Summary
Une méthode de transfert de gènes dans le cerveau de souris en développement est décrit en utilisant une méthode unique de chirurgie et la forme particulière des électrodes. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique temporellement et spatialement, ce qui aidera de nombreux neuroscientifiques à étudier le développement du cerveau.
Abstract
Afin de comprendre la fonction des gènes exprimés dans une région spécifique du cerveau en développement, y compris des molécules de signalisation et de molécules de guidage axonal, le transfert de gènes locales ou knock-out est nécessaire. Le ciblage de gènes knock-in ou knock-out dans les régions locales est possible d'effectuer avec la combinaison avec une ligne spécifique de la CRE, qui est laborieuse, coûteuse et consommatrice de temps. Par conséquent, une méthode de transfection simple, une technique d'électroporation in utero, ce qui peut être réalisé avec peu de temps, sera très pratique pour tester la fonction des gènes candidats possibles avant la génération de 1,2 animaux transgéniques. En plus de cela, électroporation in utero cibles des zones du cerveau où aucune ligne spécifique de la CRE existe, et va limiter létalité embryonnaire 3,4. Ici, nous présentons une méthode d'électroporation in utero combinant deux types différents d'électrodes pour le transfert de gène simple et pratique dans les zones cibles du cerveau en développement. Tout d'abord, une méthode unique de la tenue des embryons en utilisant un câble de fibre optique de lumière optiques fera petits embryons (de E9.5) visible pour l'injection d'ADN dans les ventricules solution ciblée et le type d'aiguille électrodes d'insertion à la zone du cerveau ciblées 5,6. La structuration du cerveau telles que l'aire corticale se produisent au stade embryonnaire précoce, par conséquent, ces électroporation début du E9.5 apporter une contribution importante pour comprendre l'événement toute structuration région. Deuxièmement, la forme précise d'un capillaire évite d'endommager l'utérus en faisant des trous par l'insertion de la capillarité. Par ailleurs, la forme précise des électrodes aiguilles sont créés avec le tungstène et un fil de platine et aiguisé en utilisant du papier de verre et isolés avec du vernis à ongles 7, une méthode qui est décrite en détail dans le présent protocole. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique dans des zones restreintes du cerveau et permettra aux petits embryons à électroporé. Cela aidera à, ouvrez une nouvelle fenêtre pour beaucoup de scientifiques qui travaillent sur la différenciation cellulaire, migration cellulaire, guidage axonal dans le stade embryonnaire très précoce. Par ailleurs, cette technique permettra aux scientifiques de transfecter l'ADN plasmidique dans les parties profondes du cerveau en développement comme le thalamus et l'hypothalamus, où pas beaucoup de lignes spécifiques à la région de la CRE existent pour gain de fonction (GOF) ou perte de fonction (LOF) analyses.
Protocol
1. Préparation de la solution capillaire et d'ADN pour l'injection
- Purifier l'ADN plasmidique avec une Maxi-prep ou méthode équivalente, et de faire une concentration finale de 2-3 pg / pl. Aliquot de 100 pg d'ADN, ajouter 10 ul de jeûne colorant vert (1% des stocks) et TE (10mM Tris Base, 1 mM EDTA, pH 8,0) et régler le volume à 100 pi de rendre la concentration d'ADN finale pour le mélange d'injection à 1 pg / ul. La concentration d'ADN plasmidique peut être changé dépend de la taille du plasmide, et aussi son efficacité de la transfection, qui doit être testé individuellement.
- Faites tourner la solution d'ADN pendant 5 minutes à 14000 RPM à température ambiante et ramasser le surnageant pour enlever tout résidu.
- Tirez un capillaire en verre des tubes de verre capillaires tubea aide d'un extracteur micropipette. Pincez la pointe avec une pince pour faire de la pointe a un diamètre de 20 à 30 um. Mesure 800 um-1 mm de la pointe et de vérifier le diamètre extérieur est inférieur à 60 um (figure 1A).
- Connectez le capillaire pour le micromanipulateur, et de remplir avec de l'huile minérale. Pour remplir le capillaire avec la solution d'ADN, immerger la pointe dans la solution et aspirer la solution d'ADN.
2. Bâton électrodes de platine
Ici nous avons utilisé des électrodes de platine bâton (Nepe gène, CUY611P2-1) dans la région pour électroporer superficielle du cerveau, telles que le cortex (Fig. 1F).
3. Préparation de la micro-électrodes
Utiliser des micro-électrodes pour une électroporation dans les parties profondes du cerveau (c'est à dire, le thalamus et l'hypothalamus) (Fig. 2B-E).
- Une extrémité du tungstène (pour les électrodes négatives) et le platine (pour les électrodes positives) fils est enroulé sur plaqué or broches et fixés avec du parafilm. Insérez le fil à la tige d'un coton-tige et enveloppez-les deux extrémités avec du parafilm (Fig. 1B).
- Uniformément affûter la pointe du fil avec du papier de verre jusqu'à ce qu'il atteigne 20 à 30 pm de diamètre externe et 60 um de 800 um-1 mm de la pointe (Fig. 1C et D).
- Appliquer une fine couche de vernis à ongles sur le fil pour l'isolation. Après le vernis à ongles a séché, utiliser un coton-tige imbibé d'acétone pour le retirer de la pointe (environ 200 um de la pointe). Important: Afin d'éviter d'endommager l'utérus de la souris, la partie à moins de 800 um-1 mm de la pointe ne devrait pas être plus de 70 m de diamètre (figure 1E).
4. Préparation de la chirurgie
- Anesthetize une souris enceintes (E9.5-E15.5). Nous démontrons l'anesthésie avec de qualité pharmaceutique du pentobarbital de sodium (Tableau II; 50 ug par gramme de poids corporel, injecter par voie intrapéritonéale et attendez 5 min). Alternatives à pentobarbital sodique comme anesthésique incluent l'injection de kétamine / xylazine ou des anesthésiques gazeux (gaz est préférable pour les procédures de courte durée). L'injection doit être fait avec attention pour éviter toute organes, sinon il fera des dommages de l'utérus ou de tuer des animaux. Lorsque IP réussie est fait, le taux de survie est supérieur à 95%. Aussi l'intervention chirurgicale peut être réalisée en plein air environnement. Avant de commencer l'opération, le test d'une absence de réponse par l'animal au pincement de leurs pieds pour confirmer l'anesthésie.
- Raser les poils de l'abdomen à l'aide d'une lame de rasoir et EtOH 50%. Préparer la peau avec une alternance des gommages bétadine et de l'alcool (70%).
- Faire une incision sur la ligne médiane abdominale avec des ciseaux fins et retirez toutes les cornes utérines attentivement sur un 37 ° C préchauffé tampon phosphate salin (PBS)-humidifié gaze de coton, qui est placé autour de la plaie. Gardez l'humidité utérus avec PBS tout le temps.
- Tenir un câble à fibres optiques flexibles entre l'index et le majeur et le placer sous la corne utérine. Nettoyer avec câble de EtOH à 70% avant l'utilisation. Aucun microscope ou loupe est nécessaire pour la visualisation. L'utérus de position entre le câble de fibre optique de lumière optique et le pouce, et pressez doucement à pousser jusqu'à l'embryon plus proche de la paroi utérine.
5. L'injection de l'ADN et l'électroporation
- Lorsque l'embryon est positionné, insérez capillaire en verre soigneusement dans le ventricule cible et d'injecter environ 1 microlitre de solution d'ADN (figure 2A).
- Pour électroporation à la partie superficielle de la brainIf utiliser avec des électrodes de platine bâton pour electoporation, placer les électrodes en dehors de l'utérus et d'appliquer suggéré impulsions rectangulaires de courant selon l'instruction de la fabrication (tableau I). Si l'électroporation usingFor à partie profonde du cerveau, l'électroporation nmicro, les électrodes de type Eedle sont utilisés. Iinsert une électrode de tungstène fines négatifs dans l'ADN injecté ventricule et une électrode de platine dans l'utérus et de la région cible de place entre deux électrodes, puis appliquer suggéré impulsions rectangulaires de courant (tableau I) (figure 2B).
6. Message électroporation
- Placez le dos corne utérine dans son origLieu inal avec et ajouter 500 uL de 37 ° C préchauffé PBS.
- Suture de la couche intérieure avec suture chirurgicale et fermer la couche externe avec un clip de 9 mm autoclipauto.
- Placez les animaux sur un coussin chauffant pendant 2 heures pour permettre la récupération de l'anesthésie. Des analgésiques tels que la buprénorphine ou de carprofène peut être administré pour les douleurs post-opératoires.
7. Les résultats représentatifs:
Quelques exemples de l'électroporation corticale du pCAG-EYFP construire en utilisant des électrodes de platine bâton à des moments différents sont représentés dans la figure Figure 32. Les cerveaux sont électroporation à E13.5, E14.5 E15.5 et, et récolté au jour postnatal (P) 6. ALa ntibody coloration du RORC révèle la position de la couche 4 et la position des cellules transfectées EYFP sont révélées par coloration d'anticorps GFP, et les deux images sont superposés (Fig. 3A et B). Étiqueté cellules corticales sont couche de cellules corticales électroporées est clairement différent dans chaque expérience (fig. 32), ce qui suggère dépendant du temps électroporation rend corticale couche spécifique GOF / LOF possible.
La viabilité des embryons et l'efficacité de la transfection des cellules varie en fonction de l'âge de l'embryon et l'emplacement de l'électroporation. Les échantillons sont répertoriés sur le tableau 1, toutefois, les conditions doivent être optimisés pour chaque électroporation selon le stade et une partie du cerveau.
L'électroporation dans un tissu profond, comme le thalamus et l'hypothalamus à l'utilisation des électrodes de platine bâton donnent souvent un faible rendement (tableau 1). Ce problème peut être résolu en utilisant des micro-électrodes whichelectrodes, qui atteindra à certaines parties profondes du cerveau. Figure 3 4 exemple montre des pCAG-EYFP électroporation dans le diencéphale développement. Solution de l'ADN plasmidique est injecté dans le ventricule 3 ème au E11.5 et suivis par des micro électroporation (fig. 3C4C). La zone est limitée par électroporation dans le thalamus, où la plupart des axones du projet vers le cortex (fig. 3B4B). Projection Axon à la couche 4 du cortex peuvent également être visualisés par EYFP, qui fillesfills le neurone entier. (Fig. 3A4A).
Figure 1. Schématiques Cartoon démontrant la bonne forme du capillaire. (A) un tube capillaire en verre est tiré aide d'un extracteur micropipette pour faire certaine forme. Un pourboire est pincé par des pinces pour faire 20-30 um. Mesure 800 um-1mm de la pointe (crochet rouge) et assurez-vous que le diamètre externe est inférieur à 60 um (support vert). (B) Une extrémité du fil de tungstène ou le platine est enroulé sur plaqué or broches et fixés avec du parafilm. Ensuite, utilisez du papier de verre pour faire leur bout de devenir 20-30 um diamètres extérieurs et 60 um de 1 mm de la pointe. (C) image du fil de tungstène avant de le façonner. (D) Image du fil de tungstène après façonnage. (E) Image du fil de tungstène après l'application fine couche de vernis à ongles. La barre d'échelle en E est de 10 um (petite échelle) pour le marquage CE. (F) électrodes de platine Stick (gène Nepa. CUY611P2-1). La barre d'échelle dans F est de 2 mm.
Schéma de la figure dessinée 2. De la procédure chirurgicale. (A) Schéma d'injection dans le ventricule latéral ou d'embryons de grande taille (côté gauche) et en 3 ème ventricule ou de petits embryons (côté droit). (B) Schéma de electrporation par électrode enrobée platine (côté gauche) et par l'aiguille électrode de type (côté droit).
Figure 3. Développer la souris a été télencéphale électroporation avec pCAG-EYFP à E13.5 (A), E14.5 (B) et E15.5 (C) et récoltés à P6. Les cerveaux ont été sectionnés coronale et colorées avec des anticorps ou d'anticorps GFP RORC séparément et les images sont fusionnées. (A) Electroporation de pCAG-EYFP plasmide au E13.5 transfecter plusieurs couche 4 neurones. qui se chevauchent avec la couche 4 marqueurs du RORC. (B) Electroporation de pCAG-EYFP plasmide au E14.5 cellules transfecter, qui sont plus superficielles que la couche 4 neurones. (C) E15.5 électroporation étiquette de nombreux neurones superficielles telles que la couche 2 / 3. La barre d'échelle 200 um.
Figure 4. Transfection de EYFP dans les axones thalamo-corticaux (TCA). (A) terminale TCA dans la couche corticale 4 est révélée par immunofluorescence la GFP. Coloration des anticorps RORC est utilisée pour révéler une position de la couche 4. Les deux images sont tirées de la même section et fusionnés. (B) Position du électroporation dans le thalamus est également démontré par immunofluorescence la GFP et la coloration du RORC, dont l'expression est restreinte au niveau du thalamus 11. (C) schéma de dessin animé pour l'électroporation thalamique et la projection TCA sont affichés. La barre d'échelle 200 um.
Discussion
Dans ce protocole, nous avons seulement décrit les avantages de la technique de la transfection pCAG-EYFP dans la zone réglementée d'un petit cerveau embryonnaire en utilisant différentes électrodes en forme. Pour la comparaison de l'efficacité de transfection par le promoteur différent est décrit précédemment, ce qui montre la spécificité de type cellule 1. Cependant, il ya des limites à la technique, telles que la transfection n'est que transitoire et varie dépendent du plasmide, il n'a pas de spécificité cellulaire et il est difficile de contrôler le nombre de cellules transfectées. ThereforeHowever, combinant ce protocole avec d'autres techniques encore offrir des possibilités de méthodes de manipulation différentes. D'abord, en intégrant promoteur cellule spécifique dans l'ADN plasmidique permettra de transfection de cellules de type particulier, comme les neurones, cellules gliales et astrocytes. Deuxièmement, puisque la transfection est transitoire, il n'est pas adapté pour les scientifiques qui veulent analyser la fonction du gène dans la vie ultérieure. Par conséquent, la combinaison avec une transposase de rendre l'ADN plasmidique s'intégrer dans le génome va le convertir en une transfection stable 8. Ensuite, l'adoption de la tet-on ou tet-off, il sera possible de manipuler le calendrier ou l'expression des gènes cellulaires spécifiques au type de cellules neurales 8. Alternativement, on peut combiner ce protocole avec le tamoxifène inductible Cre-ER (T) recombinases 9 et 10 souris journaliste.
Cette grande accessibilité des tissus va changer radicalement des modèles expérimentaux utilisés dans les neurosciences.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par l'Institut RIKEN Brain Science (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (attribué à TS) et le Programme RIKEN junior Research Associate (JRA, attribué à MK) RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (attribué à TS) et RIKEN junior Programme associé de recherche (JRA, attribué à MK) a financé ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
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