi gerekir transfeksiyon verimliliği, plazmid boyutu bağlıdır ve.
- 14.000 RPM hızında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA çözüm Spin ve herhangi bir kalıntı kaldırmak için supernatant toplamak.
- Mikropipet çektirmenin kullanarak bir cam kapiller tubea cam kapiller tüplerin çekin. Ucu 20-30 mikron çapında yapmak için forseps ile ucu kapalı Pinch. Ucundan 800 mm-1 mm ölçün ve dış çapı 60 mikron (Şekil 1A) daha az olup olmadığını kontrol edin.
- Mikromanipülatör kılcal bağlayın ve madeni yağ ile doldurun. DNA çözüm, çözüm içine daldırın ucu kapiller doldurmak ve DNA çözüm emmek için.
2. Platin elektrot Kaynaş
Burada beyin korteks (Şekil 1F) gibi yüzeysel bölge içine electroporate sopa platin elektrotlar (Nepe gen, CUY611P2-1) kullanılır.
3. Mikro elektrotlar hazırlanması
Beyin (yani, talamus ve hipotalamus) (Şekil 2B-E) derin bölüme electroporated için mikro elektrotlar kullanın.
- Bir tungsten sonunda (negatif elektrot) ve platin (pozitif elektrot) teller, altın kaplama pinler sarılmış ve parafilm ile sabittir. Bir pamuklu çubukla kök tel takın ve parafilm (Şekil 1B) ile her iki ucunda sarın.
- 20-30 mikron 800 dış çapı 60 mikron mikron 1 mm ucu (Şekil 1C ve D) ulaşıncaya kadar eşit bir şekilde zımpara kağıdı ile telin ucu keskinleştirmek.
- Yalıtımı için tel oje ince bir kat uygulayın. Oje kuruduktan sonra, ucu (uç kısmından yaklaşık 200 mikron) çıkarmak için aseton batırılmış bir pamuklu bir bez kullanın. Önemli not: farenin rahmine zarar görmesini önlemek için, 800 içinde kısmı mm-1 mm uç çapı 70 mm daha fazla (Şekil 1E) olmalıdır.
4. Ameliyat hazırlanması
- Hamile bir fare (E9.5-E15.5) anestezisi. Biz ilaç sınıf sodyum pentobarbital anesthetization göstermektedir (Tablo II; gram vücut ağırlığı başına 50 mikrogram, intraperitoneal olarak enjekte edilir ve 5 dakika bekleyin). Bir anestezik olarak pentobarbital sodyum Alternatifler Ketamin / Xylazine enjeksiyon veya gaz anestezikler (gaz kısa süreli işlemleri için tercih edilir). Enjeksiyon herhangi bir organ önlemek için dikkat ile yapılmalıdır, aksi takdirde rahmin zarar veya hayvanı öldürmek için neden olacaktır. Başarılı IP yapıldığında, hayatta kalma oranı% 95 daha fazla. Ayrıca cerrahi, açık hava ortamında yapılabilmektedir. Önce anestezik onaylamak için parmak pinching hayvan tarafından tepki olmaması için çalışma, test başladı.
- Bir jilet ve% 50 EtOH kullanarak karın saç tıraş. Alternatif scrubs betadin ve alkol (% 70) ile cildi hazırlayın.
- Ince makas ile karın orta hat kesi olun ve tüm rahim boynuzları 37 üzerine dikkatlice dışarı çekin ° C önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) nemlendirilmiş pamuk gazlı bez, yara etrafına yerleştirilir. PBS zaman rahim nemli tutun.
- Parmağı ve orta parmak arasında esnek bir fiber optik kablo tutun ve uterin boynuz altına koyun. Kullanmadan önce% 70 EtOH ile temizleyin kablo. Hiçbir mikroskop ya da büyüteç görünüm için gereklidir. Pozisyon fiber optik ışık optik kablo ve başparmak arasında rahim ve rahim duvarına yakın embriyo yukarı itmek için yavaşça sıkın.
5. DNA ve elektroporasyon Enjeksiyon
- Embriyo yerleştirilmiş, cam hedef ventrikül içine dikkatlice kılcal ve yaklaşık 1 ul DNA çözüm (Şekil 2A) enjekte yerleştirin.
- Electoporation için sopa platin elektrotları ile brainIf yüzeysel bir parçası elektroporasyon için rahim dışında elektrotlar ve üreticinin talimatlarına göre (Tablo I) önerilen kare dalga akım darbeleri uygulayın. Beynin derin kısmında usingFor elektroporasyon, nmicro elektroporasyon, eedle tipi elektrotlar iseniz. Iinsert DNA'sına ince bir tungsten negatif elektrot önerilen kare dalga akım darbeleri (Tablo I) (Şekil 2B) uygulamak sonra, iki elektrot arasındaki yeri ve hedef bölge rahim içine enjekte ventrikül ve platin elektrot.
6. Mesaj elektroporasyon
- Onun orig uterin horn yerine geriİnal konumu ve 37 ° C önceden ısıtılmış PBS 500 mcL ekleyin.
- 9 mm autoclipauto klip ile cerrahi dikiş ve yakın dış tabaka ile iç tabaka dikin.
- 2 saatlik bir ısıtma yastığı yerleştirin hayvanlar anestezi kurtarma izin vermek. Carprofen veya buprenorfin gibi Analjezikler, ameliyat sonrası ağrı için verilebilir.
7. Temsilcisi sonuçları:
PCAG-EYFP kortikal elektroporasyon bazı örnekler, farklı zaman noktalarında sopa platin elektrot kullanılarak inşa şekil Şekil 32 de gösterilmiştir. Brain E13.5, E14.5, E15.5 electroporated ve postnatal gün (P) 6 hasat edilir. Ortaya çıkan ntibody boyama RORC 'ün 4. katmandaki ve EYFP transfekte hücreleri konumunu konumu GFP antikor boyama ile ortaya ortaya çıkarır ve her iki görüntüler dayatılan süper (Şekil 3A ve B) . Etiketli kortikal hücreler, zaman-bağımlı elektroporasyon kortikal tabaka özel GOF / LOF mümkün kılar (Şekil 32), her bir deney electroporated kortikal hücreler katmanı açıkça farklıdır.
Hücre transfeksiyon embriyolar ve verimlilik canlılığı, embriyonun yaşına ve elektroporasyon yerini bağlı olarak değişir. Örnekler Tablo 1'de listelenmiştir, ancak, koşullar sahne ve beynin bir parçası olarak her elektroporasyon için optimize edilmiş olmalıdır.
Sopa platin elektrotları ile talamus ve hipotalamus gibi derin bir doku içine Elektroporasyon genelde düşük verimlilik (Tablo 1) verir. Beynin derin bölgelerine ulaşacak whichelectrodes, mikro elektrotlar kullanarak bu sorun çözülebilir. Şekil 3, gelişmekte olan diensefalon pCAG EYFP elektroporasyon 4 gösterileri örnek. Plazmid DNA çözüm E11.5 3. ventrikül içine enjekte edilir ve mikro elektroporasyon (Şekil 3C4C) tarafından takip edilmektedir. Electroporated alan talamus sınırlıdır korteks (Şekil 3B4B) aksonlar proje. Korteks tabakası 4 Akson, projeksiyon, aynı zamanda tüm nöron fillesfills EYFP tarafından görüntülenmiştir. (Şekil 3A4A).
Şekil 1 Cartoon kılcal doğru şekli gösteren şematik. (A) cam kapiller tüp, belli bir şekli yapmak için bir mikropipet çektirmesi ile çekilir. Bir ucu 20-30 mikron yapmak için forseps sıkışmak kapalı. Ucu (kırmızı dirsek) 800 mm-1mm ölçün ve dış çapı 60 mikron (yeşil dirsek) daha az olduğundan emin olun. (B), tungsten veya platin tel Bir ucu altın kaplama pimlerin üzerine sarılmış ve parafilm ile sabittir. Daha sonra ucu 1 mm den 20-30 mikron dış çap ve 60 mm olmak için bahşiş yapmak için zımpara kağıdı kullanın. (C) Görüntü tungsten tel şekillendirme önce. (D), tungsten tel şekillendirme sonra Image. (E), ince bir kat oje uygulandıktan sonra tungsten tel Resim. E Ölçekli bar CE için 10 mikron (küçük ölçekli). (F) Stick platin elektrot (Nepa gen. CUY611P2-1). F Ölçekli bar, 2 mm.
Şekil 2 cerrahi işlemin Karikatür şema. (A), lateral ventrikül veya büyük embriyolar (sol taraf) içine ve 3. ventrikül veya küçük embriyolar (sağ tarafı) içine enjeksiyon Diyagramı . (B) platin çubuk elektrot (sol taraf) ve iğne tipi elektrot (sağ tarafı) tarafından electrporation Diyagramı.
Şekil 3 fare telencephalon geliştirilmesi E13.5 (A) E14.5 (B) ve E15.5 (C) pCAG-EYFP electroporated ve P6 hasat edildi. Brain ayrı koronal kesitli ve GFP antikor veya RORC 'ün antikor ile boyandı ve görüntüler birleştirilir. (A) E13.5 transfect birçok katman 4 nöronlar pCAG-EYFP plazmid Elektroporasyon. 4 belirteçlerinin RORC 'ün tabakası ile örtüşmektedir. Katman 4 nöronlar daha yüzeysel E14.5 transfect hücreler, (B) pCAG-EYFP plazmid Elektroporasyon. (C) E15.5 layer 2 / 3 gibi elektroporasyon etiket birçok yüzeysel nöronlar. Ölçek çubuğu 200 mm.
Şekil 4 talamo-kortikal aksonlar (TCA) içine EYFP Transfeksiyon. (A) kortikal 4. katmandaki TCA terminus GFP antikor boyama ile ortaya çıkar. RORC 'ün antikor boyama, 4 katmanlı bir pozisyon ortaya çıkarmak için kullanılır. Her iki görüntü aynı bölümde alınan ve birleştirilir. (B) talamus içine elektroporasyon konumu ifade talamus 11 sınırlıdır GFP antikor boyama ve RORC 'ün boyama, aynı zamanda gösterilir. (C) talamik elektroporasyon ve TCA projeksiyon Karikatür şematik gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 200 mm.
Discussion
Bu protokol, biz sadece, farklı şeklinde elektrotlar kullanarak küçük bir embriyonik beyin kısıtlı alana pCAG EYFP transfeksiyon tekniği yararları nitelendirdi. Transfeksiyon verimlilik karşılaştırması farklı organizatörü tarafından daha önce açıklandığı için, hücre tipi özgüllüğü 1 gösterir. Ancak, sadece geçici ve plazmid bağlıdır değişir transfeksiyon gibi tekniği, sınırlamalar vardır, herhangi bir hücreyi özgüllüğü sahip değildir ve transfekte hücrelerinin sayısını kontrol altında tutmak zordur. ThereforeHowever, bu protokolü diğer tekniklerle birleştirerek daha farklı işleme yöntemleri için olanakları sağlayacaktır. İlk olarak, plazmid DNA hücre içine özel organizatörü birleştiren, nöronlar, glial hücreler ve astrositler hücre türüne özgü transfeksiyon sağlayacaktır. İkincisi, transfeksiyon geçici olduğundan, sonraki hayatında genin fonksiyonunu analiz etmek isteyen bilim adamları için uygun değildir. Bu nedenle, plazmid DNA genom entegre olmak için bir transposase ile birlikte istikrarlı bir transfeksiyon 8 dönüştürmek . Tet-veya tet-off sistemi, evlat edinme 8 sinir hücreleri veya hücre tipine özgü gen ekspresyonu zamanlama işlemek için mümkün kılacaktır. Alternatif olarak, bu protokol tamoksifen-indüklenebilir Cre-ER (T) recombinases 9 ve muhabir fareler 10 birleştirebilirsiniz.
Dokuların Bu geniş erişilebilirlik nörobilim kullanılan deneysel tasarımları büyük ölçüde değişecektir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Bilim Programı (HFSP) (TS verilen) ve RIKEN Junior Araştırma İşbirliği Programı (JRA), MK verilen RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Lisans Programı tarafından finanse edildi (HFSP) (TS ödüllendirildi) ve RIKEN Seyirci Araştırma İşbirliği Programı (JRA, MK verilen) bu işi finanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
